Name: fabrication of 3d cardiac microtissue arrays using human ipsc-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells
Uploaded: 2021-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells at JoVE.com

Ringraziamo la dottoressa Amanda Chase per il suo utile feedback sul manoscritto. Il sostegno finanziario è stato fornito dal Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) dell'Università della California, T29FT0380 (D.T.) e 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) e 17MERIT33610009 (J.C.W.); e National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 e NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

1. Preparazione del mezzo, reagente, piastra di coltura
<ol><li>Soluzione di lavaggio cellulare per colture cellulari: utilizzare 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS) senza calcio o magnesio.</li>
	<li>Mezzi di differenziazione dei cardiomiociti<ol>
<li>Preparare il mezzo di differenziazione #1 aggiungendo 10 mL di integratore (50x B27 più insulina) a 500 mL di terreno basale cardiomiocitario (RPMI 1640).</li>
		<li>Preparare il mezzo di differenziazione #2 aggiunge...

<ol>
	<li>Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hurdles+to+clinical+translation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 156166 (2018).</li><li>Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stem+cell+organoids.">Engineering stem cell organoids.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cardiac+microtissues+composed+of+cardiomyocytes+and+endothelial+cells+co-differentiated+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).</li><li>Kurokawa, Y. K., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+the+cardiac+microenvironment:+Multicellular+microphysiological+systems+for+drug+screening.">Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).</li><li>Cartledge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+crosstalk+between+cardiac+fibroblasts+and+adult+cardiomyocytes+by+soluble+mediators.">Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators.</a> Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).</li><li>Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+non-myocyte+cells+show+enhanced+pharmacological+function+suggestive+of+contractile+maturity+in+stem+cell+derived+cardiomyocyte+microtissues.">Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues.</a> Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Brutsaert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+endothelial-myocardial+signaling:+its+role+in+cardiac+growth,+contractile+performance,+and+rhythmicity.">Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity.</a> Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).</li><li>Huebsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+video-based+analysis+of+contractility+and+calcium+flux+in+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+cultured+over+different+spatial+scales.">Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pravastatin+reverses+obesity-induced+dysfunction+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+via+a+nitric+oxide-dependent+mechanism.">Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism.</a> European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).</li><li>Williams, I. M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).</li><li>Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 1-7 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+in+vitro+modeling+of+cardiac+fibrosis.">Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis.</a> Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+via+second+heart+field+progenitors.">Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors.</a> Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-iPSC-derived+cardiac+stromal+cells+enhance+maturation+in+3d+cardiac+microtissues+and+reveal+non-cardiomyocyte+contributions+to+heart+disease.">Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease.</a> Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).</li><li>Burridge, P. W., Holmstr&#246;m, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+culture+and+cardiomyocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/&#946;-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/&#946;-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+Advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+expression+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-+and+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells.">Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells.</a> Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Gu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+cells.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).</li><li>Acharya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+transcription+factor+Tcf21+is+required+for+lineage-specific+EMT+of+cardiac+fibroblast+progenitors.">The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors.</a> Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).</li><li>Wessels, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardially+derived+fibroblasts+preferentially+contribute+to+the+parietal+leaflets+of+the+atrioventricular+valves+in+the+murine+heart.">Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart.</a> Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).</li><li>Ali, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+heterogeneity+of+cardiac+fibroblasts+does+not+predict+pathological+proliferation+and+activation.">Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation.</a> Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).</li><li>McMurtrey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytic+and+numerical+models+of+oxygen+and+nutrient+diffusion,+metabolism+dynamics,+and+architecture+optimization+in+three-dimensional+tissue+constructs+with+applications+and+insights+in+cerebral+organoids.">Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids.</a> Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).</li><li>Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+customized+extracellular+niche+engineering:+progress+in+cell-entrapment+technologies.">Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies.</a> Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).</li><li>Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+Multi-dimensional+induced+pluripotent+stem+cells-based+model+platforms+to+assess+cardiotoxicity+in+cancer+therapies.">Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies.</a> Front Pharmacol. 12, 39 (2021).</li><li>Rhee, J. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+secondary+iron+overload+cardiomyopathy+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).</li><li>Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+in+cardiovascular+development,+disease,+and+medicine.">Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).</li><li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+considerations+for+single-cell+RNA+sequencing+approaches.">Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).</li><li>Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-wide+approaches+in+induced+pluripotent+stem+cell+models.">Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models.</a> Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).</li><li>Maddah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+platform+for+functional+characterization+of+stem-cell-derived+cardiomyocytes+with+applications+in+cardiotoxicity+testing.">A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing.</a> Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).</li><li>Sala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Musclemotion:+A+versatile+open+software+tool+to+quantify+cardiomyocyte+and+cardiac+muscle+contraction+in+vitro+and+in+vivo.">Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).</li></ol>

