Name: characterization and functional prediction of bacteria in ovarian tissues
Uploaded: 2021-10-23T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Premio de Investigación Clínica del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Xi'an Jiaotong, China (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), el Proyecto Principal de Investigación Básica de Ciencias Naturales del Departamento Provincial de Ciencia y Tecnología de Shaanxi (2018JM7073, 2017ZDJC-11), el Proyecto Clave de Investigación y Desarrollo del Departamento Provincial de Ciencia y Tecnología de Shaanxi (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), el Proyecto Provincial de Innovación Tecnológica Colaborativa de Shaanxi (2 017XT-026, 2018XT-002), y el Proyecto de Investigación Médica del Plan de Orientación para el Desarrollo Social de Xi'an (2017117SF/YX011-3). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Agradecemos a los colegas del Departamento de Ginecología del Primer Hospital Afiliado de la Universidad xi'an Jiaotong por sus contribuciones a la recolección de muestras.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional Médica del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Xi'an Jiaotong (No. XJTUIAF2018LSK-139). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes inscritos.
1. Criterios para ingresar al grupo de cáncer y al grupo de control
<ol><li>Para el grupo de cáncer, inscriba a pacientes que son diagnosticadas principalmente con cáncer de ovario, y después de la laparotomía, se demuestra que tienen cánce...

<ol>
	<li>Manfredo Vieira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans.">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li><li>Geller, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+intratumor+bacteria+in+mediating+tumor+resistance+to+the+chemotherapeutic+drug+gemcitabine.">Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine.</a> Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).</li><li>Manfredo, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans.">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li><li>Brunelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globular+structure+of+human+ovulatory+cervical+mucus.">Globular structure of human ovulatory cervical mucus.</a> FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+continuum+along+the+female+reproductive+tract+and+its+relation+to+uterine-related+diseases.">The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases.</a> Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).</li><li>Zervomanolakis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+upward+transport+in+the+human+female+genital+tract.">Physiology of upward transport in the human female genital tract.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).</li><li>Verstraelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+human+uterine+microbiome+in+non-pregnant+women+through+deep+sequencing+of+the+V1-2+region+of+the+16S+rRNA+gene.">Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene.</a> PeerJ. 4, 1602 (2016).</li><li>Fang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoded+sequencing+reveals+diverse+intrauterine+microbiomes+in+patients+suffering+with+endometrial+polyps.">Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps.</a> American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).</li><li>Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+microbiota+of+the+reproductive+tract+in+women+undergoing+a+total+hysterectomy+and+bilateral+salpingo-oopherectomy.">Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy.</a> Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).</li><li>Banerjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ovarian+cancer+oncobiome.">The ovarian cancer oncobiome.</a> Oncotarget. 8 (22), 36225-36245 (2017).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+distribution+of+bacteria+between+cancerous+and+noncancerous+ovarian+tissues+in+situ.">The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ.</a> Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+overgrowth+and+diversification+of+microbiota+in+gastric+cancer.">Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer.</a> European Journal of Gastroenterology &amp; Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).</li><li>Hosgood, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+role+of+lung+microbiota+in+lung+cancer+attributed+to+household+coal+burning+exposures.">The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).</li><li>Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+and+Functional+Differences+between+Microbiota+and+Cervical+Carcinogenesis+as+Identified+by+Shotgun+Metagenomic+Sequencing.">Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing.</a> Cancers. 11 (3), 309 (2019).</li><li>Urbaniak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Microbiota+of+Breast+Tissue+and+Its+Association+with+Breast+Cancer.">The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+and+metatranscriptomic+analysis+of+human+prostate+microbiota+from+patients+with+prostate+cancer.">Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer.</a> BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).</li><li>Walsh, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmenopause+as+a+key+factor+in+the+composition+of+the+Endometrial+Cancer+Microbiome+(ECbiome).">Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome).</a> Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).</li><li>Walther-Antonio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+contribution+of+the+uterine+microbiome+in+the+development+of+endometrial+cancer.">Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer.</a> Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).</li><li>Poore, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiome+analyses+of+blood+and+tissues+suggest+cancer+diagnostic+approach.">Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach.</a> Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Ward, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BugBase+predicts+organism-level+microbiome+phenotypes.">BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>Langille, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences.">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).</li><li>Langille, M. G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences.">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).</li><li>Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAMP:+statistical+analysis+of+taxonomic+and+functional+profiles.">STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles.</a> Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).</li><li>Leranth, C., Hamori, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Dark&amp;#34;+Purkinje+cells+of+the+cerebellar+cortex.">34;Dark&amp;#34; Purkinje cells of the cerebellar cortex.</a> Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).</li></ol>

