Name: characterization and functional prediction of bacteria in ovarian tissues
Uploaded: 2021-10-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Clinical Research Award of the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, China (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), Major Basic Research Project of Natural Science of Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2018JM7073, 2017ZDJC-11), det viktigste forsknings- og utviklingsprosjektet til Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), Shaanxi Provincial Collaborative Technology Innovation Project (2 017XT-026, 2018XT-002) og Det medisinske forskningsprosjektet til Xi'an Social Development Guidance Plan (2017117SF/YX011-3). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeide manuskriptet.
Vi takker kollegene ved Institutt for gynekologi ved First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University for deres bidrag til å samle inn prøver.

Denne studien ble godkjent av Medical Institutional Ethics Committee ved First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University (Nei. XJTUIAF2018LSK-139). Informert samtykke ble innhentet fra alle påmeldte pasienter.
1. Kriterier for å gå inn i kreftgruppen og kontrollgruppen
<ol><li>For kreftgruppen, registrere pasienter som primært er diagnostisert med eggstokkkreft, og etter laparotomi, de er bevist å ha serøs ovariekreft av patologiske funn.</li>
	<li>For kontrollg...

<ol>
	<li>Manfredo Vieira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans.">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li><li>Geller, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+intratumor+bacteria+in+mediating+tumor+resistance+to+the+chemotherapeutic+drug+gemcitabine.">Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine.</a> Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).</li><li>Manfredo, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans.">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li><li>Brunelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globular+structure+of+human+ovulatory+cervical+mucus.">Globular structure of human ovulatory cervical mucus.</a> FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+continuum+along+the+female+reproductive+tract+and+its+relation+to+uterine-related+diseases.">The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases.</a> Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).</li><li>Zervomanolakis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+upward+transport+in+the+human+female+genital+tract.">Physiology of upward transport in the human female genital tract.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).</li><li>Verstraelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+human+uterine+microbiome+in+non-pregnant+women+through+deep+sequencing+of+the+V1-2+region+of+the+16S+rRNA+gene.">Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene.</a> PeerJ. 4, 1602 (2016).</li><li>Fang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoded+sequencing+reveals+diverse+intrauterine+microbiomes+in+patients+suffering+with+endometrial+polyps.">Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps.</a> American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).</li><li>Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+microbiota+of+the+reproductive+tract+in+women+undergoing+a+total+hysterectomy+and+bilateral+salpingo-oopherectomy.">Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy.</a> Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).</li><li>Banerjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ovarian+cancer+oncobiome.">The ovarian cancer oncobiome.</a> Oncotarget. 8 (22), 36225-36245 (2017).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+distribution+of+bacteria+between+cancerous+and+noncancerous+ovarian+tissues+in+situ.">The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ.</a> Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+overgrowth+and+diversification+of+microbiota+in+gastric+cancer.">Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer.</a> European Journal of Gastroenterology &amp; Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).</li><li>Hosgood, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+role+of+lung+microbiota+in+lung+cancer+attributed+to+household+coal+burning+exposures.">The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).</li><li>Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+and+Functional+Differences+between+Microbiota+and+Cervical+Carcinogenesis+as+Identified+by+Shotgun+Metagenomic+Sequencing.">Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing.</a> Cancers. 11 (3), 309 (2019).</li><li>Urbaniak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Microbiota+of+Breast+Tissue+and+Its+Association+with+Breast+Cancer.">The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+and+metatranscriptomic+analysis+of+human+prostate+microbiota+from+patients+with+prostate+cancer.">Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer.</a> BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).</li><li>Walsh, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmenopause+as+a+key+factor+in+the+composition+of+the+Endometrial+Cancer+Microbiome+(ECbiome).">Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome).</a> Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).</li><li>Walther-Antonio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+contribution+of+the+uterine+microbiome+in+the+development+of+endometrial+cancer.">Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer.</a> Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).</li><li>Poore, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiome+analyses+of+blood+and+tissues+suggest+cancer+diagnostic+approach.">Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach.</a> Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Ward, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BugBase+predicts+organism-level+microbiome+phenotypes.">BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>Langille, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences.">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).</li><li>Langille, M. G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences.">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).</li><li>Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAMP:+statistical+analysis+of+taxonomic+and+functional+profiles.">STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles.</a> Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).</li><li>Leranth, C., Hamori, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Dark&amp;#34;+Purkinje+cells+of+the+cerebellar+cortex.">34;Dark&amp;#34; Purkinje cells of the cerebellar cortex.</a> Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).</li></ol>