Per generare microtessuti cardiaci da iPSC-CM pres differenziati, iPSC-EC e iPSC-CF, è essenziale ottenere una coltura altamente pura per un migliore controllo del numero di cellule dopo la compattazione cellulare inibita dal contatto all'interno dei microtessuti cardiaci. Recentemente, Giacomelli et. al.18 hanno dimostrato la fabbricazione di microtissue cardiaci utilizzando iPSC-CM, iPSC-EC e iPSC-CF. I microsessu cardiaci generati utilizzando il metodo descritto sono costituiti da ~ 5.000 cell...

La scoperta di farmaci e la modellazione delle malattie nel campo della ricerca cardiovascolare devono affrontare diverse sfide a causa della mancanza di campioni clinicamente rilevanti e di strumenti traslazionali inadeguati1. Modelli pre-clinici altamente complessi o modelli monocellulari in vitro troppo semplificati non presentano condizioni fisiopatologiche in modo riproducibile. Pertanto, diverse piattaforme miniaturizzate di ingegneria tissutale si sono evolute per contribuire a colmare il divario, con l'obiettivo di raggiungere un equilibrio tra facilità di applicazione in modo ad alta produttività e fedele ricapitolazione della funzione tissutale2,3. Con l'avvento della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), gli strumenti di ingegneria tissutale possono essere applicati a cellule specifiche del paziente con o senza stato di malattia cardiovascolare sottostante per rispondere alle domande di ricerca4,5,6. Tali modelli di ingegneria tissutale con composizione cellulare simile al tessuto cardiaco potrebbero essere utilizzati negli sforzi di sviluppo di farmaci per testare la cardiotossicità e la disfunzione indotte da cambiamenti patologici nel comportamento di uno o più tipi di cellule.
I microtessuti o organoidi autoassemblati derivati da iPSC umane sono strutture tridimensionali (3D) che sono assemblaggi simili a tessuti in miniatura che presentano somiglianze funzionali con le loro controparti in vivo. Esistono diversi approcci che consentono la formazione di organoidi in situ attraverso la differenziazione diretta di iPSC o attraverso la formazione di corpi embrioidi4. Gli organoidi risultanti sono uno strumento indispensabile per studiare i processi morfogenetici che guidano l'organogenesi. Tuttavia, la presenza di una varietà di popolazioni cellulari e le differenze nell'auto-organizzazione possono portare a variabilità nei risultati tra diversi organoidi5. In alternativa, le cellule prese differenziate che sono auto-assemblate in microtessuti con tipi di cellule tessuto-specifiche per studiare le interazioni cellula-cellula locali sono modelli eccellenti, in cui è possibile isolare i componenti autoassemblati. In particolare nella ricerca cardiaca umana, lo sviluppo di microtessuti cardiaci 3D con componenti multicellulari si è dimostrato impegnativo quando le cellule sono derivate da diverse linee di pazienti o fonti commerciali.
Per migliorare la nostra comprensione meccanicistica dei comportamenti cellulari in un modello fisiologicamente rilevante, personalizzato, in vitro, idealmente tutti i tipi di cellule componenti dovrebbero essere derivati dalla stessa linea di pazienti. Nel contesto di un cuore umano, un modello cardiaco in vitro veramente rappresentativo catturerebbe la diafonia tra i tipi di cellule predominanti, vale a dire, cardiomiociti (CM), cellule endoteliali (EC) e fibroblasti cardiaci (CF)6,7. La ricapitolazione fedele di un miocardio non richiede solo un allungamento biofisico e una stimolazione elettrofisiologica, ma anche la segnalazione cellula-cellula che deriva da tipi di cellule di supporto come EC e CF8. I CF sono coinvolti nella sintesi della matrice extracellulare e nel mantenimento della struttura tissutale; e in uno stato patologico, i CF possono indurre fibrosi e alterare la conduzione elettrica nei CM9. Allo stesso modo, le CE possono regolare le proprietà contrattili delle CM attraverso la segnalazione paracrina e fornendo richieste metaboliche vitali10. Quindi, c'è bisogno di microtessuti cardiaci umani composti da tutti e tre i principali tipi di cellule per consentire di condurre esperimenti ad alto rendimento fisiologicamente rilevanti.
Qui, descriviamo un approccio bottom-up nella fabbricazione di microtissue cardiaci per derivazione di cardiomiociti umani derivati da iPSC (iPSC-CM), cellule endoteliali derivate da iPSC (iPSC-EC) e fibroblasti cardiaci derivati da iPSC (iPSC-CF) e la loro coltura 3D in array di microtissue cardiaci uniformi. Questo facile metodo di generazione di microtessuti cardiaci che battono spontaneamente può essere utilizzato per la modellazione della malattia e la sperimentazione rapida di farmaci per la comprensione funzionale e meccanicistica della fisiologia cardiaca. Inoltre, tali piattaforme di microtessuto cardiaco multicellulare potrebbero essere sfruttate con tecniche di editing del genoma per emulare la progressione della malattia cardiaca nel tempo in condizioni di coltura cronica o acuta.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D micro-molds</td>
			<td>Microtissues</td>
			<td>12-81 format</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9104697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement minus Insulin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement plus Insulin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel, hESC-qualified matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin T Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-120-403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-110-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDR2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-81707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V13242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>4942086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium</td>
			<td></td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 basal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit</td>
			<td>LifeLIne Cell Technology</td>
			<td>LS-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose free RPMI medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11879-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF-165</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1-endo</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Sorting Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Rinsing Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11835055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>red</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin Alexa Fluor&#174; 488-conjugated Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC2105G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of 3d cardiac microtissue arrays using human ipsc-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells

La generazione di cardiomiociti umani (CM), fibroblasti cardiaci (CF) e cellule endoteliali (EC) da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) ha fornito un'opportunità unica per studiare la complessa interazione tra diversi tipi di cellule cardiovascolari che guida lo sviluppo e la malattia dei tessuti. Nell'area dei modelli di tessuto cardiaco, diversi sofisticati approcci tridimensionali (3D) utilizzano cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC-CM) per imitare la rilevanza fisiologica e l'ambiente tissutale nativo con una combinazione di matrici extracellulari e reticolanti. Tuttavia, questi sistemi sono complessi da fabbricare senza competenze di microfabbricazione e richiedono diverse settimane per auto-assemblarsi. Ancora più importante, molti di questi sistemi mancano di cellule vascolari e fibroblasti cardiaci che costituiscono oltre il 60% dei non miociti nel cuore umano. Qui descriviamo la derivazione di tutti e tre i tipi di cellule cardiache dalle iPSC per fabbricare microtessuti cardiaci. Questa facile tecnica di stampaggio replica consente la coltura di microtessuti cardiaci in piastre di coltura cellulare multi-pozzo standard per diverse settimane. La piattaforma consente un controllo definito dall'utente sulle dimensioni delle microtissue in base alla densità iniziale di semina e richiede meno di 3 giorni per l'autoassemblaggio per ottenere contrazioni cardiache del microtissueo osservabili. Inoltre, i microtessuti cardiaci possono essere facilmente digeriti mantenendo un'elevata vitalità cellulare per l'interrogazione monocellulare con l'uso della citometria a flusso e del sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq). Prevediamo che questo modello in vitro di microtessuti cardiaci contribuirà ad accelerare gli studi di convalida nella scoperta di farmaci e nella modellazione delle malattie.

Caratterizzazione immunocolorante e citometria a flusso di CM, EC e CF derivati da iPSC Per generare microtessuti cardiaci composti da iPSC-CM, iPSC-EC e iPSC-CF, tutti e tre i tipi di cellule sono differenziati e caratterizzati individualmente. La differenziazione in vitro delle iPSC in iPSC-CM è migliorata negli ultimi anni. Tuttavia, la resa e la purezza degli iPSC-CM differiscono da linea a linea. L'attuale protocollo produce oltre il 75% di iPSC-CM puri che iniziano spontaneamente a bat...

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Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Qui, descriviamo una metodologia facile da usare per generare array di microtessuti cardiaci auto-assemblati 3D composti da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti preseferenziate indotte dall'uomo, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali. Questa tecnica user-friendly e a bassa richiesta cellulare per generare microtessuti cardiaci può essere implementata per la modellazione della malattia e le prime fasi dello sviluppo del farmaco.

