Name: characterization and functional prediction of bacteria in ovarian tissues
Uploaded: 2021-10-23T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio de Pesquisa Clínica do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Xi'an Jiaotong, China (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), o Principal Projeto básico de Pesquisa de Ciência Natural do Departamento provincial de Ciência e Tecnologia de Shaanxi (2018JM7073, 2017ZDJC-11), o Projeto chave de Pesquisa e Desenvolvimento do Departamento de Ciência e Tecnologia Provincial de Shaanxi (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), o Projeto de Inovação tecnológica colaborativa da Província de Shaanxi (2 017XT-026, 2018XT-002) e o Projeto de Pesquisa Médica do Plano de Orientação para o Desenvolvimento Social xi'an (2017117SF/YX011-3). Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.
Agradecemos aos colegas do Departamento de Ginecologia do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Xi'an Jiaotong por suas contribuições para a coleta de amostras.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional Médica do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Xi'an Jiaotong (Nº. XJTUIAF2018LSK-139). O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes inscritos.
1. Critérios para entrar no grupo de câncer e no grupo controle
<ol><li>Para o grupo de câncer, matricule pacientes que são diagnosticados principalmente com câncer de ovário, e após a laparotomia, eles são comprovadamente com câncer de ovár...

<ol>
	<li>Manfredo Vieira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans.">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li><li>Geller, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+intratumor+bacteria+in+mediating+tumor+resistance+to+the+chemotherapeutic+drug+gemcitabine.">Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine.</a> Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).</li><li>Manfredo, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans.">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li><li>Brunelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globular+structure+of+human+ovulatory+cervical+mucus.">Globular structure of human ovulatory cervical mucus.</a> FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+continuum+along+the+female+reproductive+tract+and+its+relation+to+uterine-related+diseases.">The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases.</a> Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).</li><li>Zervomanolakis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+upward+transport+in+the+human+female+genital+tract.">Physiology of upward transport in the human female genital tract.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).</li><li>Verstraelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+human+uterine+microbiome+in+non-pregnant+women+through+deep+sequencing+of+the+V1-2+region+of+the+16S+rRNA+gene.">Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene.</a> PeerJ. 4, 1602 (2016).</li><li>Fang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoded+sequencing+reveals+diverse+intrauterine+microbiomes+in+patients+suffering+with+endometrial+polyps.">Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps.</a> American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).</li><li>Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+microbiota+of+the+reproductive+tract+in+women+undergoing+a+total+hysterectomy+and+bilateral+salpingo-oopherectomy.">Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy.</a> Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).</li><li>Banerjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ovarian+cancer+oncobiome.">The ovarian cancer oncobiome.</a> Oncotarget. 8 (22), 36225-36245 (2017).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+distribution+of+bacteria+between+cancerous+and+noncancerous+ovarian+tissues+in+situ.">The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ.</a> Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+overgrowth+and+diversification+of+microbiota+in+gastric+cancer.">Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer.</a> European Journal of Gastroenterology &amp; Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).</li><li>Hosgood, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+role+of+lung+microbiota+in+lung+cancer+attributed+to+household+coal+burning+exposures.">The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).</li><li>Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+and+Functional+Differences+between+Microbiota+and+Cervical+Carcinogenesis+as+Identified+by+Shotgun+Metagenomic+Sequencing.">Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing.</a> Cancers. 11 (3), 309 (2019).</li><li>Urbaniak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Microbiota+of+Breast+Tissue+and+Its+Association+with+Breast+Cancer.">The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+and+metatranscriptomic+analysis+of+human+prostate+microbiota+from+patients+with+prostate+cancer.">Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer.</a> BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).</li><li>Walsh, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmenopause+as+a+key+factor+in+the+composition+of+the+Endometrial+Cancer+Microbiome+(ECbiome).">Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome).</a> Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).</li><li>Walther-Antonio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+contribution+of+the+uterine+microbiome+in+the+development+of+endometrial+cancer.">Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer.</a> Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).</li><li>Poore, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiome+analyses+of+blood+and+tissues+suggest+cancer+diagnostic+approach.">Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach.</a> Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Ward, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BugBase+predicts+organism-level+microbiome+phenotypes.">BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>Langille, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences.">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).</li><li>Langille, M. G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences.">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).</li><li>Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAMP:+statistical+analysis+of+taxonomic+and+functional+profiles.">STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles.</a> Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).</li><li>Leranth, C., Hamori, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Dark&amp;#34;+Purkinje+cells+of+the+cerebellar+cortex.">34;Dark&amp;#34; Purkinje cells of the cerebellar cortex.</a> Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).</li></ol>

O câncer de ovário tem uma influência notável na fertilidade das mulheres25. A maioria dos pacientes com câncer de ovário é diagnosticada em estágios tardios, e a taxa de sobrevivência de 5 anos é inferior a 30%18. Foi publicada a confirmação de bactérias nas vísceras sólidas abdominais, incluindo fígado, pâncreas e baço. A existência de bactérias no trato reprodutivo feminino superior ocorre porque o colo uterino não está fechado2,</...

