Name: fabrication of 3d cardiac microtissue arrays using human ipsc-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells
Uploaded: 2021-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells at JoVE.com

We bedanken Dr. Amanda Chase voor haar nuttige feedback op het manuscript. Financieringssteun werd verstrekt door het Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) van de Universiteit van Californië, T29FT0380 (D.T.) en 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) en 17MERIT33610009 (J.C.W.); en National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 en NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

1. Medium, reagens, kweekplaatvoorbereiding
<ol><li>Celwasoplossing voor celkweek: Gebruik 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) zonder calcium of magnesium.</li>
	<li>Cardiomyocytendifferentiatiemedia<ol>
<li>Bereid differentiatie Medium # 1 voor door 10 ml supplement (50x B27 plus insuline) toe te voegen aan 500 ml cardiomyocyten basaal medium (RPMI 1640).</li>
		<li>Bereid differentiatie Medium # 2 door 10 ml supplement (50x B27 minus insuline) toe te voegen aan 500 ml...

<ol>
	<li>Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hurdles+to+clinical+translation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 156166 (2018).</li><li>Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stem+cell+organoids.">Engineering stem cell organoids.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cardiac+microtissues+composed+of+cardiomyocytes+and+endothelial+cells+co-differentiated+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).</li><li>Kurokawa, Y. K., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+the+cardiac+microenvironment:+Multicellular+microphysiological+systems+for+drug+screening.">Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).</li><li>Cartledge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+crosstalk+between+cardiac+fibroblasts+and+adult+cardiomyocytes+by+soluble+mediators.">Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators.</a> Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).</li><li>Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+non-myocyte+cells+show+enhanced+pharmacological+function+suggestive+of+contractile+maturity+in+stem+cell+derived+cardiomyocyte+microtissues.">Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues.</a> Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Brutsaert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+endothelial-myocardial+signaling:+its+role+in+cardiac+growth,+contractile+performance,+and+rhythmicity.">Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity.</a> Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).</li><li>Huebsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+video-based+analysis+of+contractility+and+calcium+flux+in+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+cultured+over+different+spatial+scales.">Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pravastatin+reverses+obesity-induced+dysfunction+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+via+a+nitric+oxide-dependent+mechanism.">Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism.</a> European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).</li><li>Williams, I. M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).</li><li>Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 1-7 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+in+vitro+modeling+of+cardiac+fibrosis.">Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis.</a> Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+via+second+heart+field+progenitors.">Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors.</a> Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-iPSC-derived+cardiac+stromal+cells+enhance+maturation+in+3d+cardiac+microtissues+and+reveal+non-cardiomyocyte+contributions+to+heart+disease.">Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease.</a> Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).</li><li>Burridge, P. W., Holmstr&#246;m, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+culture+and+cardiomyocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/&#946;-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/&#946;-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+Advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+expression+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-+and+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells.">Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells.</a> Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Gu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+cells.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).</li><li>Acharya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+transcription+factor+Tcf21+is+required+for+lineage-specific+EMT+of+cardiac+fibroblast+progenitors.">The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors.</a> Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).</li><li>Wessels, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardially+derived+fibroblasts+preferentially+contribute+to+the+parietal+leaflets+of+the+atrioventricular+valves+in+the+murine+heart.">Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart.</a> Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).</li><li>Ali, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+heterogeneity+of+cardiac+fibroblasts+does+not+predict+pathological+proliferation+and+activation.">Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation.</a> Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).</li><li>McMurtrey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytic+and+numerical+models+of+oxygen+and+nutrient+diffusion,+metabolism+dynamics,+and+architecture+optimization+in+three-dimensional+tissue+constructs+with+applications+and+insights+in+cerebral+organoids.">Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids.</a> Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).</li><li>Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+customized+extracellular+niche+engineering:+progress+in+cell-entrapment+technologies.">Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies.</a> Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).</li><li>Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+Multi-dimensional+induced+pluripotent+stem+cells-based+model+platforms+to+assess+cardiotoxicity+in+cancer+therapies.">Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies.</a> Front Pharmacol. 12, 39 (2021).</li><li>Rhee, J. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+secondary+iron+overload+cardiomyopathy+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).</li><li>Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+in+cardiovascular+development,+disease,+and+medicine.">Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).</li><li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+considerations+for+single-cell+RNA+sequencing+approaches.">Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).</li><li>Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-wide+approaches+in+induced+pluripotent+stem+cell+models.">Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models.</a> Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).</li><li>Maddah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+platform+for+functional+characterization+of+stem-cell-derived+cardiomyocytes+with+applications+in+cardiotoxicity+testing.">A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing.</a> Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).</li><li>Sala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Musclemotion:+A+versatile+open+software+tool+to+quantify+cardiomyocyte+and+cardiac+muscle+contraction+in+vitro+and+in+vivo.">Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).</li></ol>

