Name: fabrication of 3d cardiac microtissue arrays using human ipsc-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells
Uploaded: 2021-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells at JoVE.com

Vi takker Dr. Amanda Chase for hendes nyttige feedback på manuskriptet. Finansieringsstøtte blev ydet af Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) fra University of California, T29FT0380 (D.T.) og 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) og 17MERIT33610009 (J.C.W.); og National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 og NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

1. Medium, reagens, tilberedning af kulturplade
<ol><li>Cellevaskeopløsning til cellekultur: Brug 1x fosfatbufret saltvand (PBS) eller Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) uden calcium eller magnesium.</li>
	<li>Kardiomyocytdifferentieringsmedier<ol>
<li>Forbered differentiering Medium # 1 ved at tilføje 10 ml supplement (50x B27 plus insulin) til 500 ml kardiomyocyt basal medium (RPMI 1640).</li>
		<li>Forbered differentiering Medium # 2 ved at tilføje 10 ml supplement (50x B27 minus insulin) til 500 ml kardiom...

<ol>
	<li>Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hurdles+to+clinical+translation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 156166 (2018).</li><li>Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stem+cell+organoids.">Engineering stem cell organoids.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cardiac+microtissues+composed+of+cardiomyocytes+and+endothelial+cells+co-differentiated+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).</li><li>Kurokawa, Y. K., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+the+cardiac+microenvironment:+Multicellular+microphysiological+systems+for+drug+screening.">Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).</li><li>Cartledge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+crosstalk+between+cardiac+fibroblasts+and+adult+cardiomyocytes+by+soluble+mediators.">Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators.</a> Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).</li><li>Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+non-myocyte+cells+show+enhanced+pharmacological+function+suggestive+of+contractile+maturity+in+stem+cell+derived+cardiomyocyte+microtissues.">Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues.</a> Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Brutsaert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+endothelial-myocardial+signaling:+its+role+in+cardiac+growth,+contractile+performance,+and+rhythmicity.">Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity.</a> Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).</li><li>Huebsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+video-based+analysis+of+contractility+and+calcium+flux+in+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+cultured+over+different+spatial+scales.">Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pravastatin+reverses+obesity-induced+dysfunction+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+via+a+nitric+oxide-dependent+mechanism.">Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism.</a> European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).</li><li>Williams, I. M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).</li><li>Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 1-7 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+in+vitro+modeling+of+cardiac+fibrosis.">Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis.</a> Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+via+second+heart+field+progenitors.">Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors.</a> Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-iPSC-derived+cardiac+stromal+cells+enhance+maturation+in+3d+cardiac+microtissues+and+reveal+non-cardiomyocyte+contributions+to+heart+disease.">Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease.</a> Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).</li><li>Burridge, P. W., Holmstr&#246;m, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+culture+and+cardiomyocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/&#946;-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/&#946;-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+Advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+expression+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-+and+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells.">Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells.</a> Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Gu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+cells.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).</li><li>Acharya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+transcription+factor+Tcf21+is+required+for+lineage-specific+EMT+of+cardiac+fibroblast+progenitors.">The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors.</a> Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).</li><li>Wessels, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardially+derived+fibroblasts+preferentially+contribute+to+the+parietal+leaflets+of+the+atrioventricular+valves+in+the+murine+heart.">Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart.</a> Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).</li><li>Ali, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+heterogeneity+of+cardiac+fibroblasts+does+not+predict+pathological+proliferation+and+activation.">Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation.</a> Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).</li><li>McMurtrey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytic+and+numerical+models+of+oxygen+and+nutrient+diffusion,+metabolism+dynamics,+and+architecture+optimization+in+three-dimensional+tissue+constructs+with+applications+and+insights+in+cerebral+organoids.">Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids.</a> Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).</li><li>Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+customized+extracellular+niche+engineering:+progress+in+cell-entrapment+technologies.">Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies.</a> Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).</li><li>Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+Multi-dimensional+induced+pluripotent+stem+cells-based+model+platforms+to+assess+cardiotoxicity+in+cancer+therapies.">Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies.</a> Front Pharmacol. 12, 39 (2021).</li><li>Rhee, J. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+secondary+iron+overload+cardiomyopathy+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).</li><li>Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+in+cardiovascular+development,+disease,+and+medicine.">Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).</li><li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+considerations+for+single-cell+RNA+sequencing+approaches.">Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).</li><li>Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-wide+approaches+in+induced+pluripotent+stem+cell+models.">Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models.</a> Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).</li><li>Maddah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+platform+for+functional+characterization+of+stem-cell-derived+cardiomyocytes+with+applications+in+cardiotoxicity+testing.">A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing.</a> Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).</li><li>Sala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Musclemotion:+A+versatile+open+software+tool+to+quantify+cardiomyocyte+and+cardiac+muscle+contraction+in+vitro+and+in+vivo.">Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).</li></ol>