Recentemente, foram publicados um número crescente de artigos que comprovam a existência de bactérias em vísceras sólidas abdominais, como rim, baço, fígado e ovário1,2. Geller et al. encontraram bactérias em tumores pancreáticos, e essas bactérias eram resistentes à gemcitabina, uma droga quimioterápica2. S. Manfredo Vieira et al. concluíram que Enterococcus gallinarum era portátil para os linfonodos, fígado e baço, e poderia conduzir autoimunidade3.
Como o colo do útero desempenha um papel como defensor, bactérias no trato reprodutivo feminino superior, que contém o útero, tubos de falópio e ovários, têm sido minimamente pesquisadas. No entanto, algumas novas teorias foram estabelecidas nos últimos anos. As bactérias podem ter acesso à cavidade uterina durante o ciclo menstrual devido a alterações nas mucinas4,5. Além disso, Zervomanolakis et al. confirmaram que o útero, juntamente com os tubos de falópio, é uma bomba peristáltica controlada pelo sistema endócrino dos ovários, e esse arranjo permite que as bactérias entrem no endométrio, tubos de falópio e ovários6.
O trato reprodutivo superior não é mais um mistério graças ao desenvolvimento de métodos de detecção bacteriana. Verstraelen et al. usaram um método de sequenciamento de ponta emparelhado em código de barras para descobrir bactérias uterinas mirando na região hipervariável V1-2 do gene RNA16S 7. Fang et al. utilizaram sequenciamento de código de barras em pacientes com pólipos endometrial e revelaram a presença de diversas bactérias intrauterinas8. Além disso, usando o gene RNA 16S, Miles et al. e Chen et al. encontraram bactérias no sistema genital de mulheres que haviam sido submetidas à salpingo-oofrectomia e histerectomia,respectivamente 5,9.
Bactérias nos tecidos tumorais têm ganhado cada vez mais atenção nos últimos anos. Banerjee et al. descobriram que a assinatura do microbioma diferia entre pacientes com câncer de ovário e controles10. Umsibiricum noxynatronum foi associado ao estágio tumoral, e a valcuolata de metanoossarcina pode ser usada para diagnosticar câncer de ovário11. Além do câncer de ovário, outros cânceres, como estômago, pulmão, próstata, mama, colo do útero e endométrio, têm sido comprovados associados às bactérias12,13,14,15,16,17,18. Poore et al. propuseram uma nova classe de diagnósticos oncológicos baseados em microbianos, prevendo o rastreamento precoce do câncer19. Neste protocolo, investigamos as diferenças entre os tecidos cancerígenos e o ovário normal, comparando a composição e função das bactérias nesses dois tecidos.
A coloração imunohistoquímica e o sequenciamento genético de rRNA 16S foram realizados para confirmar a presença de bactérias nos ovários. As diferenças e as funções previstas das bactérias ovarianas nos tecidos ovarianos cancerosos e noncancerosos foram estudadas. Os resultados mostraram a existência de bactérias nos tecidos ovarianos. Anoxynatronum sibiricum e Methanosarcina vacuolata estavam relacionados ao estágio e ao diagnóstico de câncer de ovário, respectivamente. Foram comparadas 46 vias KEGG significativamente diferentes que estavam presentes em ambos os grupos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Software</td>
			<td>Agilgent 
			United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-pro plus 7</td>
			<td>Media Cybernetics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica ASP 300S</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EG 1150</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica RM2235</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5</td>
			<td>Hycult Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>M1386-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>M4029-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silva database</td>
			<td>Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the QuantiFluor dsDNA System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>Bj&#246;rn Usadel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit</td>
			<td>Zytomed Systems</td>
			<td>HRP008DAB-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization and functional prediction of bacteria in ovarian tissues

A teoria de um trato reprodutivo superior feminino "estéril" vem encontrando crescente oposição devido aos avanços na detecção bacteriana. No entanto, ainda não foi confirmado se os ovários contêm bactérias. Aqui, um experimento para detectar bactérias em tecidos ovarianos foi introduzido. Escolhemos pacientes com câncer de ovário no grupo de câncer e pacientes não cancerígenos no grupo controle. O sequenciamento genético rRNA 16S foi usado para diferenciar bactérias em tecidos ovarianos dos grupos de câncer e controle. Além disso, previmos a composição funcional das bactérias identificadas usando BugBase e PICRUSt. Este método também pode ser usado em outras vísceras e tecidos, uma vez que muitos órgãos têm sido comprovados para abrigar bactérias nos últimos anos. A presença de bactérias em vísceras e tecidos pode ajudar os cientistas a avaliar tecidos cancerígenos e normais e pode ser ajuda no tratamento do câncer.

