Name: characterization and functional prediction of bacteria in ovarian tissues
Uploaded: 2021-10-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Xi'an Jiaotong Üniversitesi'nin İlk Bağlı Hastanesi Klinik Araştırma Ödülü (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), Shaanxi İl Bilim ve Teknoloji Bölümü Doğa Bilimi Ana Temel Araştırma Projesi (2018JM7073, 2017ZDJC-11), Shaanxi İl Bilim ve Teknoloji Bölümü'nün Önemli Araştırma ve Geliştirme Projesi (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), Shaanxi İl İşbirlikçi Teknoloji İnovasyon Projesi (2 017XT-026, 2018XT-002) ve Xi'an Sosyal Gelişim Rehberlik Planı Tıbbi Araştırma Projesi (2017117SF/YX011-3). Fon sağlayıcılar çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rol oynamamışlardır.
Xi'an Jiaotong Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi Jinekoloji Bölümü'ndeki meslektaşlarımıza numunelerin toplanmasına katkılarından dolayı teşekkür ederiz.

Bu çalışma Xi'an Jiaotong Üniversitesi birinci bağlı hastanesinin Tıbbi Kurumsal Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (Hayır. XJTUIAF2018LSK-139). Kayıtlı tüm hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı.
1. Kanser grubuna ve kontrol grubuna girme kriterleri
<ol><li>Kanser grubu için öncelikle yumurtalık kanseri tanısı alan hastaları kaydettirmek ve laparotomi sonrası patolojik bulgularla seröz yumurtalık kanserine sahip oldukları kanıtlanmıştır...

<ol>
	<li>Manfredo Vieira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans.">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li><li>Geller, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+intratumor+bacteria+in+mediating+tumor+resistance+to+the+chemotherapeutic+drug+gemcitabine.">Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine.</a> Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).</li><li>Manfredo, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans.">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li><li>Brunelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globular+structure+of+human+ovulatory+cervical+mucus.">Globular structure of human ovulatory cervical mucus.</a> FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+continuum+along+the+female+reproductive+tract+and+its+relation+to+uterine-related+diseases.">The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases.</a> Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).</li><li>Zervomanolakis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+upward+transport+in+the+human+female+genital+tract.">Physiology of upward transport in the human female genital tract.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).</li><li>Verstraelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+human+uterine+microbiome+in+non-pregnant+women+through+deep+sequencing+of+the+V1-2+region+of+the+16S+rRNA+gene.">Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene.</a> PeerJ. 4, 1602 (2016).</li><li>Fang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoded+sequencing+reveals+diverse+intrauterine+microbiomes+in+patients+suffering+with+endometrial+polyps.">Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps.</a> American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).</li><li>Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+microbiota+of+the+reproductive+tract+in+women+undergoing+a+total+hysterectomy+and+bilateral+salpingo-oopherectomy.">Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy.</a> Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).</li><li>Banerjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ovarian+cancer+oncobiome.">The ovarian cancer oncobiome.</a> Oncotarget. 8 (22), 36225-36245 (2017).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+distribution+of+bacteria+between+cancerous+and+noncancerous+ovarian+tissues+in+situ.">The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ.</a> Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+overgrowth+and+diversification+of+microbiota+in+gastric+cancer.">Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer.</a> European Journal of Gastroenterology &amp; Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).</li><li>Hosgood, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+role+of+lung+microbiota+in+lung+cancer+attributed+to+household+coal+burning+exposures.">The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).</li><li>Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+and+Functional+Differences+between+Microbiota+and+Cervical+Carcinogenesis+as+Identified+by+Shotgun+Metagenomic+Sequencing.">Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing.</a> Cancers. 11 (3), 309 (2019).</li><li>Urbaniak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Microbiota+of+Breast+Tissue+and+Its+Association+with+Breast+Cancer.">The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+and+metatranscriptomic+analysis+of+human+prostate+microbiota+from+patients+with+prostate+cancer.">Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer.</a> BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).</li><li>Walsh, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmenopause+as+a+key+factor+in+the+composition+of+the+Endometrial+Cancer+Microbiome+(ECbiome).">Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome).</a> Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).</li><li>Walther-Antonio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+contribution+of+the+uterine+microbiome+in+the+development+of+endometrial+cancer.">Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer.</a> Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).</li><li>Poore, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiome+analyses+of+blood+and+tissues+suggest+cancer+diagnostic+approach.">Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach.</a> Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Ward, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BugBase+predicts+organism-level+microbiome+phenotypes.">BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>Langille, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences.">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).</li><li>Langille, M. G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences.">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).</li><li>Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAMP:+statistical+analysis+of+taxonomic+and+functional+profiles.">STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles.</a> Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).</li><li>Leranth, C., Hamori, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Dark&amp;#34;+Purkinje+cells+of+the+cerebellar+cortex.">34;Dark&amp;#34; Purkinje cells of the cerebellar cortex.</a> Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).</li></ol>