Om cardiale microtissues te genereren uit vooraf gedifferentieerde iPSC-CMs, iPSC-EC's en iPSC-CFs, is het essentieel om een zeer zuivere cultuur te verkrijgen voor een betere controle van het aantal cellen na contact-geremde celverdichting in de cardiale microtissues. Onlangs heeft Giacomelli et. al.18 hebben de fabricage van cardiale microtissues aangetoond met behulp van iPSC-CMs, iPSC-EC's en iPSC-CFs. Cardiale microtissues gegenereerd met behulp van de beschreven methode bestaan uit ~ 5.000 c...

Geneesmiddelenontdekking en ziektemodellering op het gebied van cardiovasculair onderzoek worden geconfronteerd met verschillende uitdagingen als gevolg van een gebrek aan klinisch relevante monsters en ontoereikende translationele hulpmiddelen1. Zeer complexe preklinische modellen of overgesimplificeerde in vitro eencellige modellen vertonen geen pathofysiologische omstandigheden op een reproduceerbare manier. Daarom zijn verschillende geminiaturiseerde weefselmanipulatieplatforms geëvolueerd om de kloof te helpen overbruggen, met als doel een balans te bereiken tussen gebruiksgemak op een manier met hoge doorvoer en getrouwe recapitulatie van weefselfunctie2,3. Met de komst van geïnduceerde pluripotente stamceltechnologie (iPSC) kunnen tissue engineering-instrumenten worden toegepast op patiëntspecifieke cellen met of zonder onderliggende cardiovasculaire hartziekte om onderzoeksvragen te beantwoorden4,5,6. Dergelijke weefselmanipulatiemodellen met cellulaire samenstelling vergelijkbaar met het hartweefsel kunnen worden gebruikt bij de ontwikkeling van geneesmiddelen om te testen op cardiotoxiciteit en disfunctie veroorzaakt door pathologische gedragsveranderingen van een of meerdere celtypen.
Zelfgeassembleerde microtissues of organoïden afgeleid van menselijke iPSC's zijn driedimensionale (3D) structuren die miniatuur weefselachtige assemblages zijn die functionele overeenkomsten vertonen met hun in vivo tegenhangers. Er zijn verschillende benaderingen die de vorming van organoïden in situ mogelijk maken via gerichte differentiatie van iPSC's of door de vorming van embryoïde lichamen4. De resulterende organoïden zijn een onmisbaar hulpmiddel om morfogenetische processen te bestuderen die de organogenese aansturen. De aanwezigheid van een verscheidenheid aan celpopulaties en verschillen in zelforganisatie kunnen echter leiden tot variabiliteit in uitkomsten tussen verschillende organoïden5. Als alternatief zijn vooraf gedifferentieerde cellen die zelf geassembleerd zijn tot microtissues met weefselspecifieke celtypen om lokale cel-celinteracties te bestuderen uitstekende modellen, waarbij het mogelijk is om de zelfgeassembleerde componenten te isoleren. Met name in menselijk cardiaal onderzoek is de ontwikkeling van 3D-cardiale microtissues met meercellige componenten een uitdaging gebleken wanneer cellen zijn afgeleid van verschillende patiëntenlijnen of commerciële bronnen.
Om ons mechanistisch begrip van celgedrag in een fysiologisch relevant, gepersonaliseerd, in vitro model te verbeteren, moeten idealiter alle componentceltypen worden afgeleid van dezelfde patiëntenlijn. In de context van een menselijk hart zou een echt representatief cardiaal in vitro model de overspraak tussen overheersende celtypen vastleggen, namelijk cardiomyocyten (CMs), endotheelcellen (EC's) en cardiale fibroblasten (CF's)6,7. De getrouwe recapitulatie van een myocardium vereist niet alleen biofysische rek en elektrofysiologische stimulatie, maar ook cel-celsignalering die ontstaat uit ondersteunende celtypen zoals EC's en CF's8. CF's zijn betrokken bij de synthese van extracellulaire matrix en het behoud van de weefselstructuur; en in pathologische toestand kunnen CF's fibrose induceren en de elektrische geleiding in de CM's veranderen9. Evenzo kunnen EC's contractiele eigenschappen van CM's reguleren door paracriene signalering en het leveren van vitale metabolische eisen10. Daarom is er behoefte aan menselijke cardiale microtissues die zijn samengesteld uit alle drie de belangrijkste celtypen om fysiologisch relevante high-throughput experimenten uit te voeren.
Hier beschrijven we een bottom-up benadering in de fabricage van cardiale microtissues door afleiding van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMs), iPSC-afgeleide endotheelcellen (iPSC-EC's) en iPSC-afgeleide cardiale fibroblasten (iPSC-CFs) en hun 3D-cultuur in uniforme cardiale microtissue-arrays. Deze gemakkelijke methode voor het genereren van spontaan kloppende cardiale microtissues kan worden gebruikt voor ziektemodellering en het snel testen van geneesmiddelen voor functioneel en mechanistisch begrip van hartfysiologie. Bovendien kunnen dergelijke meercellige cardiale microtissueplatforms worden benut met genoombewerkingstechnieken om de progressie van hartaandoeningen in de loop van de tijd na te bootsen onder chronische of acute kweekomstandigheden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D micro-molds</td>
			<td>Microtissues</td>
			<td>12-81 format</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9104697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement minus Insulin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement plus Insulin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel, hESC-qualified matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin T Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-120-403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-110-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDR2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-81707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V13242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>4942086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium</td>
			<td></td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 basal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit</td>
			<td>LifeLIne Cell Technology</td>
			<td>LS-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose free RPMI medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11879-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF-165</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1-endo</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Sorting Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Rinsing Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11835055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>red</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin Alexa Fluor&#174; 488-conjugated Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC2105G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of 3d cardiac microtissue arrays using human ipsc-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells

Het genereren van menselijke cardiomyocyten (CMs), cardiale fibroblasten (CF's) en endotheelcellen (EC's) uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) heeft een unieke kans geboden om de complexe wisselwerking tussen verschillende cardiovasculaire celtypen te bestuderen die weefselontwikkeling en ziekte stimuleert. Op het gebied van hartweefselmodellen gebruiken verschillende geavanceerde driedimensionale (3D) benaderingen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMs) om fysiologische relevantie en inheemse weefselomgeving na te bootsen met een combinatie van extracellulaire matrices en crosslinkers. Deze systemen zijn echter complex om te fabriceren zonder microfabricage-expertise en vereisen enkele weken om zichzelf te assembleren. Het belangrijkste is dat veel van deze systemen geen vasculaire cellen en cardiale fibroblasten hebben die meer dan 60% van de niet-myocyten in het menselijk hart uitmaken. Hier beschrijven we de afleiding van alle drie de hartceltypen van iPSC's om cardiale microtissues te fabriceren. Deze gemakkelijke replica molding techniek maakt cardiale microtissue cultuur in standaard multi-well cel kweekplaten gedurende enkele weken mogelijk. Het platform biedt door de gebruiker gedefinieerde controle over microtissuegroottes op basis van de initiële zaaidichtheid en heeft minder dan 3 dagen nodig voor zelfassemblage om waarneembare cardiale microtissue-contracties te bereiken. Bovendien kunnen de cardiale microtissues gemakkelijk worden verteerd met behoud van een hoge cel levensvatbaarheid voor eencellige ondervraging met behulp van flowcytometrie en eencellige RNA-sequencing (scRNA-seq). We stellen ons voor dat dit in vitro model van cardiale microtissues zal helpen bij het versnellen van validatiestudies in medicijnontdekking en ziektemodellering.

Immunostaining en flowcytometriekarakterisering van iPSC-afgeleide CM's, EC's en CF's Om cardiale microtissues te genereren die bestaan uit iPSC-CMs, iPSC-EC's en iPSC-CFs, worden alle drie de celtypen afzonderlijk gedifferentieerd en gekarakteriseerd. De in vitro differentiatie van iPSC's naar iPSC-CM's is de afgelopen jaren verbeterd. De opbrengst en zuiverheid van iPSC-CMs verschillen echter van lijn tot lijn. Het huidige protocol levert meer dan 75% zuivere iPSC-CMs op die rond dag 9 spon...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells at JoVE.com

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Hier beschrijven we een eenvoudig te gebruiken methodologie om 3D zelfgeassembleerde cardiale microtissue-arrays te genereren die zijn samengesteld uit vooraf gedifferentieerde door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen. Deze gebruiksvriendelijke en laagcellige techniek die nodig is om cardiale microtissues te genereren, kan worden geïmplementeerd voor ziektemodellering en vroege stadia van medicijnontwikkeling.