Pacientes No estudo, foram incluídos 16 pacientes qualificados. O grupo controle incluiu 10 mulheres com diagnóstico de tumor uterino benigno (entre elas, 3 pacientes foram diagnosticados com moma uterino, e 7 pacientes foram diagnosticados com adenomiatona uterina). Enquanto isso, o grupo de câncer continha 6 mulheres com diagnóstico de câncer de ovário sérico (entre elas, 2 pacientes foram diagnosticados com estágio II, sendo que 2 delas foram diagnosticadas com estágio III). As seguintes c...

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Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues

A coloração imunohistoquímica e o sequenciamento do gene RNA ribossômico 16S (gene 16S rRNA) foram realizados a fim de descobrir e distinguir bactérias em tecidos ovarianos cancerígenos e não cancerígenos in situ. As diferenças composicionais e funcionais das bactérias foram previstas pelo uso do BugBase e da Investigação Filogenética das Comunidades por Reconstrução de Estados Não Observados (PICRUSt).

Caracterização e Previsão Funcional de Bactérias em Tecidos Ovarianos

The theory of a "sterile" female upper reproductive tract has been encountering increasing opposition due to advancements in bacterial detection. However, ...

Este protocolo é projetado para descobrir bactérias em tecidos ovarianos e prever suas funções. A coloração imunohistoquímica e o sequenciamento de rRNA 16S foram usados para descobrir e distinguir bactérias em tecidos ovarianos cancerígenos e não cancerosos in situ. A compensação e as diferenças funcionais das bactérias são previstas pelo uso de BoPs e investigação celular-genética das comunidades por meio da reconstrução de dias não observados.Nosso protocolo visa extrair bactérias de tecidos ovarianos in situ. Também pode ser usado para descobrir bactérias em tumores de qualquer tipo. As principais vantagens do nosso protocolo são que é fácil e conveniente, que pode ser realizado em quase todos os laboratórios.Também é rápido obter os resultados. Durante a prática no protocolo, é importante excluir qualquer bactéria fora do local tecidos tumorais. Assim, todos os procedimentos neste protocolo precisam ser estéreis.Durante a cirurgia, separam os ovários ressecados em amostras de tecido de aproximadamente um centímetro de espessura com um par de novas pinças estéreis. Evite tocar em qualquer outra coisa durante todo o procedimento. Após a separação, remova a amostra em um tubo estéril e coloque-a em nitrogênio líquido para transmissão.Preservar amostras em menos 80 graus Celsius. Fixar tecidos por formalina, e depois incorporá-los por parafina. Este protocolo pode ser pausado aqui.Os tecidos podem ser mantidos em temperatura ambiente para maior preservação. Para operar outras etapas, corte as amostras em cinco seções de série de micrômetros. Então, seque as amostras.Faça de parafina e reidratação para as amostras. Para recuperar o antígeno, é necessário um tratamento de micro-ondas de 10 minutos no buffer EDTA. Mergulhe as amostras em PBS que contém 0,3% de hidrogênio.Peroxidize por 20 minutos para parar a atividade peroxidase endógena. Realize o anticorpo EMA no núcleo LPS, com uma concentração de 1 sobre 300. E mantê-lo por uma noite a quatro graus Celsius.Para descobrir as bactérias, empregue um kit de substrato DAP para detectar a existência de HRP. Baseando-se nas instruções do fabricante, use polímero HRP, anticorpo anti-coelho. Use o concentrador de mesa para deixar o anticorpo totalmente combinado.Use PBS para eliminar anticorpos não combinados. Faça sua coloração química de acordo com as instruções do fabricante e depois lave as amostras debaixo d'água. Faça desidratação nas amostras.Terno amostras assinando. E insira como uma amostra usando a imagem Pro Plus Prepare biblioteca com base no protocolo do fabricante. Pratique o padrão primer, que consiste nas sequências específicas do gene e nas sequências de nucleotídeos de saliência do adaptador de Illumina.Para amplificar as taxas de natalidade para a região V4 de 16 bactérias em sequências genéticas rRNA, amplifique o modelo da entrada da amostra de DNA usando amplicon PCR. Use contas magnéticas Mag-Bind RxNPure Plus para remover a mistura de reação do produto PCR. Realize a amplificação pcr indexada pela segunda vez.Use o Agilent 2200 TapeStation para verificar a biblioteca. Use o sistema DSDNA QuantiFluor para quantificar a biblioteca. Com um ciclo de 600, a célula de fluxo padrão V3 produz aproximadamente 100.000 extremidades emparelhadas.2 vezes 300 base 3. Bibliotecas são desnormalizadas, agrupadas e sequenciadas. As taxas brutas de cada amostra são filtradas com base na qualidade de sequenciamento pela Trimmomatic.As sequências de primer e adaptador devem ser removidas. Leituras de sequência com par e qualidades inferiores a 25 devem ser encurtadas. Analise o rRNA 16s pelo pacote de software QIIME.Reúna sequências para formar OTUs com um corte de