Fabbricazione di array di microtissue cardiaci 3D utilizzando cardiomiociti derivati da iPSC umani, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Il protocollo combina il potere di generare tipi di cellule cardiovascolari umane utilizzando cellule staminali pluripotenti indotte e una tecnica versatile per generare sferoidi cardiaci battenti in meno di 72 ore. Questi sferoidi cardiaci possono essere utilizzati per la modellazione della malattia e test antidroga. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica facile è che si potrebbero generare quasi 1000 sferoidi cardiaci battenti in una piastra standard a 12 pozzetti.E, soprattutto, ogni sferoide cardiaco può essere testato per la sua funzione contrattile utilizzando la tecnica basata sull'imaging. Dopo aver sciolto l'agarosio nel microonde, metterlo nell'armadio di biosicurezza e lasciarlo raffreddare per tre minuti. Pipettare 700 microlitri dell'agarosio fuso e aggiungerlo al microstampo siliconico di un array nove per nove, avendo cura di evitare di generare bolle.Posizionare con attenzione lo stampo sul blocco di ghiaccio pre-freddo per accelerare la durata dell'agarosio. Una volta che l'agarosio diventa traslucido, piegare con attenzione i bordi del microstampo per losen la replica di agarosio e staccare delicatamente la replica da tutti i lati per staccarla dal microstampo di silicone. Trasferire il vassoio di microtessuta di agarosio contenente 81 recessi circolari in una piastra sterile a 12 pozzetti, quindi aggiungere due millilitri di PBS al vassoio di microtessuta di agarosio e ispezionarlo al microscopio per eventuali bolle intrappolate o pozzi di forma irregolare.Immergere il vassoio di agarosio in due millilitri di etanolo al 70% durante la notte, seguito dal trattamento UV nell'armadio di biosicurezza per un'ora. Rimuovere il 70% di etanolo e lavare due volte con acqua distillata e una volta con due millilitri di PBS. Una volta che i cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte, i fibroblasti cardiaci e le cellule endoteliali vengono contati dopo la tripsinizzazione e la neutralizzazione, posizionare le sospensioni cellulari sul ghiaccio.In un nuovo tubo, mescolare i cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte, i fibroblasti cardiaci e le cellule endoteliali. Quindi, rimuovere il PBS dal pozzo e dalla camera di semina cellulare senza toccare i recessi e aggiungere 200 microlitri della sospensione cellulare a goccia. Lasciare che le cellule si depositino a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica per due ore.Aggiungere il mezzo di fabbricazione di micro tessuto che circonda lo stampo di agarosio per coprire la superficie della camera interna. Dopo 24 ore, osservare per sferoidi autoassemblati e compatti nei recessi circolari. Cambiare il mezzo ogni due giorni per mantenere gli sferoidi.Tipicamente, dopo 48 ore, si può osservare un battito spontaneo degli sferoidi. Coltivare i singoli tipi di cellule separatamente su un mezzo a matrice di membrana basale o vetrini a camera rivestiti di gelatina. Lavare delicatamente i microtessuti cardiaci dai recessi circolari e raccoglierli in un tubo di cronaca da 15 millilitri.Aspirare il mezzo e risciacquare le cellule o i microtessuti, con un millilitro di PBS. Quindi, fissare le cellule o i microtessuti con tampone di fissazione contenente il 4,2% di PFA e incubare a temperatura ambiente. Aspirare il PFA e incubare le cellule o i microtessuti con un millilitro di soluzione permeabilizzante.Quindi, aspirare la soluzione e risciacquare con due o tre millilitri di PBS. Aggiungere da 500 a 1000 microlitri di soluzione bloccante alle cellule e incubare per almeno un'ora per i vetrini della camera e per tre o quattro ore per i microtessuti. Incubare i campioni con anticorpi coniugati nella soluzione bloccante per un'ora per i vetrini della camera e durante la notte a quattro gradi Celsius per i microtessuti cardiaci.Lavare le diapositive della camera tre volte con 500 microlitri dello 0,1% Tween 20, con una durata di cinque minuti tra ogni lavaggio, quindi eseguire un lavaggio finale con PBS. Lavare i micro tessuti cardiaci cinque volte con due millilitri dello 0,1% Tween 20, con una durata di 20 minuti tra ogni lavaggio. Quindi, eseguire un lavaggio finale per altri 20 minuti.Incubare le cellule o i microtessuti con DAPI prima della microscopia confocale, quindi trasferire con cura i microtessuti cardiaci su un piatto di fondo di vetro da 35 millimetri e aggiungere PBS per immergere il microtessuto. Sciacquare i microtessuti dai recessi circolari con uno medio usando una punta di pipetta larga o di un millilitro in un tubo cronico da 15 millilitri e lasciarli depositare. Quindi, aspirare il mezzo e risciacquare con un millilitro PBS.Aggiungere da 200 a 300 microlitri del tampone di digestione enzimatica e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi mescolare delicatamente i microtessuti per un minuto e ripetere l'incubazione. Dopo l'incubazione, mescolare vigorosamente i microtessuti con una punta di pipetta normale da un millilitro per digerirlo in singole cellule.Ottenere una sospensione a cellule torbide e neutralizzare immediatamente la sospensione cellulare con cinque millilitri di mezzo contenenti il 5% di FBS. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri e contare il numero totale di cellule. Centrifugare la sospensione monocellulare a 300 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Aspirare il surnatante e risospesare le cellule nel tampone legante l'annessina con FITC Annexin V e ioduro di propidio, o colorante di esclusione delle cellule morte TO-PRO-3, e incubare per 10 minuti sul ghiaccio. Dopo l'incubazione, aggiungere 300 microlitri del tampone legante l'annessina alla sospensione cellulare e trasferirla in un tubo FACS a fondo tondo per l'analisi della citometria a flusso. Cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte purificate, cellule endoteliali e fibroblasti cardiaci sono stati visualizzati utilizzando la microscopia a contrasto di fase.La purezza di diversi tipi di cellule è stata determinata utilizzando la colorazione immuno e la citometria a flusso. La troponina T è stata utilizzata come marcatore per i cardiomiociti ed è stata raggiunta una purezza superiore al 90%. La molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche CD31 e la vimentina sono state utilizzate come marcatori per le cellule endoteliali e i fibroblasti cardiaci e hanno indicato una purezza superiore rispettivamente al 98 e al 96%.La colorazione di immunofluorescenza ha rivelato che i cardiomiociti erano i più pesanti e occupavano il centro dei microtessuti, mentre le cellule endoteliali erano intervallate in tutti i microsucchi e i fibroblasti cardiaci occupavano prevalentemente la periferia. La digestione dei microtessuti utilizzando questo ritmo uno e Liberase TL ha portato a proporzioni cellulari altamente vitali con meno cellule apoptotiche dopo due settimane in coltura. L'esposizione di un'ora dei microtessuti cardiaci ad un'alta concentrazione di doxorubicina ha indotto cardiotossicità dose-dipendente.La contrattilità dei micro tessuti e il movimento dei vettori hanno generato una pseudo mappa termica che ha illustrato il profilo di contrazione media attraverso il microtessuto. Il moto contrattile dei microtessuti cardiaci ha generato picchi positivi che sono stati misurati come la velocità di contrazione, la velocità di rilassamento e la frequenza di battito, che è stata calcolata come tempo tra due cicli di contrazione. La contrattilità dei microtessuti cardiaci è stata costante per quattro settimane in coltura.Il riscaldamento delle celle è uno dei passaggi più importanti in questo particolare protocollo, in cui si deve fare attenzione a erogare con cura la sospensione cellulare dropwise nell'array di agarosio per una distribuzione uniforme all'interno dei micro pozzetti e per prevenire il trabocco. Utilizzando il protocollo di radiazione ottimizzato di questi microtessuti, si potrebbe sottoporli a tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento, come RNA-seq a singola cellula o ATAC-seq a cellula singola per comprendere i modelli di espressione genica specifici della cellula risultanti a causa di diverse condizioni di trattamento.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Incapsulamento di cardiomiociti in un idrogel di fibrina per l&#39;ingegneria tissutale cardiaca

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Ricerca

Bioingegneria

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Ricostruzioni anatomiche del sistema umano venoso cardiaco utilizzando Contrasto-tomografia computerizzata di campioni di perfusione-fissi

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Creazione di tessuto cardiaco che mostra l&#39;integrazione meccanica degli spheroidi usando la biopittura 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

Utilizzando la trasmissione ottica straordinaria per quantificare i biomarcatori cardiaci nel siero umano

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocollo per il trasferimento di MicroRNA in adulto cellule staminali emopoietiche derivate da midollo osseo per abilitare ingegneria cellulare combinata con il Targeting magnetico

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Un metodo basato su stampo netto della creazione senza impalcatura tridimensionale del tessuto cardiaco

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Analisi standardizzata e scalabile per studiare la germogliazione angiogenica 3D perfusa di cellule endoteliali derivate da iPSC in Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Reti di cardiomiociti derivati da umani da iPSC su array di microelettrodi multiwell per registrazioni di potenziali azioni ricorrenti

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Valutazione elettrofisiologia cardiaca preclinica mediante mappatura ottica a doppia tensione e calcio delle fette cardiache di organitypica umana

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...