For at generere hjertemikrotiser fra prædifferentierede iPSC-PM'er, iPSC-EC'er og iPSC-CF'er er det vigtigt at opnå en meget ren kultur for bedre kontrol af cellenumre efter kontakthæmmet cellekomprimering inden for hjertemikrovævene. For nylig, Giacomelli et. al.18 har demonstreret fremstilling af hjertemikrotiser ved hjælp af iPSC-CM'er, iPSC-EC'er og iPSC-GF'er. Hjertemikroproblemer genereret ved hjælp af den beskrevne metode består af ~ 5.000 celler (70% iPSC-CM'er, 15% iPSC-EC'er og 15...

Lægemiddelopdagelse og sygdomsmodellering inden for kardiovaskulær forskning står over for flere udfordringer på grund af mangel på klinisk relevante prøver og utilstrækkelige translationelle værktøjer1. Meget komplekse prækliniske modeller eller overforenklede in vitro-enkeltcellemodeller udviser ikke patofysiologiske tilstande på en reproducerbar måde. Derfor har flere miniaturiserede vævskonstruerede platforme udviklet sig til at hjælpe med at bygge bro over kløften med det formål at opnå en balance mellem brugervenlighed på en måde med høj gennemstrømning og trofast rekapitulation af vævsfunktion2,3. Med fremkomsten af induceret pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) kan vævstekniske værktøjer anvendes på patientspecifikke celler med eller uden underliggende kardiovaskulær sygdomstilstand for at besvare forskningsspørgsmål4,5,6. Sådanne vævskonstruerede modeller med cellulær sammensætning svarende til hjertevævet kunne anvendes i lægemiddeludviklingsindsatsen for at teste for kardiotoksicitet og dysfunktion induceret af patologiske ændringer i adfærd hos en eller flere celletyper.
Selvsamlede mikrovæv eller organoider afledt af humane iPSC'er er tredimensionelle (3D) strukturer, der er miniaturevævslignende samlinger, der udviser funktionelle ligheder med deres in vivo-modstykker . Der er flere forskellige tilgange, der tillader dannelse af organoider in situ via rettet differentiering af iPSC'er eller gennem dannelse af embryoide kroppe4. De resulterende organoider er et uundværligt redskab til at studere morfogenetiske processer, der driver organogenese. Tilstedeværelsen af en række cellepopulationer og forskelle i selvorganisering kan imidlertid føre til variation i resultaterne mellem forskellige organoider5. Alternativt er prædifferentierede celler, der er selvsamlet til mikrovævssuer med vævsspecifikke celletyper for at studere lokale celle-celleinteraktioner, fremragende modeller, hvor det er muligt at isolere de selvmonterede komponenter. Især inden for human hjerteforskning har udviklingen af 3D-hjertemikrovæv med flercellede komponenter vist sig at være udfordrende, når celler stammer fra forskellige patientlinjer eller kommercielle kilder.
For at forbedre vores mekanistiske forståelse af celleadfærd i en fysiologisk relevant, personlig in vitro-model bør ideelt set alle komponentcelletyper udledes af den samme patientlinje. I forbindelse med et menneskeligt hjerte ville en virkelig repræsentativ hjerte-in vitro-model fange krydstalen blandt fremherskende celletyper, nemlig kardiomyocytter (CM'er), endotelceller (EF'er) og hjertefibroblaster (CF'er) 6,7. Den trofaste rekapitulation af et myokardium kræver ikke kun biofysisk strækning og elektrofysiologisk stimulering, men også cellecellesignalering, der stammer fra understøttende celletyper som ECs og CFs8. GF'er er involveret i syntesen af ekstracellulær matrix og opretholdelse af vævsstruktur; og i en patologisk tilstand kan CF'er fremkalde fibrose og ændre elektrisk ledning i CMs9. På samme måde kan EU'er regulere kontraktile egenskaber ved PM'er gennem parakrin signalering og levering af vitale metaboliske krav10. Derfor er der behov for humane hjertemikrovæv, der består af alle tre hovedcelletyper, for at gøre det muligt at udføre fysiologisk relevante eksperimenter med høj kapacitet.
Her beskriver vi en bottom-up-tilgang til fremstilling af hjertemikrovæv ved afledning af humane iPSC-afledte kardiomyocytter (iPSC-CM'er), iPSC-afledte endotelceller (iPSC-EC'er) og iPSC-afledte hjertefibroblaster (iPSC-CF'er) og deres 3D-kultur i ensartede hjertemikrotissue-arrays. Denne letkøbte metode til at generere spontant slående hjertemikrovæv kan bruges til sygdomsmodellering og hurtig test af lægemidler til funktionel og mekanistisk forståelse af hjertefysiologi. Desuden kan sådanne multicellulære hjertemikrotissueplatforme udnyttes med genomredigeringsteknikker til at efterligne hjertesygdomsprogression over tid under kroniske eller akutte dyrkningsforhold.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D micro-molds</td>
			<td>Microtissues</td>
			<td>12-81 format</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9104697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement minus Insulin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement plus Insulin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel, hESC-qualified matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin T Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-120-403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-110-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDR2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-81707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V13242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>4942086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium</td>
			<td></td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 basal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit</td>
			<td>LifeLIne Cell Technology</td>
			<td>LS-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose free RPMI medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11879-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF-165</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1-endo</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Sorting Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Rinsing Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11835055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>red</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin Alexa Fluor&#174; 488-conjugated Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC2105G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of 3d cardiac microtissue arrays using human ipsc-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells

