Name: fabrication of 3d cardiac microtissue arrays using human ipsc-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells
Uploaded: 2021-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells at JoVE.com

우리는 원고에 대한 그녀의 유용한 피드백에 대한 박사 아만다 체이스 감사합니다. 자금 지원은 캘리포니아 대학, T29FT0380 (D.T.) 및 27IR-0012 (J.C.W.의 담배 관련 질병 연구 프로그램 (TRDRP)에 의해 제공되었습니다; 미국 심장 협회 20POST35210896 (H.K.) 및 17MERIT33610009 (J.C.W.); 및 국립 보건원 (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851, NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

1. 중간, 시약, 배양 판 준비
<ol><li>세포 배양을 위한 세포 세척 용액: 칼슘이나 마그네슘 없이 1x 인산염 완충식식염(PBS) 또는 행크스 균형 소금 용액(HBSS)을 사용하십시오.</li>
	<li>심근세포 분화 미디어<ol>
<li>분화 매체 #1을 추가하여 10mL 보충제(50x B27+인슐린)를 500mL 심근세포 기저(RPMI 1640)에 첨가하여 준비한다.</li>
		<li>분화 매체 #2는 10mL 보충제(50x B27 마이너스 인슐린)를 500mL 심근세포 기저(RPMI 16...

<ol>
	<li>Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hurdles+to+clinical+translation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 156166 (2018).</li><li>Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stem+cell+organoids.">Engineering stem cell organoids.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cardiac+microtissues+composed+of+cardiomyocytes+and+endothelial+cells+co-differentiated+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).</li><li>Kurokawa, Y. K., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+the+cardiac+microenvironment:+Multicellular+microphysiological+systems+for+drug+screening.">Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).</li><li>Cartledge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+crosstalk+between+cardiac+fibroblasts+and+adult+cardiomyocytes+by+soluble+mediators.">Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators.</a> Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).</li><li>Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+non-myocyte+cells+show+enhanced+pharmacological+function+suggestive+of+contractile+maturity+in+stem+cell+derived+cardiomyocyte+microtissues.">Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues.</a> Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Brutsaert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+endothelial-myocardial+signaling:+its+role+in+cardiac+growth,+contractile+performance,+and+rhythmicity.">Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity.</a> Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).</li><li>Huebsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+video-based+analysis+of+contractility+and+calcium+flux+in+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+cultured+over+different+spatial+scales.">Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pravastatin+reverses+obesity-induced+dysfunction+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+via+a+nitric+oxide-dependent+mechanism.">Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism.</a> European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).</li><li>Williams, I. M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).</li><li>Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 1-7 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+in+vitro+modeling+of+cardiac+fibrosis.">Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis.</a> Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+via+second+heart+field+progenitors.">Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors.</a> Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-iPSC-derived+cardiac+stromal+cells+enhance+maturation+in+3d+cardiac+microtissues+and+reveal+non-cardiomyocyte+contributions+to+heart+disease.">Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease.</a> Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).</li><li>Burridge, P. W., Holmstr&#246;m, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+culture+and+cardiomyocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/&#946;-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/&#946;-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+Advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+expression+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-+and+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells.">Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells.</a> Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Gu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+cells.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).</li><li>Acharya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+transcription+factor+Tcf21+is+required+for+lineage-specific+EMT+of+cardiac+fibroblast+progenitors.">The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors.</a> Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).</li><li>Wessels, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardially+derived+fibroblasts+preferentially+contribute+to+the+parietal+leaflets+of+the+atrioventricular+valves+in+the+murine+heart.">Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart.</a> Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).</li><li>Ali, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+heterogeneity+of+cardiac+fibroblasts+does+not+predict+pathological+proliferation+and+activation.">Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation.</a> Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).</li><li>McMurtrey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytic+and+numerical+models+of+oxygen+and+nutrient+diffusion,+metabolism+dynamics,+and+architecture+optimization+in+three-dimensional+tissue+constructs+with+applications+and+insights+in+cerebral+organoids.">Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids.</a> Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).</li><li>Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+customized+extracellular+niche+engineering:+progress+in+cell-entrapment+technologies.">Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies.</a> Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).</li><li>Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+Multi-dimensional+induced+pluripotent+stem+cells-based+model+platforms+to+assess+cardiotoxicity+in+cancer+therapies.">Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies.</a> Front Pharmacol. 12, 39 (2021).</li><li>Rhee, J. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+secondary+iron+overload+cardiomyopathy+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).</li><li>Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+in+cardiovascular+development,+disease,+and+medicine.">Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).</li><li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+considerations+for+single-cell+RNA+sequencing+approaches.">Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).</li><li>Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-wide+approaches+in+induced+pluripotent+stem+cell+models.">Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models.</a> Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).</li><li>Maddah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+platform+for+functional+characterization+of+stem-cell-derived+cardiomyocytes+with+applications+in+cardiotoxicity+testing.">A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing.</a> Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).</li><li>Sala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Musclemotion:+A+versatile+open+software+tool+to+quantify+cardiomyocyte+and+cardiac+muscle+contraction+in+vitro+and+in+vivo.">Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).</li></ol>