Yumurtalık kanserinin kadınların doğurganlığı üzerinde önemli bir etkisi vardır25. Yumurtalık kanseri hastalarının çoğu geç evrelerde teşhis edilir ve 5 yıllık sağkalım oranı% 30'dan azdır18. Karaciğer, pankreas ve dalak da dahil olmak üzere abdominal katı visseradaki bakterilerin teyidi yayınlanmıştır. Üst kadın üreme sisteminde bakteri varlığı, serviksin 2,3,4,</...

Son zamanlarda, böbrek, dalak, karaciğer ve yumurtalık1,2gibi abdominal katı visseradaki bakterilerin varlığını kanıtlayan giderek artan sayıda makale yayınlanmıştır. Geller ve arkeatik tümörlerde bakteri bulundu ve bu bakteriler bir kemoterapötik ilaç olan gemcitabine karşı dirençliydi2. S. Manfredo Vieira ve ark. Enterococcus gallinarum lenf düğümleri, karaciğer ve dalak için taşınabilir olduğu ve otoimmünite3.
Serviks bir savunucu olarak rol oynadığından, uterus, fallop tüpleri ve yumurtalıkları içeren üst kadın üreme sistemindeki bakteriler minimal olarak araştırılmıştır. Ancak son yıllarda bazı yeni teoriler ortaya atmıştır. Bakteriler, mücinlerdeki değişiklikler nedeniyle adet döngüsü sırasında rahim boşluğuna erişebilir4,5. Ek olarak, Zervomanolakis ve ark. uterusun fallop tüpleri ile birlikte yumurtalıkların endokrin sistemi tarafından kontrol edilen peristaltik bir pompa olduğunu doğruladı ve bu düzenleme bakterilerin endometriyum, fallop tüpleri ve yumurtalıklara girmesini sağlar6.
Bakteriyel tespit yöntemlerinin geliştirilmesi sayesinde üst üreme yolu artık bir gizem değil. Verstraelen ve ark., 16S RNA geni7'ninV1-2 hipervariable bölgesini hedef alarak rahim bakterilerini keşfetmek için barkodlu eşleştirilmiş uçlu bir dizileme yöntemi kullandı. Fang ve ark. endometriyal polipli hastalarda barkodlu dizileme kullanmış ve çeşitli rahim içi bakterilerin varlığını ortaya koymaktadır8. Ek olarak, 16S RNA geni kullanılarak, Miles ve arkadaşları salpingo-ophorektomi ve histerektomi geçirmiş kadınların genital sisteminde bakteri buldu, sırasıyla5,9.
Tümör dokularındaki bakteriler son yıllarda giderek daha fazla ilgi görmeye devam ediyor. Banerjee ve arkadaşları, mikrobiyom imzasının yumurtalık kanseri hastaları arasında farklılık olduğunu keşfetti ve10'unu kontrol etti. Noksinotinoz sibiricum tümör evresi ile ilişkiliydi ve Methanosarcina vakuolata yumurtalık kanserini teşhis etmek için kullanılabilir11. Yumurtalık kanserine ek olarak, mide, akciğer, prostat, meme, serviks ve endometrium gibi diğer kanserlerin12 , 13 , 14,15,16,17,18bakteri ile ilişkili olduğu kanıtlanmıştır. Poore ve arkadaşları, erken evre kanser taramasını öngören yeni bir mikrobiyal bazlı onkoloji tanı sınıfı önerdi19. Bu protokolde bu iki dokudaki bakterilerin bileşimini ve işlevini karşılaştırarak kanserli ve normal yumurtalık dokuları arasındaki farkları araştırdık.
Yumurtalıklarda bakteri varlığını doğrulamak için immünhistokinometri lekeleme ve 16S rRNA gen dizilimi yapıldı. Kanserli ve nonkanseröz yumurtalık dokularındaki yumurtalık bakterilerinin farklılıkları ve öngörülen fonksiyonları incelendi. Sonuçlar yumurtalık dokularında bakteri varlığını gösterdi. Anoxynatronum sibiricum ve Methanosarcina vakuolata sırasıyla yumurtalık kanseri evresi ve tanısı ile ilişkiliydi. Her iki grupta da bulunan 46 anlamlı farklı KEGG yolu karşılaştırıldı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation Software</td>
			<td>Agilgent 
			United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-pro plus 7</td>
			<td>Media Cybernetics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica ASP 300S</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EG 1150</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica RM2235</td>
			<td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5</td>
			<td>Hycult Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>M1386-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>M4029-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silva database</td>
			<td>Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the QuantiFluor dsDNA System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>Bj&#246;rn Usadel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit</td>
			<td>Zytomed Systems</td>
			<td>HRP008DAB-RB</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization and functional prediction of bacteria in ovarian tissues