Generering af humane kardiomyocytter (PM'er), hjertefibroblaster (CF'er) og endotelceller (EC'er) fra inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) har givet en unik mulighed for at studere det komplekse samspil mellem forskellige kardiovaskulære celletyper, der driver vævsudvikling og sygdom. Inden for hjertevævsmodeller bruger flere sofistikerede tredimensionelle (3D) tilgange inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (iPSC-PM'er) til at efterligne fysiologisk relevans og indfødt vævsmiljø med en kombination af ekstracellulære matricer og tværbindinger. Disse systemer er imidlertid komplekse at fremstille uden mikrofabrikationsekspertise og kræver flere uger at samle sig selv. Vigtigst af alt mangler mange af disse systemer vaskulære celler og hjertefibroblaster, der udgør over 60% af nonmyocytterne i det menneskelige hjerte. Her beskriver vi afledningen af alle tre hjertecelletyper fra iPSC'er til fremstilling af hjertemikrotiser. Denne lette replikastøbningsteknik tillader hjertemikrotissuekultur i standard multi-brøndcellekulturplader i flere uger. Platformen tillader brugerdefineret kontrol over mikrovævsstørrelser baseret på indledende såningstæthed og kræver mindre end 3 dage for selvmontering for at opnå observerbare hjertemikrovævskontraktioner. Desuden kan hjertemikrovævene let fordøjes, samtidig med at der opretholdes høj cellelevedygtighed til enkeltcelleforhør ved anvendelse af flowcytometri og enkeltcellet RNA-sekventering (scRNA-seq). Vi forestiller os, at denne in vitro-model af hjertemikrotiser vil hjælpe med at fremskynde valideringsstudier inden for lægemiddelopdagelse og sygdomsmodellering.

Immunostaining og flowcytometri karakterisering af iPSC-afledte PM'er, EP'er og CF'er For at generere hjertemikrotiser sammensat af iPSC-CM'er, iPSC-EC'er og iPSC-CF'er differentieres og karakteriseres alle tre celletyper individuelt. In vitro-differentieringen af iPSC'er til iPSC-CM'er er blevet forbedret i løbet af de seneste år. Udbyttet og renheden af iPSC-CM'er varierer imidlertid fra linje til linje. Den nuværende protokol giver over 75% rene iPSC-CM'er, der spontant begynder at slå...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells at JoVE.com

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Her beskriver vi en brugervenlig metode til at generere 3D-selvmonterede hjertemikrotissue-arrays sammensat af prædifferentierede humaninducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller. Denne brugervenlige og lavcellekrævende teknik til at generere hjertemikrotiser kan implementeres til sygdomsmodellering og tidlige stadier af lægemiddeludvikling.