Fabricage van 3D cardiale microtissue arrays met behulp van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Het protocol combineert de kracht van het genereren van menselijke cardiovasculaire celtypen met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcellen en een veelzijdige techniek om kloppende cardiale sferoïden in minder dan 72 uur te genereren. Deze cardiale sferoïden kunnen worden gebruikt voor ziektemodellering en drugstests. Een van de belangrijkste voordelen van deze gemakkelijke techniek is dat men bijna 1000 kloppende cardiale sferoïden zou kunnen genereren in een standaard 12-well plaat.En het belangrijkste is dat elke cardiale sferoïde kan worden getest op zijn contractiele functie met behulp van op beeldvorming gebaseerde techniek. Na het smelten van agarose in de magnetron, plaats het in de bioveiligheidskast en laat het drie minuten afkoelen. Pipetteer 700 microliter van de gesmolten agarose en voeg deze toe aan de siliconen micromold van een negen bij negen array, waarbij u ervoor zorgt dat er geen bubbels ontstaan.Plaats de mal voorzichtig op het pre-koude ijsblok om de agarose-duur te versnellen. Zodra de agarose doorschijnend wordt, buigt u voorzichtig de randen van de micromold om de agarose-replica te verliezen en pelt u de replica voorzichtig van alle kanten om deze los te maken van de siliconenmicromold. Breng de agarose microtissue tray met 81 cirkelvormige uitsparingen over in een steriele 12-well plaat, voeg vervolgens twee milliliter PBS toe aan de agarose microtissue tray en inspecteer deze onder de microscoop op opgesloten bubbels of onregelmatig gevormde putten.Dompel de agarose-tray een nacht onder in twee milliliter 70% ethanol, gevolgd door een UV-behandeling in de bioveiligheidskast gedurende een uur. Verwijder de 70% ethanol en was tweemaal met gedestilleerd water en eenmaal met twee milliliter PBS. Zodra de geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen zijn geteld na trypsinisatie en neutralisatie, plaatst u de celsuspensies op het ijs.Meng in een nieuwe buis de geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen. Verwijder vervolgens de PBS uit de put en de celzaaikamer zonder de uitsparingen aan te raken en voeg druppelsgewijs 200 microliter van de celsuspensie toe. Laat de cellen twee uur lang bij 37 graden Celsius bezinken in een kooldioxide-incubator.Voeg microweefselfabricagemiddel toe rond de agarose-mal om het oppervlak van de binnenkamer te bedekken. Let na 24 uur op zelfgeassembleerde en compacte sferoïden in de cirkelvormige uitsparingen. Vervang het medium om de twee dagen om de sferoïden te behouden.Meestal kan na 48 uur spontaan kloppen van de sferoïden worden waargenomen. Kweek de afzonderlijke celtypen afzonderlijk op het medium van de keldermembraanmatrix of met gelatine beklede kamerglaasjes. Spoel de cardiale microtissues voorzichtig uit de cirkelvormige uitsparingen en verzamel ze in een kroniekbuis van 15 milliliter.Zuig het medium op en spoel de cellen of de microtissues met één milliliter PBS. Fixeer vervolgens de cellen of de microtissues met een fixatiebuffer met 4,2% PFA en incubeer bij kamertemperatuur. Zuig de PFA op en incubeer de cellen of de microtissues met één milliliter permeabiliserende oplossing.Zuig vervolgens de oplossing aan en spoel af met twee tot drie milliliter PBS. Voeg 500 tot 1000 microliter blokkerende oplossing toe aan de cellen en incubeer gedurende ten minste één uur voor de kamerglaasjes en gedurende drie tot vier uur voor de microtissues. Incubeer de monsters met geconjugeerde antilichamen in de blokkerende oplossing gedurende één uur voor de kamerglijbanen en 's nachts bij vier graden Celsius voor de cardiale microtissues.Was de kamerglijden drie keer met 500 microliter van 0,1% Tween 20, met vijf minuten tussen elke wasbeurt, en voer vervolgens een laatste wasbeurt uit met PBS. Was de cardiale microweefsels vijf keer met twee milliliter van 0,1% Tween 20, met een duur van 20 minuten tussen elke wasbeurt. Voer vervolgens nog eens 20 minuten een laatste wasbeurt uit.Incubeer de cellen of de microtissues met DAPI voorafgaand aan confocale microscopie, breng vervolgens de cardiale microtissues voorzichtig over naar een 35 millimeter glazen bodemschaal en voeg PBS toe om de microtissue onder te dompelen. Spoel de microtissues uit de ronde uitsparingen met medium één met behulp van een brede of één milliliter pipetpunt in een 15 milliliter chronical tube en laat ze bezinken. Aspiraleer vervolgens het medium en spoel af met één milliliter PBS.Voeg 200 tot 300 microliter van de enzymverteringsbuffer toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Meng vervolgens de microtissues zachtjes