similaridade em 97% Para os OTUs, a abundância relativa deve ser calculada em cada amostra. Empregue um classificador bayesiano, que está no conjunto de treinamento RDP para classificar todas as sequências. Com dado OTU, uma classificação que tem a maior coerência das sequências é atribuída às OTUs.As OTUs estão alinhadas ao banco de dados de Silva, baseando-se em informações de grupo amostral. Realize a diversidade alfa e a análise principal de coordenadas baseada na UniFrac. Para prever a apresentação das características das bactérias, use o BugBase.Prever a composição funcional de um metagenome no PICRUSt. Com o uso de dados de monitoramento e um banco de dados contendo genomas de referência, analise as diferentes funções entre cada grupo com a ajuda do software STAMP. Use um software estatístico para calcular o resultado.A indicação de significância estatística deve ser definida como p inferior a 0,05. Calcular fatores de confusão, que incluem idade e paridade, pelo teste t do Aluno. Calcule o estado da menopausa, histórico de hipertensão e diabetes pelo teste qui-quadrado.Calcule o número de taxas de bactérias do ovário pelo teste mann-whitney u. 16 pacientes foram inscritos neste estudo. BugBase foi usado para praticar análises de metagenomes previstos.A potencialmente patogenética e imunohistoquímica dos ovários usando anticorpo LPS antibacteriano. Este número mostra riqueza bacteriana e diversidade nos grupos de câncer e controle. Revelado pelo sequenciamento de rRNA 16S.Os números são de índice de espécies observados. Índice Chao1, índice ACE, Índice Shannon, Índice de Evenness, Índice Simpson, respectivamente. A abundância relativa de filos e as 12 espécies bacterianas mais abundantes nas amostras ovarianas é mostrada nesta figura.Figura A, B, C e D.Significa a abundância relativa do painel nos ovários dos pacientes do grupo controle e do grupo de câncer de ovário. As abundâncias relativas das doze espécies de bactérias mais abundantes nos ovários dos pacientes de controle e do grupo de câncer de ovário. Este é o mais comum, agrupado usando PCoA e a abundância relativa de Anoxynatronum sibiricum e Methanosarcina vacuolata.A Figura A mostra os mais comuns, que foram agrupados usando PCoA. PC1 e PC2 são plotados em x e no eixo y. O bloco vermelho é igual à amostra do grupo de câncer de ovário.O círculo azul é igual a uma amostra no grupo de controle. As amostras do grupo de câncer de ovário podem ser separadas de outras amostras do grupo controle. A Figura B mostra os mais comuns que foram agrupados usando PCoA.PC1 e PC2 são plotados no eixo x e y. O bloco vermelho é igual a uma amostra no grupo de câncer de ovário. O círculo azul sólido é igual a uma amostra do paciente com mioma uterino.E o círculo oco azul é igual a uma amostra de um paciente com adenomiose uterina. A Figura C mostra a abundância relativa de Anoxynatronum sibiricum. A figura D é a tumocina vacuolata.Este número é a análise bugbase da metagenômica prevista. O fenótipo potencialmente patogenético e oxidativo de tolerância ao estresse dos ovários no grupo do câncer foi mais forte do que o do grupo controle. Este número é significativamente diferente do espaço de caminho KEGG entre os grupos de câncer e controle pela análise PICRUSt.Quando tivermos nossas amostras, um par de novas pinças estéreis são necessárias. Preste atenção à contaminação potencial das amostras. Que as bactérias fora do local podem afetar muito a resolução.Definir o grupo de controle para cada etapa é preferível. A fim de reduzir o efeito da contaminação potencial.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune Tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Pesquisa do câncer

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Análise digital de imunocoloração da proteína ZW10 interagindo em tecidos pulmonares humanos

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Preparação das mitocôndrias dos tecidos do câncer de ovário e controle dos tecidos ovarianos para análise quantitativa proteômica

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer

Integração de abordagens de bioinformática e validações experimentais para entender o papel da sinalização de notch no câncer de ovário

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Linhas celulares tumorais circulantes: uma ferramenta inovadora para pesquisa fundamental e translacional

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Geração e Cultivo de Organoides Derivados de Pacientes com Câncer de Ovário Seroso de Alto Grau

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Quantificando o estresse de replicação em células de câncer de ovário usando imunofluorescência de DNA de fita simples

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizando proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados do paciente por meio de ensaios de imunofluorescência

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...