Fremstilling af 3D-hjertemikrovævarrays ved hjælp af humane iPSC-afledte kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Protokollen kombinerer kraften i at generere humane kardiovaskulære celletyper ved hjælp af inducerede pluripotente stamceller og en alsidig teknik til at generere slående hjertesfæroider på mindre end 72 timer. Disse hjertesfæroider kan bruges til sygdomsmodellering og lægemiddeltestning. En af de største fordele ved denne facile teknik er, at man kunne generere næsten 1000 slående hjertesfæroider i en standard 12-brønds plade.Og vigtigst af alt kan hver eneste hjertesfæroid analyseres for sin kontraktile funktion ved hjælp af billeddannelsesbaseret teknik. Efter smeltning af agarose i mikrobølgeovnen skal du placere den i biosikkerhedsskabet og lade den afkøle i tre minutter. Pipette 700 mikroliter af den smeltede agarose og tilsæt den til silikonemikroformen af en ni til ni array, idet man sørger for at undgå at generere bobler.Placer forsigtigt formen på den forkolde isblok for at fremskynde agarosevarigheden. Når agarose bliver gennemskinnelig, skal du forsigtigt bøje kanterne af mikromold for at tabe agarosekopien og forsigtigt skrælle replikaen fra alle sider for at løsne den fra silikonemikromolen. Overfør agarosemikrotissuebakken indeholdende 81 cirkulære udsparinger til en steril 12-brønds plade, tilsæt derefter to milliliter PBS til agarosemikrovævsbakken, og inspicér den under mikroskopet for eventuelle fangede bobler eller uregelmæssigt formede brønde.Nedsænk agarosebakken i to milliliter 70 % ethanol natten over, efterfulgt af UV-behandling i biosikkerhedsskabet i en time. Fjern 70% ethanol og vask to gange med destilleret vand og en gang med to ml PBS. Når de inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller tælles efter trypsinisering og neutralisering, skal du placere cellesuspensionerne på isen.I et nyt rør blandes de inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller. Fjern derefter PBS fra brønden og cellesåkammeret uden at røre ved udsparingerne, og tilsæt 200 mikroliter af cellesuspensionen dråbevis. Lad cellerne slå sig ned ved 37 grader Celsius i en kuldioxidinkubator i to timer.Tilsæt mikrovævsfremstillingsmedium, der omgiver agaroseformen for at dække overfladen af det indre kammer. Efter 24 timer skal du observere for selvmonterede og kompakte sfæroider i de cirkulære udsparinger. Skift medium hver anden dag for at opretholde sfæroiderne.Efter 48 timer kan der typisk observeres spontan slag af sfæroiderne. Kultur de enkelte celletyper separat på kældermembranmatrixmedium eller gelatinebelagte kammerglider. Skyl forsigtigt hjertemikrotissuerne ud af de cirkulære udsparinger, og saml dem i et 15 ml krønikerør.Aspirer mediet og skyl cellerne eller mikrovæverne med en milliliter PBS. Fastgør derefter cellerne eller mikrotissuerne med fikseringsbuffer indeholdende 4,2% PFA og inkuber ved stuetemperatur. Aspirer PFA og inkuber cellerne eller mikroproblemerne med en milliliter permeabiliserende opløsning.Derefter aspireres opløsningen og skylles med to til tre ml PBS. Tilsæt 500 til 1000 mikroliter blokerende opløsning til cellerne og inkuber i mindst en time for kammerdiasene og i tre til fire timer for mikroproblemerne. Inkubere prøverne med konjugerede antistoffer i blokeringsopløsningen i en time for kammerglider og natten over ved fire grader Celsius for hjertemikrovævene.Vask kammerglider tre gange med 500 mikroliter 0,1% Tween 20, med fem minutters varighed mellem hver vask, og udfør derefter en sidste vask med PBS. Vask hjertemikrovævet fem gange med to milliliter 0,1% Tween 20, med en varighed på 20 minutter mellem hver vask. Udfør derefter en sidste vask i yderligere 20 minutter.Inkuber cellerne eller mikroproblemerne med DAPI inden konfokal mikroskopi, overfør derefter forsigtigt hjertemikrovævene til en 35 millimeter glasbundsskål, og tilsæt PBS for at nedsænke mikrovævet. Skyl mikrovævene ud af de cirkulære udsparinger med medium en ved hjælp af en bred eller en milliliter pipettespids i et 15 ml kronisk rør, og lad dem slå sig ned. Derefter aspireres mediet og skylles med en milliliter PBS.Tilsæt 200 til 300 mikroliter af enzymets fordøjelsesbuffer og inkuber i 10 minutter ved 37 grader Celsius. Bland derefter mikrotissuerne forsigtigt i et minut, og gentag inkubationen. Efter inkubationen blandes