Ovariekreft har en bemerkelsesverdig innflytelse på kvinners fruktbarhet25. De fleste eggstokkkreftpasienter diagnostiseres på sene stadier, og 5-års overlevelsesrate er mindre enn 30%18. Bekreftelse av bakterier i abdominal solid viscera, inkludert leveren, bukspyttkjertelen og milten, har blitt publisert. Eksistensen av bakterier i øvre kvinnelige reproduktive kanal oppstår fordi livmorhalsen ikke er vedlagt2,3</su...

Nylig har et økende antall artikler blitt publisert som beviser eksistensen av bakterier i abdominal solid viscera, som nyre, milt, lever og eggstokk1,2. Geller et al. fant bakterier i bukspyttkjertelsvulster, og disse bakteriene var resistente mot gemcitabine, et kjemoterapeutisk legemiddel2. S. Manfredo Vieira et al. konkluderte med at Enterococcus gallinarum var bærbart for lymfeknuter, lever og milt, og det kunne drive autoimmunitet3.
Siden livmorhalsen spiller en rolle som forsvarer, har bakterier i øvre kvinnelige reproduktive kanal, som inneholder livmor, egglederne og eggstokkene, blitt minimalt forsket på. Det er imidlertid etablert noen nye teorier de siste årene. Bakterier kan ha tilgang til livmorhulen under menstruasjonssyklusen på grunn av endringer i mucins4,5. I tillegg bekreftet Zervomanolakis et al. at livmoren, sammen med egglederne, er en peristaltisk pumpe kontrollert av eggstokkenes endokrine system, og dette arrangementet gjør det mulig for bakterier å komme inn i endometrium, egglederne og eggstokkene6.
Den øvre reproduktive kanalen er ikke lenger et mysterium takket være utviklingen av bakterielle deteksjonsmetoder. Verstraelen et al. brukte en strekkodet paired-end sekvenseringsmetode for å oppdage livmorbakterier ved å målrette mot V1-2 hypervariabel region i 16S RNA-genet7. Fang et al. ansatt strekkodet sekvensering hos pasienter med endometrial polypper og avslørte tilstedeværelsen av ulike intrauterin bakterier8. I tillegg, ved å bruke 16S RNA-genet, fant Miles et al. og Chen et al. bakterier i kjønnssystemet til kvinner som hadde gjennomgått salpingo-oophorectomy og hysterektomi, henholdsvis5,9.
Bakterier i tumorvev har fått økende oppmerksomhet de siste årene. Banerjee et al. oppdaget at mikrobiomesignaturen var forskjellig mellom eggstokkkreftpasienter og kontroller10. Etnoxynatronum sibiricum var forbundet med tumorstadium, og Methanosarcina vacuolata kan brukes til å diagnostisere eggstokkkreft11. I tillegg til eggstokkkreft har andre kreftformer, som mage, lunge, prostata, bryst, livmorhals og endometrium, vist seg å være forbundet med bakterier12,13,14,15,16,17,18. Poore et al. foreslo en ny klasse mikrobiell basert onkologidiagnostikk, forutså tidlig kreftscreening19. I denne protokollen undersøkte vi forskjellene mellom kreft og normalt eggstokkvev ved å sammenligne sammensetningen og funksjonen til bakterier i disse to vevene.
Immunhiistokjemi farging og 16S rRNA gensekvensering ble utført for å bekrefte tilstedeværelsen av bakterier i eggstokkene. Forskjellene og predikerte funksjonene til eggstokkbakteriene i kreft og ikke-kreftvev ble studert. Resultatene viste eksistensen av bakterier i eggstokkvev. Anoxynatronum sibiricum og Methanosarcina vacuolata var relatert til henholdsvis scenen og diagnosen eggstokkkreft. Førtiseks signifikant forskjellige KEGG-veier som var til stede i begge gruppene ble sammenlignet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Software</td>
			<td>Agilgent 
			United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-pro plus 7</td>
			<td>Media Cybernetics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica ASP 300S</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EG 1150</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica RM2235</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5</td>
			<td>Hycult Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>M1386-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>M4029-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silva database</td>
			<td>Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the QuantiFluor dsDNA System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>Bj&#246;rn Usadel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit</td>
			<td>Zytomed Systems</td>
			<td>HRP008DAB-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization and functional prediction of bacteria in ovarian tissues

