Name: fabrication of 3d cardiac microtissue arrays using human ipsc-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells
Uploaded: 2021-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells at JoVE.com

アマンダ・チェイス博士の原稿に関する有益なフィードバックに感謝します。資金援助は、カリフォルニア大学T29FT0380(D.T.)および27IR-0012(J.C.W.)のタバコ関連疾患研究プログラム(TRDRP)によって提供された。米国心臓協会20POST35210896(香港)および17MERIT33610009(J.C.W.);国立衛生研究所(NIH)R01 HL126527、R01 HL123968、R01 HL150693、 R01 HL141851、およびNIH UH3 TR002588(J.C.W)。

培地、試薬、培養プレート調製
<ol><li>細胞培養用の細胞洗浄溶液:カルシウムまたはマグネシウムを含まない1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)またはハンクス平衡塩溶液(HBSS)を使用する。</li>
	<li>心筋細胞分化培地<ol>
<li>500 mLの心筋細胞基礎培地(RPMI 1640)に10 mLサプリメント(50x B27 + インスリン)を加えて分化培地#1を調製する。</li>
		<li>500 mLの心筋細胞基礎培地(RPMI 1640)に10 mLサプリメント(50x B27マイ?...

<ol>
	<li>Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hurdles+to+clinical+translation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 156166 (2018).</li><li>Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stem+cell+organoids.">Engineering stem cell organoids.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cardiac+microtissues+composed+of+cardiomyocytes+and+endothelial+cells+co-differentiated+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).</li><li>Kurokawa, Y. K., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+the+cardiac+microenvironment:+Multicellular+microphysiological+systems+for+drug+screening.">Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).</li><li>Cartledge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+crosstalk+between+cardiac+fibroblasts+and+adult+cardiomyocytes+by+soluble+mediators.">Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators.</a> Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).</li><li>Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+non-myocyte+cells+show+enhanced+pharmacological+function+suggestive+of+contractile+maturity+in+stem+cell+derived+cardiomyocyte+microtissues.">Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues.</a> Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Brutsaert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+endothelial-myocardial+signaling:+its+role+in+cardiac+growth,+contractile+performance,+and+rhythmicity.">Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity.</a> Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).</li><li>Huebsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+video-based+analysis+of+contractility+and+calcium+flux+in+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+cultured+over+different+spatial+scales.">Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pravastatin+reverses+obesity-induced+dysfunction+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+via+a+nitric+oxide-dependent+mechanism.">Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism.</a> European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).</li><li>Williams, I. M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).</li><li>Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 1-7 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+in+vitro+modeling+of+cardiac+fibrosis.">Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis.</a> Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+via+second+heart+field+progenitors.">Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors.</a> Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-iPSC-derived+cardiac+stromal+cells+enhance+maturation+in+3d+cardiac+microtissues+and+reveal+non-cardiomyocyte+contributions+to+heart+disease.">Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease.</a> Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).</li><li>Burridge, P. W., Holmstr&#246;m, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+culture+and+cardiomyocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/&#946;-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/&#946;-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+Advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+expression+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-+and+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells.">Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells.</a> Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Gu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+cells.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).</li><li>Acharya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+transcription+factor+Tcf21+is+required+for+lineage-specific+EMT+of+cardiac+fibroblast+progenitors.">The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors.</a> Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).</li><li>Wessels, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardially+derived+fibroblasts+preferentially+contribute+to+the+parietal+leaflets+of+the+atrioventricular+valves+in+the+murine+heart.">Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart.</a> Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).</li><li>Ali, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+heterogeneity+of+cardiac+fibroblasts+does+not+predict+pathological+proliferation+and+activation.">Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation.</a> Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).</li><li>McMurtrey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytic+and+numerical+models+of+oxygen+and+nutrient+diffusion,+metabolism+dynamics,+and+architecture+optimization+in+three-dimensional+tissue+constructs+with+applications+and+insights+in+cerebral+organoids.">Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids.</a> Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).</li><li>Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+customized+extracellular+niche+engineering:+progress+in+cell-entrapment+technologies.">Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies.</a> Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).</li><li>Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+Multi-dimensional+induced+pluripotent+stem+cells-based+model+platforms+to+assess+cardiotoxicity+in+cancer+therapies.">Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies.</a> Front Pharmacol. 12, 39 (2021).</li><li>Rhee, J. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+secondary+iron+overload+cardiomyopathy+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).</li><li>Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+in+cardiovascular+development,+disease,+and+medicine.">Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).</li><li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+considerations+for+single-cell+RNA+sequencing+approaches.">Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).</li><li>Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-wide+approaches+in+induced+pluripotent+stem+cell+models.">Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models.</a> Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).</li><li>Maddah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+platform+for+functional+characterization+of+stem-cell-derived+cardiomyocytes+with+applications+in+cardiotoxicity+testing.">A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing.</a> Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).</li><li>Sala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Musclemotion:+A+versatile+open+software+tool+to+quantify+cardiomyocyte+and+cardiac+muscle+contraction+in+vitro+and+in+vivo.">Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).</li></ol>