미리 분화된 iPSC-CM, iPSC-EC 및 iPSC-CF로부터 심장 마이크로티슈를 생성하기 위해서는 심장 마이크로티슈 내에서 접촉 억제된 세포 다짐 후 세포 수를 더 잘 제어하기 위한 고결한 배양을 확보하는 것이 필수적이다. 최근에는 지아코멜리 외. al.18 은 iPSC-CM, iPSC-EC 및 iPSC-CFs를 사용하여 심장 미세 조직의 제조를 입증했습니다. 설명된 방법을 사용하여 생성된 심장 미세 조직은 ~5,000세?...

심혈관 연구 분야의 약물 발견 및 질병 모델링은 임상적으로 관련된 샘플과 부적절한 번역 도구의 부족으로 인해 몇 가지 도전에 직면하고 있습니다. 매우 복잡한 전임상 모델 또는 체외 외 단일 세포 모델의 지나치게 단순화된 결과 재현 가능한 방식으로 병리학적 조건을 나타내지 않습니다. 따라서, 여러 소형 조직 설계 플랫폼은 높은 처리량 방식으로 적용의 용이성과 조직 기능의 충실한 회수 사이의 균형을 달성하는 것을 목표로, 격차를 해소하는 데 도움이 진화했다2,3. 유도 된 다능성 줄기 세포 (iPSC) 기술의 출현으로, 조직 엔지니어링 도구는 연구 질문에 대답하기 위해 기본 심혈관 질환 상태 또는 없이 환자 특정 세포에 적용 할 수 있습니다4,5,6. 심장 조직과 유사한 세포 구성을 가진 이러한 조직 설계 모델은 하나 또는 다중 세포 유형의 행동에 병리학적 변화에 의해 유도 된 심장 독성 및 기능 장애를 테스트하는 약물 개발 노력에 활용 될 수있다.
인간 iPSC에서 파생된 자가 조립 된 마이크로 조직 또는 오르가노이드는 생체 내 와 기능적 유사성을 나타내는 소형 조직과 유사한 어셈블리인 3차원 (3D) 구조입니다. iPSC의 지시된 분화를 통해 또는 배아 바디4의 대형을 통해 그(것)들에게 오르가노이드의 형성을 허용하는 몇몇 다른 접근이 있습니다. 결과 오르가노이드는 유기 발생을 유발하는 형태 유전학 적 과정을 연구하는 데 필수적인 도구입니다. 그러나, 다양한 세포 집단의 존재와 자기 조직에 있는 다름은 다른 organoids5 사이 결과에 있는 가변성으로 이끌어 낼 수 있습니다. 대안적으로, 국소 세포 상호 작용을 연구하기 위해 조직 별 세포 유형을 가진 마이크로 조직으로 자체 조립되는 미리 분화된 세포는 자가 조립 된 성분을 분리하는 것이 가능한 우수한 모델입니다. 특히 인간의 심장 연구에서다세포 성분을 가진 3D 심장 미세 조직의 개발은 세포가 다른 환자 라인 또는 상업적 근원에서 파생될 때 도전적인 것으로 입증되었습니다.
생리적으로 관련성이 있는, 개인화된, 체외 모델에서 세포 행동에 대한 기계적 이해를 향상시키기 위해, 이상적으로 모든 성분 세포 유형은 동일한 환자 라인에서 파생되어야 합니다. 인간의 심장의 맥락에서, 진정으로 대표적인 체외 모델은 주요 세포 유형, 즉 심근세포 (CM), 내피 세포 (EC), 및 심장 섬유 아세포 (CFs)6,7 사이에서 크로스토크를 캡처할 것입니다. 심근의 충실한 회수는 생물물리학 적 스트레칭 및 전기 생리 자극뿐만 아니라 EC 및 CFs8과 같은 세포 유형을 지원에서 발생하는 세포 세포 신호가 필요합니다. CF는 세포 외 매트릭스의 합성및 조직 구조를 유지하는 데 관여합니다. 그리고 병리학적인 상태에서, CF는 CMs9에 있는 섬유증을 유도하고 전기 전도를 바꿀 수 있습니다. 마찬가지로, EC는 파라크리인 신호 및 중요한 신진 대사 요구를 공급하여 CM의 수축 특성을 조절할 수 있습니다10. 따라서 생리학적으로 관련된 고처리량 실험을 수행할 수 있도록 3가지 주요 세포 유형으로 구성된 인간 심장 미세 조직에 대한 필요성이 있습니다.
여기에서는 인간 iPSC 유래 심근세포(iPSC-CM), iPSC 유래 내피 세포(iPSC-EC), iPSC 유래 심장 섬유아세포(iPSC-CFs) 및 심장 조직 균등에서의 3D 배양에 의한 심장 미세 조직의 제조에 대한 상향식 접근법을 설명합니다. 자발적으로 심장 미세 조직을 생성하는이 촉진 방법은 질병 모델링 및 심장 생리학의 기능적 및 기계론적 이해를위한 약물의 신속한 테스트에 활용 될 수있다. 더욱이, 그 같은 다세포 심장 미세 조직 플랫폼은 만성 또는 급성 배양 조건하에서 시간이 지남에 따라 심장 질병 진행을 모방하기 위하여 게놈 편집 기술로 이용될 수 있었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D micro-molds</td>
			<td>Microtissues</td>
			<td>12-81 format</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9104697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement minus Insulin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement plus Insulin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel, hESC-qualified matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin T Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-120-403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-110-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDR2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-81707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V13242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>4942086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium</td>
			<td></td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 basal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit</td>
			<td>LifeLIne Cell Technology</td>
			<td>LS-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose free RPMI medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11879-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF-165</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1-endo</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Sorting Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Rinsing Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11835055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>red</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin Alexa Fluor&#174; 488-conjugated Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC2105G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of 3d cardiac microtissue arrays using human ipsc-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells

유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)에서 인간 심근세포(CM), 심장 섬유아세포(CFs), 내피세포(EC)의 생성은 조직 발달과 질병을 이끄는 다른 심혈관 세포 모형 사이에서 복잡한 상호작용을 연구할 수 있는 특별한 기회를 제공하고 있다. 심장 조직 모델의 영역에서, 몇몇 정교한 3차원 (3D) 접근은 세포 외 매트릭스와 크로스 링커의 조합으로 생리적 관련성 및 토착 조직 환경을 모방하기 위하여 유도된 다능성 줄기 세포 유래 심근세포 (iPSC-CM)를 이용합니다. 그러나 이러한 시스템은 미세 제조 전문 지식없이 조작하기가 복잡하고 자체 조립하는 데 몇 주가 필요합니다. 가장 중요한 것은, 이 시스템의 많은 것은 인간적인 심혼에 있는 비 myocytes의 60% 이상을 구성하는 혈관 세포 및 심장 섬유아세포부족입니다. 여기에서 우리는 심장 미세 조직을 제조하는 iPSCs에서 모든 3개의 심장 세포 모형의 파생을 기술합니다. 이 촉진 복제 성형 기술은 몇 주 동안 표준 다중 잘 세포 배양 판에서 심장 미세 조직 배양을 허용합니다. 이 플랫폼은 초기 시드 밀도에 따라 미세 조직 크기를 사용자가 정의한 제어를 허용하며 관찰 가능한 심장 미세 조직 수축을 달성하기 위해 자체 조립에 3 일 미만이 필요합니다. 더욱이, 심장 마이크로티슈는 유동 세포측정및 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)을 사용하여 단세포 심문을 위한 높은 세포 생존가능성을 유지하면서 쉽게 소화될 수 있다. 우리는 심장 미세 조직의 이 체외 모형이 약 발견 및 질병 모델링에 있는 검증 연구를 가속화하는 것을 도울 것이라는 점을 구상합니다.

iPSC 유래 CM, IC 및 CF의 면역 염색 및 유동 세포측정 특성화 iPSC-CM, iPSC-EC 및 iPSC-CF로 구성된 심장 마이크로 조직을 생성하기 위해 세 가지 세포 유형모두 개별적으로 분화되고 특성화됩니다. iPSC-CM에 iPSC의 체외 분화는 지난 몇 년 동안 개선되었습니다. 그러나 iPSC-CM의 수율과 순도는 선마다 다릅니다. 현재 프로토콜은 9일 경에 자발적으로 이길 수 있는 75% 이상의 순수 iPSC-CM을 ?...

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Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

여기서, 우리는 미리 분화된 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포로 구성된 3D 자가 조립 심장 미세 조직 배열을 생성하는 사용하기 쉬운 방법론을 기술합니다. 심장 미세 조직을 생성하는 기술을 요구하는 이 사용자 친화적이고 낮은 세포는 질병 모델링 및 약물 개발의 초기 단계를 위해 구현될 수 있습니다.