El cáncer de ovario tiene una influencia notable en la fertilidad de las mujeres25. La mayoría de las pacientes con cáncer de ovario se diagnostican en etapas tardías, y la tasa de supervivencia a 5 años es inferior al 30%18. Se ha publicado la confirmación de bacterias en las vísceras sólidas abdominales, incluyendo el hígado, el páncreas y el bazo. La existencia de bacterias en el tracto reproductivo femenino superior se produce porque el cuello uterino no está...

Recientemente, se ha publicado un número creciente de artículos que prueban la existencia de bacterias en las vísceras sólidas abdominales, como el riñón, el bazo, el hígado y el ovario1,2. Geller et al. encontraron bacterias en tumores pancreáticos, y estas bacterias eran resistentes a la gemcitabina, un fármaco quimioterapéutico2. S. Manfredo Vieira et al. concluyeron que Enterococcus gallinarum era portátil a los ganglios linfáticos, hígado y bazo, y podía conducir a la autoinmunidad3.
Dado que el cuello uterino desempeña un papel como defensor, las bacterias en el tracto reproductivo femenino superior, que contiene el útero, las trompas de Falopio y los ovarios, se han investigado mínimamente. Sin embargo, algunas nuevas teorías se han establecido en los últimos años. Las bacterias pueden tener acceso a la cavidad uterina durante el ciclo menstrual debido a cambios en las mucinas4,5. Además, Zervomanolakis et al. confirmaron que el útero, junto con las trompas de Falopio, es una bomba peristáltica controlada por el sistema endocrino de los ovarios, y esta disposición permite que las bacterias ingresen al endometrio, las trompas de Falopio y los ovarios6.
El tracto reproductivo superior ya no es un misterio gracias al desarrollo de métodos de detección bacteriana. Verstraelen et al. utilizaron un método de secuenciación de extremo pareado con código de barras para descubrir bacterias uterinas dirigiéndose a la región hipervariable V1-2 del gen 16SRNA 7. Fang et al. emplearon la secuenciación con código de barras en pacientes con pólipos endometriales y revelaron la presencia de diversas bacterias intrauterinas8. Además, mediante el uso del gen arn 16S, Miles et al. y Chen et al. encontraron bacterias en el sistema genital de mujeres que se habían sometido a salpingoooforectomía e histerectomía, respectivamente5,9.
Las bacterias en los tejidos tumorales han ganado cada vez más atención en los últimos años. Banerjee et al. descubrieron que la firma del microbioma difería entre las pacientes con cáncer de ovario y los controles10. Unnoxynatronum sibiricum se asoció con el estadio tumoral, y Methanosarcina vacuolata podría usarse para diagnosticar el cáncer de ovario11. Además del cáncer de ovario, se ha demostrado que otros cánceres, como el de estómago, pulmón, próstata, mama, cuello uterino y endometrio, están asociados con las bacterias12,13,14,15,16,17,18. Poore et al. propusieron una nueva clase de diagnósticos oncológicos basados en microbios, previendo el cribado del cáncer en etapa temprana19. En este protocolo, investigamos las diferencias entre los tejidos ováricos cancerosos y normales comparando la composición y función de las bacterias en estos dos tejidos.
Se realizó tinción inmunohistoquímica y secuenciación del gen 16S rRNA para confirmar la presencia de bacterias en los ovarios. Se estudiaron las diferencias y las funciones predichas de las bacterias ováricas en los tejidos ováricos cancerosos y no cancerosos. Los resultados mostraron la existencia de bacterias en los tejidos ováricos. Anoxynatronum sibiricum y Methanosarcina vacuolata se relacionaron con el estadio y el diagnóstico de cáncer de ovario, respectivamente. Se compararon cuarenta y seis vías kegg significativamente diferentes que estaban presentes en ambos grupos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Software</td>
			<td>Agilgent 
			United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-pro plus 7</td>
			<td>Media Cybernetics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica ASP 300S</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EG 1150</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica RM2235</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5</td>
			<td>Hycult Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>M1386-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>M4029-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silva database</td>
			<td>Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the QuantiFluor dsDNA System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>Bj&#246;rn Usadel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit</td>
			<td>Zytomed Systems</td>
			<td>HRP008DAB-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization and functional prediction of bacteria in ovarian tissues