分化前のiPSC-CM、iPSC-EC、およびiPSC-CFから心臓ミクロ組織を生成するためには、心臓ミクロ組織内での接触阻害細胞圧縮後の細胞数をよりよく制御するために、高純度の培養物を得ることが不可欠である。最近、ジャコメッリら。al.18 は、iPSC-CM、iPSC-EC、およびiPSC-CFを用いた心臓微小組織の作製を実証している。記載された方法を用いて生成された心臓微小組織は、〜5,000個?...

心臓血管研究の分野における創薬と疾患モデリングは、臨床的に関連するサンプルの不足と不十分なトランスレーショナルツール1のために、いくつかの課題に直面しています。高度に複雑な前臨床モデルまたは過度に単純化されたインビトロ単一細胞モデルは、再現可能な方法で病態生理学的状態を示さない。したがって、いくつかの小型化された組織工学プラットフォームは、ハイスループットな方法での適用の容易さと組織機能の忠実な反復との間のバランスを達成することを目標に、ギャップを埋めるのを助けるために進化してきました2,3。人工多能性幹細胞(iPSC)技術の出現により、組織工学ツールを心血管疾患状態の有無にかかわらず患者固有の細胞に適用して、研究上の質問に答えることができます4,5,6。心臓組織に類似した細胞組成を有するこのような組織操作モデルは、1つまたは複数の細胞型の挙動における病理学的変化によって誘発される心毒性および機能障害について試験するための医薬品開発努力において利用され得る。
ヒトiPSCに由来する自己組織化ミクロ組織またはオルガノイドは、 インビボ対応 物と機能的類似性を示す小型組織様集合体である三次元(3D)構造である。iPS細胞の指向性分化または胚様体の形成を介して その場で オルガノイドを形成できるいくつかの異なるアプローチがある4。得られたオルガノイドは、有機生成を駆動する形態形成過程を研究するために不可欠なツールである。しかし、さまざまな細胞集団の存在と自己組織化の違いは、異なるオルガノイド間の転帰のばらつきにつながる可能性があります5。あるいは、局所的な細胞間相互作用を研究するために組織特異的細胞型を有するミクロ組織に自己組織化される前分化細胞は、優れたモデルであり、自己組織化成分を単離することが実行可能である。特にヒト心臓研究において、細胞が異なる患者系統または市販の供給源に由来する場合、多細胞成分を有する3D心臓微小組織の開発は困難であることが証明されている。
生理学的に関連性のある個別化されたin vitroモデルにおける細胞挙動の機構的理解を改善するためには、理想的には、すべての構成細胞型が同じ患者系統に由来するべきである。ヒトの心臓の文脈では、真に代表的な心臓in vitroモデルは、優勢な細胞型、すなわち心筋細胞(CM)、内皮細胞(EC)、および心臓線維芽細胞(CF)間のクロストークを捉えるだろう6,7。心筋の忠実な反復には、生物物理学的伸張と電気生理学的刺激だけでなく、ECやCFなどの細胞型をサポートすることから生じる細胞間シグナル伝達も必要です8。CFは、細胞外マトリックスの合成および組織構造の維持に関与している。病理学的状態では、CFは線維症を誘発し、CMs9の電気伝導を変化させることができる。同様に、ECはパラクリンシグナル伝達と重要な代謝要求の供給を通じてCMの収縮特性を調節することができます10。したがって、生理学的に関連するハイスループット実験を実施できるように、3つの主要な細胞型すべてで構成されるヒト心臓ミクロ組織が必要である。
ここでは、ヒトiPSC由来心筋細胞(iPSC-CM)、iPSC由来内皮細胞(iPSC-EC)、iPSC由来心臓線維芽細胞(iPSC-CF)の誘導による心臓微細組織の作製におけるボトムアップアプローチと、均一な心臓微小組織アレイにおけるそれらの3D培養について述べる。自発的に鼓動する心臓ミクロ組織を生成するこの容易な方法は、心臓生理機能の機能的および機構的理解のための疾患モデリングおよび薬物の迅速な試験に利用することができる。さらに、このような多細胞心臓マイクロ組織プラットフォームは、慢性または急性の培養条件下で経時的に心臓病の進行をエミュレートするために、ゲノム編集技術によって利用され得る。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D micro-molds</td>
			<td>Microtissues</td>
			<td>12-81 format</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9104697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement minus Insulin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement plus Insulin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel, hESC-qualified matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin T Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-120-403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-110-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDR2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-81707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V13242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>4942086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium</td>
			<td></td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 basal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit</td>
			<td>LifeLIne Cell Technology</td>
			<td>LS-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose free RPMI medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11879-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF-165</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1-endo</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Sorting Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Rinsing Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11835055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>red</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin Alexa Fluor&#174; 488-conjugated Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC2105G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of 3d cardiac microtissue arrays using human ipsc-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells

人工多能性幹細胞(iPSC)からのヒト心筋細胞(CM)、心臓線維芽細胞(CF)、および内皮細胞(EC)の生成は、組織発達および疾患を駆動する異なる心血管細胞型間の複雑な相互作用を研究するユニークな機会を提供してきた。心臓組織モデルの分野では、いくつかの洗練された三次元(3D)アプローチが、誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(iPSC-CM)を使用して、細胞外マトリックスと架橋剤の組み合わせで生理学的関連性と天然組織環境を模倣します。しかし、これらのシステムは、微細加工の専門知識なしで製造するのが複雑であり、自己組み立てに数週間かかります。最も重要なのは、これらのシステムの多くは、ヒト心臓の非筋細胞の60%以上を占める血管細胞および心臓線維芽細胞を欠いている。ここでは、心臓ミクロ組織を作製するためのiPSCsからの3つの心臓細胞型すべての導出について説明する。この容易なレプリカ成形技術により、標準的なマルチウェル細胞培養プレートで数週間心臓微小組織培養が可能になります。このプラットフォームは、初期播種密度に基づいてマイクロ組織サイズをユーザー定義で制御でき、観察可能な心臓マイクロ組織収縮を達成するために自己組織化に3日未満かかります。さらに、心臓ミクロ組織は、フローサイトメトリーおよび単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)の使用により、単一細胞尋問のための高い細胞生存率を維持しながら容易に消化することができる。心臓ミクロ組織のこの in vitro モデルは、創薬および疾患モデリングにおける検証研究の加速に役立つと想定しています。

iPSC由来のCM、EC、CFの免疫染色およびフローサイトメトリー特性評価 iPSC-CM、iPSC-EC、およびiPSC-CFからなる心臓ミクロ組織を生成するために、3つの細胞型すべてを分化させ、個々に特徴付ける。iPSCからiPSC-CMへのインビトロ分化は、過去数年間で改善されています。ただし、iPSC-CMの収率と純度はラインごとに異なります。現在のプロトコルでは、純度75%を超えるiPSC-CMが生?...