Teorien om en "steril" kvinnelig øvre reproduktive kanal har møtt økende motstand på grunn av fremskritt innen bakteriedeteksjon. Hvorvidt eggstokkene inneholder bakterier er imidlertid ennå ikke bekreftet. Heri ble et eksperiment for å oppdage bakterier i eggstokkvev introdusert. Vi valgte eggstokkkreftpasienter i kreftgruppen og ikke-kreftpasienter i kontrollgruppen. 16S rRNA gensekvensering ble brukt til å skille bakterier i eggstokkvev fra kreft- og kontrollgruppene. Videre forutsa vi den funksjonelle sammensetningen av de identifiserte bakteriene ved hjelp av BugBase og PICRUSt. Denne metoden kan også brukes i andre viscera og vev siden mange organer har vist seg å huse bakterier de siste årene. Tilstedeværelsen av bakterier i viscera og vev kan hjelpe forskere med å evaluere kreft og normalt vev og kan være til hjelp i behandlingen av kreft.

Pasienter Totalt 16 kvalifiserte pasienter ble inkludert i studien. Kontrollgruppen inkluderte 10 kvinner med en diagnose av godartet livmor svulst (blant dem ble 3 pasienter diagnostisert med livmor myoma, og 7 pasienter ble diagnostisert med livmor adenomyose). I mellomtiden inneholdt kreftgruppen 6 kvinner med en diagnose av serøs eggstokkkreft (blant dem ble 2 pasienter diagnostisert med stadium II, og 2 av dem ble diagnostisert med stadium III). Følgende egenskaper viste ingen forskjeller mello...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues at JoVE.com

Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues

Immunhiistokjemi farging og 16S ribosomal RNA gen (16S rRNA gen) sekvensering ble utført for å oppdage og skille bakterier i kreft og ikke-kreftholdig eggstokkvev in situ. De sammensetningsmessige og funksjonelle forskjellene i bakteriene ble spådd ved å bruke BugBase og Phylogenetic Investigation of Communities ved rekonstruksjon av uobserverte stater (PICRUSt).

Karakterisering og funksjonell prediksjon av bakterier i eggstokkvev

The theory of a "sterile" female upper reproductive tract has been encountering increasing opposition due to advancements in bacterial detection. However, ...