La teoría de un tracto reproductivo superior femenino "estéril" ha estado encontrando una creciente oposición debido a los avances en la detección bacteriana. Sin embargo, aún no se ha confirmado si los ovarios contienen bacterias. Aquí, se introdujo un experimento para detectar bacterias en los tejidos ováricos. Elegimos pacientes con cáncer de ovario en el grupo de cáncer y pacientes no cancerosas en el grupo de control. La secuenciación del gen 16S rRNA se utilizó para diferenciar las bacterias en los tejidos ováricos de los grupos de cáncer y control. Además, predijimos la composición funcional de las bacterias identificadas mediante el uso de BugBase y PICRUSt. Este método también se puede utilizar en otras vísceras y tejidos, ya que se ha demostrado que muchos órganos albergan bacterias en los últimos años. La presencia de bacterias en las vísceras y los tejidos puede ayudar a los científicos a evaluar los tejidos cancerosos y normales y puede ser de ayuda en el tratamiento del cáncer.

Pacientes Un total de 16 pacientes calificados fueron incluidos en el estudio. El grupo de control incluyó a 10 mujeres con un diagnóstico de tumor uterino benigno (entre ellas, 3 pacientes fueron diagnosticadas con mioma uterino y 7 pacientes fueron diagnosticadas con adenomiosis uterina). Mientras tanto, el grupo de cáncer contenía 6 mujeres con un diagnóstico de cáncer de ovario seroso (entre ellas, 2 pacientes fueron diagnosticadas con estadio II, y 2 de ellas fueron diagnosticadas con estad...

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Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues

Se realizó la tinción inmunohistoquímica y la secuenciación del gen arn ribosómico 16S (gen 16S rRNA) con el fin de descubrir y distinguir bacterias en tejidos ováricos cancerosos y no cancerosos in situ. Las diferencias composicionales y funcionales de las bacterias se predijeron mediante el uso de BugBase y Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unbserved States (PICRUSt).

Caracterización y predicción funcional de bacterias en tejidos ováricos

The theory of a "sterile" female upper reproductive tract has been encountering increasing opposition due to advancements in bacterial detection. However, ...