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Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

ここでは、分化前のヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、および内皮細胞からなる3D自己組織化心臓ミクロ組織アレイを生成するための使いやすい方法論について説明する。心臓ミクロ組織を生成するためにこのユーザーフレンドリーで低細胞を必要とする技術は、疾患モデリングおよび医薬品開発の初期段階に実装することができる。

ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、内皮細胞を用いた3次元心臓ミクロ組織アレイの作製

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

このプロトコルは、人工多能性幹細胞を使用してヒト心血管細胞型を生成する力と、72時間以内に鼓動性心臓スフェロイドを生成する汎用性の高い技術を組み合わせています。これらの心臓スフェロイドは、疾患モデリングおよび薬物検査に使用することができる。この容易な技術の主な利点の1つは、標準的な12ウェルプレートで約1000個の鼓動心臓スフェロイドを生成できることです。そして最も重要なのは、すべての心臓スフェロイドは、イメージングベースの技術を使用して、その収縮機能についてアッセイすることができるということです。電子レンジでアガロースを溶かした後、バイオセーフティキャビネットに入れ、3分間冷却します。溶融したアガロースを700マイクロリットルのピペットで、気泡を発生させないように注意しながら、9×9アレイのシリコーンマイクロモールドに加える。金型を冷蔵前の氷ブロックに慎重に置き、アガロースの持続時間を加速します。アガロースが半透明になったら、マイクロモールドの縁を慎重に曲げてアガロースのレプリカを失い、レプリカを四方から静かに剥がしてシリコーンマイクロモールドから取り外します。81個の円形凹部を含むアガロースマイクロティッシュトレイを滅菌12ウェルプレートに移し、次いで2ミリリットルのPBSをアガロースマイクロ組織トレイに加え、顕微鏡下で捕捉された気泡または不規則な形状のウェルがないか検査する。アガローストレイを2ミリリットルの70%エタノールに一晩浸漬し、続いてバイオセーフティキャビネットで1時間UV処理を行った。70%エタノールを取り出し、蒸留水で2回、および2ミリリットルのPBSで1回洗浄した。誘導多能性幹細胞由来心筋細胞、心線維芽細胞、及び内皮細胞をトリプシン処理及び中和後に計数したら、細胞懸濁液を氷上に置く。新しいチューブに、誘導多能性幹細胞由来心筋細胞、心線維芽細胞、内皮細胞を混合する。次いで、凹部に触れることなくウェルおよび細胞播種チャンバーからPBSを取り出し、200マイクロリットルの細胞懸濁液を滴下して加えた。細胞を二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で2時間沈降させる。アガロースモールドを囲むマイクロ組織作製培地を加え、内部チャンバーの表面を覆う。24時間後、円形の凹部に自己組織化されたコンパクトな回転楕円体を観察します。2日ごとに培地を交換して回転楕円体を維持します。典型的には、48時間後、スフェロイドの自発的な拍動が観察され得る。個々の細胞型を別々に基底膜マトリックス培地、またはゼラチンコーティングチャンバースライド上で培養する。円形のくぼみから心臓ミクロ組織を静かに洗い流し、15ミリリットルのクロニクルチューブに集めます。培地を吸引し、細胞または微小組織を1ミリリットルのPBSですすいでください。次いで、細胞または微小組織を4.2%PFAを含む固定緩衝液で固定し、室温でインキュベートする。PFAを吸引し、細胞または微小組織を1ミリリットルの透過溶液でインキュベートする。その後、溶液を吸引し、2〜3ミリリットルのPBSですすいでください。500〜1000マイクロリットルのブロッキング溶液を細胞に加え、チャンバースライドについては少なくとも1時間、微小組織については3〜4時間インキュベートする。ブロッキング溶液中の結合抗体と共にサンプルをチャンバースライドについて1時間インキュベートし、心臓ミクロ組織について摂氏4度で一晩インキュベートする。チャンバースライドを500マイクロリットルの0.1%Tween 20で3回洗浄し、各洗浄の間に5分間持続し、PBSで最終洗浄を行います。心臓ミクロ組織を2ミリリットルの0.1%Tween 20で5回洗浄し、各洗浄の間に20分間持続する。その後、さらに20分間最終洗浄を行う。共焦点顕微鏡検査の前に細胞またはマイクロ組織をDAPIでインキュベートし、心臓マイクロ組織を35ミリメートルのガラス底ディッシュに慎重に移し、PBSを加えてマイクロ組織を沈める。円形のくぼみからマイクロ組織を、幅の広いピペットチップまたは1ミリリットルのピペットチップを使用して中程度のもので15ミリリットルの慢性チューブに洗い流し、それらを沈降させます。その後、培地を吸引し、1ミリリットルのPBSですすいでください。