gedurende één minuut en herhaal de incubatie. Meng na de incubatie de microtissues krachtig met een gewone pipetpunt van één milliliter om het in afzonderlijke cellen te verteren.Verkrijg een troebele celsuspensie en neutraliseer de celsuspensie onmiddellijk met vijf milliliter medium dat 5% FBS bevat. Zeef de celsuspensie door een celzeef van 40 micrometer en tel het totale aantal cellen. Centrifugeer de eencellige suspensie gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius op 300 maal G.Zuig het supernatant op en resuspend de cellen in annexinebindende buffer met FITC Annexin V en propidiumjodide, of TO-PRO-3 dode cel uitsluitingskleurstof, en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Voeg na de incubatie 300 microliter van de annexinebindingsbuffer toe aan de celsuspensie en breng deze over naar een FACS-buis met ronde bodem voor flowcytometrie-analyse. Gezuiverde geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten, endotheelcellen en cardiale fibroblasten werden gevisualiseerd met behulp van fasecontrastmicroscopie.De zuiverheid van verschillende celtypen werd bepaald met behulp van immunokleuring en flowcytometrie. Troponine T werd gebruikt als marker voor cardiomyocyten en meer dan 90% zuiverheid werd bereikt. Het bloedplaatjes-endotheelceladhesiemolecuul CD31 en vimentine werden gebruikt als markers voor endotheelcellen en cardiale fibroblasten en gaven een zuiverheid aan van respectievelijk 98 en 96%.Immunofluorescentiekleuring onthulde dat de cardiomyocyten het zwaarst waren en het centrum van de microtissues bezetten, terwijl de endotheelcellen werden afgewisseld door de microtissues en de cardiale fibroblasten voornamelijk de periferie bezetten. De vertering van de microtissues met behulp van dit tempo één en Liberase TL resulteerde in zeer levensvatbare celverhoudingen met minder apoptotische cellen na twee weken in cultuur. De één uur blootstelling van de cardiale microtissues aan een hoge concentratie doxorubicine geïnduceerde dosisafhankelijke cardiotoxiciteit.De contractiliteit van de microweefsels en de beweging van de vectoren genereerden een pseudo-heatmap die het gemiddelde contractieprofiel over de microtissue illustreerde. De contractiele beweging van de cardiale microtissues genereerde positieve pieken die werden gemeten als de contractiesnelheid, de relaxatiesnelheid en de slagsnelheid, die werd berekend als tijd de tussen twee contractiecycli. De contractiliteit van de cardiale microtissues was consistent gedurende vier weken in cultuur.Celverwarming is een van de belangrijkste stappen in dit specifieke protocol, waarbij men ervoor moet zorgen dat de celsuspensie druppelsgewijs in de agarose-array wordt gedoseerd voor een gelijkmatige verdeling binnen de microwells en om overloop te voorkomen. Met behulp van het geoptimaliseerde stralingsprotocol van deze microtissues, zou men deze kunnen onderwerpen aan high throughput sequencing-technologieën, zoals single cell RNA-seq of single cell ATAC-seq om celspecifieke genexpressiepatronen te begrijpen die het gevolg zijn van verschillende behandelingsomstandigheden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Inkapseling van hartspiercellen in een fibrine Hydrogel voor Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Anatomische Reconstructies van de Mens Cardiac veneuze systeem met contrastdetectie computertomografie van perfusie-vaste Monsters

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Het creëren van cardiale weefsels die mechanische integratie van sferoïden tonen met behulp van 3D bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

Met behulp van buitengewone optische transmissie te kwantificeren cardiale Biomarkers in menselijk Serum

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocol voor MicroRNA overdracht naar volwassen beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen om cel Engineering gecombineerd met magnetische Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Een netto schimmel gebaseerde methode van de steiger-free driedimensionale cardiale weefsel schepping

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Gestandaardiseerde en schaalbare assay voor het bestuderen van Perfused 3D-angiogene kiemen van door iPSC afgeleide endotheliale cellen in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Humane iPSC-afgeleide cardiomyocyte netwerken op multi well micro-elektrode arrays voor terugkerende actie potentiële opnames

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Preklinische Cardiale Elektrofysiologie Beoordeling door Dual Voltage en Calcium Optical Mapping van human organotypic cardiale plakjes

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...