Este protocolo está diseñado para descubrir bacterias en los tejidos ováricos y predecir sus funciones. La tinción inmunohistoquímica y la secuenciación del ARNr 16S, se utilizaron con el fin de descubrir y distinguir bacterias en tejidos ováricos cancerosos y no cancerosos in situ. Las diferencias compensatorias y funcionales de las bacterias se predicen mediante el uso de BoPs y la investigación genético-celular de las comunidades mediante la reconstrucción de días no servidos.Nuestro protocolo tiene como objetivo extraer bacterias de los tejidos ováricos in situ. También se puede utilizar para descubrir bacterias en tumores de cualquier tipo. Las principales ventajas de nuestro protocolo son que es fácil y conveniente, que se puede realizar en casi todos los laboratorios.También es rápido obtener los resultados. Durante la práctica en el protocolo, es importante excluir cualquier bacteria fuera del sitio de los tejidos tumorales. Por lo tanto, todos los procedimientos en este protocolo deben ser estériles.Durante la cirugía, separe los ovarios resecados en muestras de tejido de aproximadamente un centímetro de grosor con un par de pinzas estériles nuevas. Evite tocar cualquier otra cosa durante todo el procedimiento. Después de la separación, retire la muestra en un tubo estéril y colóquela en nitrógeno líquido para su transmisión.Conservar las muestras en menos 80 grados centígrados. Fije los tejidos con formalina y luego incorpóselos con parafina. Este protocolo se puede pausar aquí.Los tejidos se pueden mantener a temperatura ambiente para una conservación más larga. Para operar pasos adicionales, corte las muestras en secciones seriales de cinco micrómetros. Luego, seque las muestras.Hacer desparafina y rehidratación a las muestras. Para recuperar el antígeno, se necesita un tratamiento de microondas de 10 minutos en tampón EDTA. Sumerja las muestras en PBS que contiene 0.3% de hidrógeno.Peroxidar durante 20 minutos para detener la actividad endógena de la peroxidasa. Realizar el anticuerpo EMA en el núcleo LPS, a una concentración de 1 sobre 300. Y mantenerlo durante una noche a cuatro grados centígrados.Para descubrir la bacteria, emplee un kit de sustrato DAP para detectar la existencia de HRP. Basándose en las instrucciones del fabricante, use polímero HRP, anticuerpo anti-conejo. Use el concentrador de mesa para dejar que los anticuerpos se combinen completamente.Use PBS para eliminar anticuerpos no peinados. Haga su tinción química de acuerdo con las instrucciones del fabricante, luego enjuague las muestras bajo el agua. Hacer deshidratación a las muestras.Muestras de trajes mediante firma. E ingrese como muestra utilizando la biblioteca Imaging Pro Plus Prepare según el protocolo del fabricante. Practique el patrón de imprimación, que consiste en las secuencias específicas del gen y las secuencias de nucleótidos salientes del adaptador illumina.Para amplificar las tasas de natalidad de la región V4 de bacterias 16s en secuencias de genes de ARNr, amplifique la plantilla a partir de la entrada de muestra de ADN mediante el uso de PCR de amplicón. Utilice perlas magnéticas Mag-Bind RxNPure Plus para eliminar la mezcla de reacción del producto de PCR. Realizar amplificación por PCR indexada por segunda vez.Utilice Agilent 2200 TapeStation para comprobar la biblioteca. Utilice el sistema QuantiFluor dsDNA para cuantificar la biblioteca. Con un ciclo de 600, la celda de flujo estándar v3 produce aproximadamente 100, 000 extremos emparejados.2 veces 300 base 3. Las bibliotecas se desnormalizan, agrupan y secuencian. Las tasas brutas de cada muestra se filtran sobre la base de la calidad de secuenciación por Trimmomatic.Las secuencias de imprimación y adaptador deben eliminarse. Las lecturas de secuencia con par y cualidades inferiores a 25 deben acortarse. Analizar el ARNr de 16s mediante el paquete de software QIIME.Reúna secuencias para formar OTU con un límite de similitud del 97% Para las OTU, la abundancia relativa debe calcularse en cada muestra. Emplee un clasificador bayesiano, que se encuentra en el conjunto de entrenamiento RDP para ordenar todas las secuencias. Con la OTU dada, se asigna a las OTU una clasificación que tiene la mayor coherencia de las secuencias.Las OTU están alineadas con la base de datos Silva, basándose en una información de grupo de muestra. Realizar la diversidad alfa y el análisis de coordenadas principales basado en UniFrac. Para predecir la