Denne protokollen er designet for å oppdage bakterier i eggstokkvev og forutsi deres funksjoner. Immunhiistokjemi farging og 16S rRNA sekvensering, ble brukt for å oppdage og skille bakterier i kreft og ikke-kreft i eggstokkvev in situ. De komposeringsmessige og funksjonelle forskjellene i bakteriene forutsies ved å bruke BoPs og cellulær-genetisk undersøkelse av samfunn ved rekonstruksjon av uobserverte dager.Vår protokoll tar sikte på å trekke ut bakterier fra eggstokkvev in situ. Det kan også brukes til å oppdage bakterier i svulster av noe slag. De viktigste fordelene med protokollen vår er at den er enkel og praktisk, at den kan realiseres i nesten alle laboratorier.Det er også raskt å få resultatene. Under praksis i protokollen er det viktig å utelukke bakterier utenfor stedet tumorvev. Dermed må alle prosedyrer i denne protokollen være sterile.Under operasjonen, skille resected eggstokkene i omtrent en centimeter tykke vev prøver med et par nye sterile pinsett. Unngå å berøre noe annet under hele prosedyren. Etter separasjon, fjern prøven i et sterilt rør og legg den i flytende nitrogen for overføring.Bevar prøver i minus 80 grader Celsius. Fest vev ved formalin, og legg dem deretter inn ved paraffin. Denne protokollen kan settes på pause her.Vevet kan holdes i romtemperatur for lengre bevaring. For å betjene ytterligere trinn, kutt prøvene i fem mikrometer serielle seksjoner. Tørk deretter prøvene.Gjør de-parafin og rehydrering til prøvene. For å hente antigen er det nødvendig med en 10 minutters mikrobølgebehandling i EDTA-buffer. Dypp prøvene i PBS som inneholder 0,3% hydrogen.Peroksider i 20 minutter for å stoppe endogen peroksidaseaktivitet. Utfør antistoffet EMA ved LPS-kjernen, i en konsentrasjon på 1 over 300. Og opprettholde det for en natt på fire grader Celsius.For å oppdage bakteriene, bruk et DAP-substratsett for å oppdage eksistensen av HRP. Basering på produsentens instruksjoner, bruk HRP polymer, anti-kanin antistoff. Bruk bordkonsentrator for å la antistoffet kombineres fullt ut.Bruk PBS for å eliminere ukombinerte antistoffer. Gjør din kjemiske farging i henhold til produsentens instruksjoner, og skyll deretter prøvene under vann. Gjør dehydrering til prøvene.Dressprøver ved signering. Og skriv inn som et eksempel ved hjelp av imaging Pro Plus Prepare-biblioteket basert på produsentens protokoll. Øv på primermønsteret, som består av de genspesifikke sekvensene og Illumina-adapterens overhengskjernepartikler.For å forsterke fødselsratene for V4-regionen av bakterielle 16-er på rRNA-gensekvenser, må du forsterke malen fra DNA-prøveinngangen ved å bruke amplicon PCR. Bruk Mag-Bind RxNPure Plus magnetiske perler for å fjerne reaksjonsblandingen fra PCR-produktet. Utfør indeksert PCR-forsterkning for andre gang.Bruk Agilent 2200 TapeStation for å sjekke biblioteket. Bruk QuantiFluor dsDNA System for å kvantifisere biblioteket. Med en 600-syklus produserer v3 standard strømningscelle omtrent 100 000 parkoblede ender.2 ganger 300 base 3. Biblioteker er denormaliserte, grupperte og sekvenserte. Råprisene til hver prøve er filtrated på grunnlag av sekvenseringskvalitet av Trimmomatic.Både primeren og kortsekvensene bør fjernes. Sekvensen leser med både par og kvaliteter lavere enn 25 bør forkortes. Analyser 16s rRNA etter programvarepakken QIIME.Samle sekvenser for å danne OTUer med en likhetskutt på 97%For OTUer bør den relative overfloden beregnes i hver prøve. Bruk en bayesiansk klassifiserer, som er i RDP-opplæringssettet for å sortere alle sekvensene. Med gitt OTU er en klassifisering som har den største sammenhengen i sekvensene tildelt OTUer.OTUene er justert etter Silva-databasen, basert på en eksempelgruppeinformasjon. Utfør alfamangfold og den UniFrac-baserte hovedkoordinatanalysen. For å forutsi relatert presentasjon av egenskapene til bakteriene, bruk BugBase.Forutsi den funksjonelle sammensetningen av en metagenom på PICRUSt. Med bruk av overvåkingsdata og en database som inneholder referansegenomer, analyser de forskjellige funksjonene mellom hver gruppe ved hjelp av STAMP-programvare. Bruk en statistikkprogramvare til å beregne resultatet.Indikasjonen på statistisk signifikans bør settes som p mindre enn 0,05. Beregn forvirrende faktorer, som inkluderer alder og paritet, etter Studentens t-test. Beregn menopausal status, historie med hypertensjon og diabetes ved Chi-square-testen.Beregn antall eggstokkbakterier taxa ved Mann-Whitney U-testen. 