200〜300マイクロリットルの酵素消化バッファーを加え、摂氏37度で10分間インキュベートする。その後、微小組織を1分間穏やかに混合し、インキュベーションを繰り返す。インキュベーション後、マイクロ組織を通常の1ミリリットルのピペットチップで激しく混合し、単一細胞に消化します。濁った細胞懸濁液を得、5%FBSを含む5ミリリットルの培地で細胞懸濁液を直ちに中和する。細胞懸濁液を40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通してひずみ、細胞の総数をカウントした。単細胞懸濁液を300倍Gで4°Cで5分間遠心分離する。上清を吸引し、FITCアネキシンVおよびヨウ化プロピジウム、またはTO-PRO-3死細胞排除色素を含むアネキシン結合緩衝液に細胞を再懸濁し、氷上で10分間インキュベートする。インキュベーション後、300マイクロリットルのアネキシン結合緩衝液を細胞懸濁液に加え、フローサイトメトリー分析のために丸底FACSチューブに移す。精製された誘導多能性幹細胞由来心筋細胞、内皮細胞および心臓線維芽細胞を、位相差顕微鏡を用いて可視化した。異なる細胞型の純度を、免疫染色およびフローサイトメトリーを用いて決定した。トロポニンTを心筋細胞のマーカーとして用い、90%以上の純度を達成した。血小板内皮細胞接着分子CD31およびビメンチンを内皮細胞および心臓線維芽細胞のマーカーとして用い、それぞれ98%および96%を超える純度を示した。免疫蛍光染色により、心筋細胞が最も重く、微小組織の中心を占めているのに対し、内皮細胞は微小組織全体に散在しており、心臓線維芽細胞が主に末梢を占めていることが明らかになった。このペース1およびリベラーゼTLを用いた微小組織の消化は、培養における2週間後により少ないアポトーシス細胞で非常に生存率の高い細胞比率をもたらした。高濃度のドキソルビシンへの心臓微小組織の1時間の曝露は、用量依存性心毒性を誘発した。微小組織の収縮性、およびベクトル移動は、微小組織全体の平均収縮プロファイルを示す擬似ヒートマップを生成した。心臓ミクロ組織の収縮運動は、収縮速度、緩和速度、および拍動速度として測定された正のピークを生成し、これは2つの収縮サイクル間の時間として計算された。心臓ミクロ組織の収縮性は、培養において4週間にわたって一貫していた。細胞加熱は、この特定のプロトコルにおける最も重要なステップの1つであり、マイクロウェル内で均等に分配するために細胞懸濁液をアガロースアレイに滴下し、オーバーフローを防止するように注意する必要があります。これらのマイクロ組織の最適化された放射線プロトコルを使用すると、単一細胞RNA-seqや単一細胞ATAC-seqなどのハイスループットシーケンシング技術にこれらを従わせて、異なる処理条件に起因する細胞特異的遺伝子発現パターンを理解することができます。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

心臓組織工学のためのフィブリンゲルにおける心筋細胞のカプセル化

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

灌流固定標本のコントラストコンピュータ断層撮影を用いた人間の心臓静脈系の解剖学的再建

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

心臓細胞療法のメカニズムを研究するために定義されたヒューマン・エンジニア心臓組織の構築

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

3D Bioprintingを用いたスフェロイドの機械的統合を示す心臓組織の創出

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

ひと血清における心筋バイオ マーカーを定量化する臨時の光伝送を使用してください。

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

成人骨髄由来造血幹細胞が細胞工学磁気ターゲッティングと結合を有効にするにマイクロ Rna の転送のためのプロトコル

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

スキャフォールド フリー三次元心筋組織構築純金型ベース方式

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

iPSC由来内皮細胞の浸透した3D血管新生発芽をインビトロで研究するための標準化およびスケーラブルなアッセイ

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

再発作用ポテンシャル記録のためのマルチウェルマイクロ電極アレイ上のヒトiPSC由来心筋細胞ネットワーク

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

ヒトの神経ノチカルスライスの二重電圧およびカルシウム光学マッピングによる前臨床心臓電気生理学的評価

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...