mikrotissuerne kraftigt med en regelmæssig pipettespids på en milliliter for at fordøje den i enkeltceller.Opnå en uklar cellesuspension, og neutraliser straks cellesuspensionen med fem milliliter medium indeholdende 5% FBS. Sil cellesuspensionen gennem en 40 mikrometer cellesil, og tæl det samlede antal celler. Centrifugering af enkeltcellesuspensionen ved 300 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius.Aspiratér supernatanten, og resuspend cellerne i annexinbindende buffer med FITC Annexin V og propidiumiodid eller TO-PRO-3 dødcelleeksekundelsesfarvestof, og inkuber i 10 minutter på is. Efter inkubationen tilsættes 300 mikroliter af annexinbindingsbufferen til cellesuspensionen og overføres til et facs-rør med rund bund til flowcytometrianalyse. Oprensede inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter, endotelceller og hjertefibroblaster blev visualiseret ved hjælp af fasekontrastmikroskopi.Renheden af forskellige celletyper blev bestemt under anvendelse af immunfarvning og flowcytometri. Troponin T blev anvendt som markør for kardiomyocytter, og over 90% renhed blev opnået. Blodpladeendotelcelleadhæsionsmolekylet CD31 og vimentin blev anvendt som markører for endotelceller og hjertefibroblaster og indikerede renhed over henholdsvis 98 og 96%.Immunofluorescensfarvning afslørede, at kardiomyocytterne var de tungeste og besatte mikrotissuernes centrum, mens endotelcellerne blev spredt gennem mikrotissuerne, og hjertefibroblasterne overvejende besatte periferien. Fordøjelsen af mikroproblemerne ved hjælp af dette tempo et og Liberase TL resulterede i meget levedygtige celleproportioner med færre apoptotiske celler efter to uger i kultur. Den ene times eksponering af hjertemikrotissuerne for en høj koncentration af doxorubicininduceret dosisafhængig kardiotoksicitet.Mikrovævets kontraktilitet og vektorernes bevægelse genererede et pseudovarmekort, der illustrerede den gennemsnitlige sammentrækningsprofil på tværs af mikrotissue. Den kontraktile bevægelse af hjertemikrovævene genererede positive toppe, der blev målt som sammentrækningshastigheden, afslapningshastigheden og slaghastigheden, som blev beregnet som tid mellem to sammentrækningscyklusser. Kontraktiliteten af hjertemikrovævene var konsistent over fire uger i dyrkning.Opvarmning af celler er et af de vigtigste trin i denne særlige protokol, hvor man skal passe på omhyggeligt at dispensere cellesuspensionen dråbevis ind i agarosearrayet for jævn fordeling i mikrobrøndene og for at forhindre overløb. Ved hjælp af den optimerede strålingsprotokol for disse mikrotiser kunne man udsætte disse for teknologier med høj gennemstrømningssekventering, såsom enkeltcelle RNA-seq eller enkeltcelle ATAC-seq for at forstå cellespecifikke genekspressionsmønstre som følge af forskellige behandlingsbetingelser.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Anatomiske rekonstruktioner af Human Cardiac Venøs System ved hjælp Kontrast-computertomografi af Perfusion-faste Prøver

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Konstruktion af Defineret Humane Engineered hjertevæv at studere Mekanismer for Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Oprettelse af hjertevæv, der udviser mekanisk integration af sfæroider ved hjælp af 3D bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

Ved hjælp af ekstraordinære optisk Transmission at kvantificere hjerte biomarkører i humant Serum

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokol for mikroRNA overførsel i knoglemarv-afledte hæmatopoietisk stamceller til at aktivere celle Engineering kombineret med magnetisk målretning

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

En netto skimmel-baseret metode til stillads-gratis tre-dimensionelle hjerte væv skabelse

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Standardiseret og skalerbar analyse til undersøgelse af Perfuserende 3D Angiogen spiring af iPSC-afledte endotelceller in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Humane iPSC-afledte Cardiomyocyte-netværk på Multiwell Micro-elektrode systemer til tilbagevendende action-potentielle optagelser

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Præklinisk hjerteelektrofysiologivurdering ved dobbelt spænding og calciumoptisk kortlægning af humane organotypiske hjerteskiver

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...