16 pasienter ble inkludert i denne studien. BugBase ble brukt til å praktisere analyse av anslåtte metagenomer.Den potensielt patogenetiske og immunhiistokjemi av eggstokkene ved hjelp av antibakteriell LPS antistoff. Denne figuren viser bakteriell rikdom og mangfold i kreft- og kontrollgruppene. Avslørt av 16S rRNA-sekvensering.Tallene er observert artsindeks. Chao1-indeks, ACE-indeks, Shannon-indeks, Evenness-indeks, Simpson-indeks. Den relative overfloden av phyla og de 12 mest tallrike bakteriearter i eggstokkprøvene er vist i denne figuren.Figur A, B, C og D.Betyr den relative overfloden av panelet i eggstokkene til pasientene i kontrollgruppen og eggstokkkreftgruppen. De relative overflodene av de tolv mest tallrike bakterieartene i eggstokkene til kontrollpasientene og eggstokkkreftgruppen. Dette er commonests, gruppert ved hjelp av PCoA og den relative overflod av Anoxynatronum sibiricum og Methanosarcina vacuolata.Figur A viser de vanligste, som ble gruppert ved hjelp av PCoA. PC1 og PC2 er plottet på x og y-aksen. Den røde blokken er lik prøven i ovariekreftgruppen.Den blå sirkelen er lik et utvalg i kontrollgruppen. Prøvene fra ovariekreftgruppen kan skilles fra andre prøver i kontrollgruppen. Figur B viser commonests som ble gruppert ved hjelp av PCoA.PC1 og PC2 er plottet på x- og y-aksen. Den røde blokken er lik en prøve i ovariekreftgruppen. Den blå faste sirkelen er lik en prøve fra pasienten med livmor myoma.Og den blå hule sirkelen er lik en prøve av en pasient med livmoradenomyose. Figur C viser den relative overfloden av Anoxynatronum sibiricum. Figur D er Methanosarcina vacuolata.Dette tallet er BugBase-analysen av forventet metagenomikk. Den potensielt patogenetiske og oksidative stresstoleranse fenotypen til eggstokkene i kreftgruppen var sterkere enn kontrollgruppens. Denne figuren er betydelig forskjellig KEGG-baneplass mellom kreft- og kontrollgruppene ved PICRUSt-analyse.Når vi får prøvene våre, er det nødvendig med et par nye sterile pinsett. Vær oppmerksom på potensiell forurensning av prøvene. At bakterier utenfor stedet tumorvev kan påvirke løsningen sterkt.Det foretrekkes å sette kontrollgruppen til hvert trinn. For å redusere effekten av potensiell forurensning.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Berikelse og karakterisering av svulst immun og ikke-immune Microenvironments i etablerte subkutan Murine svulster

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Digital analyse av Immunostaining av ZW10 samspill protein i Human Lung vev

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Utarbeidelse av mitokondrier fra eggstokkene Cancer vev og kontroll eggstokkene vev for kvantitativ Proteomikk analyse

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer

Integrering av bioinformatikk tilnærminger og eksperimentelle valideringer for å forstå rollen til notch signalering i eggstokkene Cancer

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Sirkulerende tumorcellelinjer: et innovativt verktøy for grunnleggende og translasjonell forskning

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generering og dyrking av høygradig serøs eggstokkreft Pasientavledede organoider

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Kvantifisering av replikasjonsstress i eggstokkreftceller ved bruk av enkeltstrenget DNA-immunfluorescens

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualisering av DNA-skadereparasjonsproteiner i pasientavledede eggstokkreftorganoider via immunfluorescensanalyser

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...