"Steril" kadın üst üreme yolu teorisi, bakteriyel tespitteki gelişmeler nedeniyle artan bir muhalefetle karşılaşmaktadır. Ancak yumurtalıkların bakteri içerip içermediği henüz doğrulanmadı. Burada yumurtalık dokularındaki bakterileri tespit etmek için bir deney tanıtıldı. Kanser grubunda yumurtalık kanseri hastalarını, kontrol grubunda ise nonkanseröz hastaları seçtik. Yumurtalık dokularındaki bakterileri kanser ve kontrol gruplarından ayırt etmek için 16S rRNA gen dizilimi kullanıldı. Ayrıca, BugBase ve PICRUSt kullanarak tanımlanan bakterilerin fonksiyonel bileşimini tahmin ettik. Bu yöntem diğer iç organlarda ve dokularda da kullanılabilir, çünkü son yıllarda birçok organın bakteri barındırdığı kanıtlanmıştır. İçerdeki ve dokulardaki bakterilerin varlığı, bilim adamlarının kanserli ve normal dokuları değerlendirmesine yardımcı olabilir ve kanser tedavisinde yardımcı olabilir.

Hasta Çalışmaya toplam 16 nitelikli hasta dahil edildi. Kontrol grubunda iyi huylu rahim tümörü tanısı alan 10 kadın yer aldı (bunlar arasında 3 hastaya rahim miyomu, 7 hastaya rahim adenomiyozu tanısı konuldu). Bu arada kanser grubunda seröz yumurtalık kanseri tanısı alan 6 kadın vardı (bunların arasında 2 hastaya evre II, 2'sine evre III tanısı konuldu). Aşağıdaki özellikler kontrol grubundaki hastalar ile kanser grubu arasında hiçbir fark göstermedi: yaş, menopoz duru...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues at JoVE.com

Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues

Kanserli ve nonkanseröz yumurtalık dokularındaki bakterileri yerinde keşfetmek ve ayırt etmek amacıyla immünhistokimya lekelenme ve 16S ribozomal RNA geni (16S rRNA geni) dizilimi yapıldı. Bakterilerin bileşimsel ve fonksiyonel farklılıkları BugBase ve Göz ardı Edilmeyen Durumların Yeniden İnşası (PICRUSt) ile Toplulukların Filogenetik İncelemesi kullanılarak tahmin edildi.

Yumurtalık Dokularında Bakterilerin Karakterizasyonu ve Fonksiyonel Tahmini

The theory of a "sterile" female upper reproductive tract has been encountering increasing opposition due to advancements in bacterial detection. However, ...