presentación relacionada de las características de la bacteria utilice BugBase.Predecir la composición funcional de un metagenoma en PICRUSt. Con el uso de datos de monitoreo y una base de datos que contiene genomas de referencia, analice las diferentes funciones entre cada grupo con la ayuda del software STAMP. Utilice un software estadístico para calcular el resultado.La indicación de significación estadística debe establecerse como p menor que 0,05. Calcule los factores de confusión, que incluyen la edad y la paridad, mediante la prueba t de Student. Calcular el estado menopáusica, los antecedentes de hipertensión y diabetes mediante la prueba de Chi cuadrado.Calcule el número de taxones de bacterias ováricos mediante la prueba U de Mann-Whitney. 16 pacientes se inscribieron en este estudio. BugBase se utilizó para practicar el análisis de metagnomos predichos.La potencialmente patogenicidad e inmunohistoquímica de los ovarios utilizando anticuerpos antibacterianos LPS. Esta figura muestra la riqueza bacteriana y la diversidad en los grupos de cáncer y control. Revelado por secuenciación de ARNr 16S.Las cifras son el índice de especies observadas. Índice Chao1, índice ACE, índice shannon, índice Evenness, índice Simpson, respectivamente. La abundancia relativa de phyla y las 12 especies bacterianas más abundantes en las muestras ováricas se muestra en esta figura.Figura A, B, C y D.Significa la abundancia relativa del panel en los ovarios de las pacientes del grupo control y del grupo de cáncer de ovario. Las abundancias relativas de las doce especies de bacterias más abundantes en los ovarios de las pacientes de control y del grupo de cáncer de ovario. Esto es más común, agrupado usando PCoA y la abundancia relativa de Anoxynatronum sibiricum y Methanosarcina vacuolata.La Figura A muestra los más comunes, que se agruparon utilizando PCoA. PC1 y PC2 se trazan en x y el eje y. El bloque rojo es igual a la muestra en el grupo de cáncer de ovario.El círculo azul es igual a una muestra en el grupo de control. Las muestras del grupo de cáncer de ovario se pueden separar de otras muestras del grupo de control. La Figura B muestra los más comunes que se agruparon utilizando PCoA.PC1 y PC2 se trazan en los ejes x e y. El bloque rojo es igual a una muestra en el grupo de cáncer de ovario. El círculo sólido azul es igual a una muestra de la paciente con mioma uterino.Y el círculo hueco azul es igual a una muestra de una paciente con adenomiosis uterina. La Figura C muestra la abundancia relativa de Anoxynatronum sibiricum. La figura D es Methanosarcina vacuolata.Esta figura es el análisis de BugBase de la metagenómica predicha. El fenotipo potencialmente patogénico y de tolerancia al estrés oxidativo de los ovarios en el grupo de cáncer fue más fuerte que el del grupo de control. Esta cifra es significativamente diferente del espacio de la ruta KEGG entre los grupos de cáncer y control según el análisis PICRUSt.Cuando obtenemos nuestras muestras, se necesita un par de pinzas estériles nuevas. Preste atención a la posible contaminación de las muestras. Que las bacterias fuera del sitio de los tejidos tumorales pueden afectar la resolución en gran medida.Se prefiere establecer el grupo de control en cada paso. Con el fin de reducir el efecto de la contaminación potencial.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Enriquecimiento y caracterización de los microambientes Tumor inmunes y no inmunes en tumores murinos subcutáneos establecidos

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

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Análisis digital de inmunomanchado de ZW10 Interacción de proteínas en tejidos pulmonares humanos

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

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Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Líneas celulares tumorales circulantes: una herramienta innovadora para la investigación fundamental y traslacional

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generación y cultivo de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Cuantificación del estrés de replicación en células de cáncer de ovario mediante inmunofluorescencia de ADN monocatenario

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualización de proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes a través de ensayos de inmunofluorescencia

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...