Bu protokol yumurtalık dokularındaki bakterileri keşfetmek ve işlevlerini tahmin etmek için tasarlanmıştır. İmmünohistokinometri lekeleme ve 16S rRNA dizilimi, kanserli ve kanserli olmayan yumurtalık dokularındaki bakterileri yerinde keşfetmek ve ayırt etmek için kullanılmıştır. Bakterilerin telafi edici ve fonksiyonel farklılıkları, göz ardı edilmeyen günlerin yeniden inşası ile boP'lar ve toplulukların hücresel-genetik araştırması kullanılarak tahmin edilir.Protokolümüz yumurtalık dokularından in situ bakteri çıkarmayı amaçlamaktadır. Her türlü tümördeki bakterileri keşfetmek için de kullanılabilir. Protokolümüzün temel avantajları, kolay ve kullanışlı olması, hemen hemen her laboratuvarda gerçekleştirilebilmesidir.Sonuçları almak da hızlı. Protokoldeki uygulama sırasında, tesis dışındaki tümör dokuları hariç tutulması önemlidir. Bu nedenle, bu protokoldeki tüm prosedürlerin steril olması gerekir.Ameliyat sırasında, resektize edilmiş yumurtalıkları bir çift yeni steril cımbızla kabaca bir santimetre kalınlığında doku örneklerine ayırın. Tüm prosedür sırasında başka bir şeye dokunmaktan kaçının. Ayırmadan sonra, numuneyi steril bir tüpe çıkarın ve iletim için sıvı nitrojene koyun.Örnekleri eksi 80 santigrat derecede koruyun. Dokuları formalin ile sabitle ve sonra parafin ile gömün. Bu protokol burada duraklatılabilir.Dokular daha uzun süre muhafaza için oda sıcaklığında tutulabilir. Daha fazla adım atmak için numuneleri beş mikrometre seri bölümünde kesin. Sonra, örnekleri kurutun.De-parafin ve numunelere rehidrasyon yapın. Antijeni almak için EDTA tamponunda 10 dakikalık bir mikrodalga tedavisi gereklidir. Numuneleri %0,3 hidrojen içeren PBS'ye batırın.Endojen peroksidaz aktivitesini durdurmak için 20 dakika peroksidize edin. Antikor EMA'yı LPS çekirdeğinde 1'den 300'ün üzerinde bir konsantrasyonda gerçekleştirin. Ve dört santigrat derecede bir gece boyunca devam ettir.Bakterileri keşfetmek için, HRP'nin varlığını tespit etmek için bir DAP substrat kiti kullanın. Bir üreticinin talimatlarına dayanarak, HRP polimer, anti-tavşan antikor kullanın. Antikorların tamamen birleşmesi için masa konsantratörü kullanın.Birleştirici olmayan antikorları ortadan kaldırmak için PBS kullanın. Kimyasal lekelerinizi üreticinin talimatlarına göre yapın, ardından numuneleri su altına yıkayın. Örneklere dehidrasyon yapın.İmzalayarak örnekleri takım elbise. Ve üreticinin protokolüne göre görüntüleme Pro Plus Prepare kitaplığını kullanarak örnek olarak girin. Gene özgü diziler ve Illumina adaptörü çıkınt nükleotid dizilerinden oluşan astar desenini uygulayın.RRNA gen dizilerinde bakteriyel 16'ların V4 bölgesinin doğum oranlarını yükseltmek için amplicon PCR kullanarak DNA örnek girdisinden şablonu güçlendirin. Reaksiyon karışımını PCR ürününden çıkarmak için Mag-Bind RxNPure Plus manyetik boncukları kullanın. Dizinlenmiş PCR amplifikasyonu ikinci kez gerçekleştirin.Kitaplığı denetlemek için Agilent 2200 TapeStation'ı kullanın. Kitaplığı ölçmek için QuantiFluor dsDNA Sistemini kullanın. 600 döngüsü ile v3 standart akış hücresi yaklaşık 100.000 eşleştirilmiş uç üretir.2 kere 300 taban 3. Kitaplıklar normalleştirilir, havuza alındı ve sıralandı. Her numunenin ham oranları Trimmomatic tarafından sıralama kalitesine göre filtrasyona uğrar.Astar ve bağdaştırıcı dizilerinin her ikisi de kaldırılmalıdır. Hem çifti hem de nitelikleri 25'ten düşük olan sıra okumaları kısaltılmalıdır. QIIME yazılım paketi ile 16s rRNA'yı analiz edin.OTU'ları oluşturmak için dizileri toplayın ve benzerlik kesintisi %97 OPU'lar için, göreli bolluk her örnekte hesaplanmalıdır. Tüm dizileri sıralamak için RDP eğitim kümesinde bulunan bir Bayes sınıfılandırıcısı kullanın. OTU ile, dizilerin ana tutarlılığına sahip bir sınıflandırma OTU'lara atanır.ATU'lar, örnek grup bilgilerine dayanarak Silva veritabanına hizalanır. Alfa çeşitliliği ve UniFrac tabanlı ana koordinat analizi gerçekleştirin. Bakterilerin özelliklerinin ilgili sunumlarını tahmin etmek için BugBase kullanın.PICRUSt'ta bir metagenom'un işlevsel bileşimini tahmin edin. İzleme verilerinin ve referans genomları içeren bir veritabanının kullanımı ile STAMP yazılımı yardımıyla her grup arasındaki farklı işlevleri analiz edin. Sonucu hesaplamak için bir istatistik yazılımı kullanın.İstatistiksel önemin göstergesi 0,05'ten az olarak ayarlanmalıdır. Yaş ve eşlik içeren kafa karıştırıcı faktörleri Öğrencinin t-test'ine göre hesaplayın. Ki-kare testi ile menopoz durumunu, hipertansiyon ve diyabet öyküsünün hesapını hesaplayın.Mann-Whitney U testi ile yumurtalık bakteri taksonunun sayısını hesaplayın. Bu çalışmaya 16 hasta kayıt yaptırdı. BugBase, tahmin edilen metagenomların analizini uygulamak için kullanıldı.Anti-bakteriyel LPS antikor kullanarak yumurtalıkların potansiyel patogenetik ve immünhistokimyası. Bu rakam kanser ve kontrol gruplarında bakteriyel zenginliği ve çeşitliliği göstermektedir. 16S rRNA dizilimi ile ortaya çıktı.Rakamlar tür indeksi gözlenir. Chao1 endeksi, ACE endeksi, Shannon endeksi, Evenness endeksi, Simpson endeksi sırasıyla. Phyla'nın göreceli bolluğu ve yumurtalık örneklerinde en bol 12 bakteri türü bu şekilde gösterilmiştir.Şekil A, B, C ve D.Kontrol grubundaki hastaların yumurtalıklarındaki panelin ve yumurtalık kanseri grubundaki göreceli bolluk anlamına gelir. Kontrol hastalarının ve yumurtalık kanseri grubunun yumurtalıklarındaki en bol on iki bakteri türünün göreceli bolluğu. Bu, PCoA ve Anoxynatronum sibiricum ve Methanosarcina vacuolata'nın göreceli bolluğu kullanılarak kümelenmiş en yaygın olanıdır.Şekil A, PCoA kullanılarak kümelenen en yaygın olanları gösterir. PC1 ve PC2 x ve y ekseni üzerine çizilir. Kırmızı blok yumurtalık kanseri grubundaki örneğe eşittir.Mavi daire denetim grubundaki bir örneğe eşittir. Yumurtalık kanseri grubundan alınan örnekler kontrol grubundaki diğer örneklerden ayrılabilir. Şekil B, PCoA kullanılarak kümelenmiş en yaygın olanları gösterir.PC1 ve PC2 x ve y ekseninde çizilir. Kırmızı blok yumurtalık kanseri grubundaki bir örneğe eşittir. Mavi düz daire, rahim miyomu olan hastadan alınan bir örneğe eşittir.Ve mavi içi boş daire rahim adenomiyozu olan bir hastanın örneğine eşittir. Şekil C, Anoxynatronum sibiricum'un göreceli bolluğunu göstermektedir. Şekil D, Methanosarcina vacuolata'dır.Bu rakam, tahmin edilen metanemiklerin BugBase analizidir. Kanser grubundaki yumurtalıkların potansiyel patogenetik ve oksidatif stres tolerans fenotipi kontrol grubundan daha güçlüdür. Bu rakam PICRUSt analizi ile kanser ve kontrol grupları arasındaki KEGG yol boşluğundan önemli ölçüde farklıdır.Numunelerimizi aldığımızda, bir çift yeni steril cımbıza ihtiyaç vardır. Numunelere olası kontaminasyona dikkat edin. Bu bakteri saha dışı tümör dokuları azmi büyük ölçüde etkileyebilir.Denetim grubunu her adıma ayarlamak tercih edilir. Potansiyel kontaminasyonun etkisini azaltmak için.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Insan akciğer dokularında ZW10 etkileşim protein Immünoster dijital Analizi

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Yumurtalık Kanseri Dokularından Mitokondri Hazırlanması ve Kantitatif Proteomik Analizi Için Yumurtalık Dokularının Kontrolü

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer

Yumurtalık Kanserinde Çentik Sinyalizasyonunun Rolünü Anlamak İçin Biyoinformatik Yaklaşımların ve Deneysel Doğrulamaların Entegrasyonu

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Dolaşımdaki Tümör Hücre Hatları: Temel ve Çevirisel Araştırmalar için Yenilikçi Bir Araç

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Yüksek Dereceli Seröz Yumurtalık Kanseri Hasta Kaynaklı Organoidlerin Üretimi ve Kültürlenmesi

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Tek Sarmallı DNA İmmünofloresan Kullanarak Yumurtalık Kanseri Hücrelerinde Replikasyon Stresinin Ölçülmesi

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

İmmünofloresan Tahlilleri ile Hasta Kaynaklı Yumurtalık Kanseri Organoidlerinde DNA Hasar Onarım Proteinlerinin Görselleştirilmesi

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...