인간 iPSC 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포를 사용하여 3D 심장 미세 조직 배열의 제조

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

이 프로토콜은 유도 된 다능성 줄기 세포를 사용하여 인간 심혈관 세포 유형을 생성하는 힘과 72 시간 이내에 박동 심장 스페로이드를 생성하는 다목적 기술을 결합합니다. 이 심장 스페로이드는 질병 모델링 및 약물 검사에 사용될 수 있습니다. 이 촉진 기법의 주요 장점 중 하나는 하나는 거의 생성 할 수 있다는 것입니다 1000 표준 12 웰 플레이트에서 심장 스페로이드를 치고.그리고 가장 중요한 것은, 각각의 모든 심장 스페로이드는 화상 진찰 기지를 둔 기술을 사용하여 그것의 수축 기능에 관하여 분석될 수 있습니다. 전자 레인지에 아가로즈를 녹인 후 생물 안전 캐비닛에 넣고 3 분 동안 식힙니다. 용융 아가로즈의 파이펫 700 마이크로리터는 9개 배열의 실리콘 마이크로몰드에 추가하여 거품을 일으키지 않도록 주의를 기울입니다.조심스럽게 아가로즈 지속 시간을 가속화하기 위해 미리 차가운 얼음 블록에 금형을 배치합니다. 아가로즈가 반투명해지면, 미세 몰드의 가장자리를 조심스럽게 구부려 아가로즈 복제본을 잃어내고 실리콘 마이크로몰드에서 분리하기 위해 모든 면에서 복제본을 부드럽게 벗깁니다. 멸균 12웰 플레이트에 81개의 원형 오목이 들어 있는 아가로즈 미세 조직 트레이를 전달한 다음, 아가로즈 마이크로티슈 트레이에 PBS 2밀리리터를 넣고, 갇힌 기포 나 불규칙하게 생긴 우물에 대한 현미경으로 검사한다.아가로즈 트레이를 하룻밤 사이에 70%에탄올의 2밀리리터에 담그고, 그 다음에 는 생물안전 캐비닛에서 1시간 동안 UV 처리를 합니다. 70%에탄올을 제거하고 증류수로 두 번, PBS 2밀리리터로 한 번 씻으시면 됩니다. 유도된 다능성 줄기 세포가 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포가 트립시화 및 중화 후에 계산되면, 세포 현탁액을 얼음 위에 놓는다.새로운 튜브에서 유도된 다능성 줄기 세포 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포를 혼합한다. 이어서, 오목한 후, 우물및 세포 시딩 챔버로부터 PBS를 제거하고, 셀 서스펜션의 마이크로리터 200개를 드롭방향으로 추가한다. 세포가 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2시간 동안 정착하도록 허용합니다.아가로즈 몰드를 둘러싼 마이크로 조직 제조 배지를 추가하여 내부 챔버의 표면을 덮습니다. 24시간 후 원형 오목에서 자체 조립 및 컴팩트한 스페로이드를 관찰하십시오. 스페로이드를 유지하기 위해 매2일마다 배지를 변경합니다.전형적으로, 48시간 후에, 스페로이드의 자발적인 구타를 관찰할 수 있다. 지하 막 매트릭스 배지 또는 젤라틴 코팅 챔버 슬라이드에 개별 세포 유형을 별도로 배양한다. 부드럽게 원형 오목에서 심장 미세 조직을 플러시하고, 15 밀리리터 연대기 튜브에서 수집합니다.중간 을 흡인 하 고 세포 또는 마이크로 조직을 헹구고, PBS의 1 밀리 리터와 함께. 그런 다음 세포 또는 마이크로 조직을 4.2%PFA를 포함하는 고정 버퍼로 고정하고 실온에서 배양합니다. PFA를 흡인하고 세포 또는 미세 조직을 침투 용액의 1 밀리리터로 배양합니다.그런 다음 용액을 흡인하고 PBS의 2 ~3 밀리리터로 헹구세요. 500~1000마이크로리터의 차단 용액을 세포에 추가하고 챔버 슬라이드를 위해 적어도 1시간 동안 배양하고, 마이크로티티슈의 경우 3~4시간 동안 배양한다. 챔버 슬라이드에 대한 1 시간 동안 차단 용액에 공액 항체와 샘플을 배양하고, 심장 미세 조직을위한 섭씨 4도에서 하룻밤.챔버 슬라이드를 0.1%Tween 20의 500 마이크로리터로 세 번 세척한 다음, 각 세척 사이에 5분 동안 지속된 다음 PBS로 최종 세척을 수행합니다. 심장 마이크로 조직을 0.1%Tween 20의 2밀리리터로 5회 세척하고, 각 세척 사이에 20분의 지속 시간을 갖는다. 그런 다음 20 분 동안 최종 세척을 수행하십시오.공초점 현미경 검사전에 DAPI로 세포 또는 마이크로 조직을 배양한 다음 심장 미세 조직을 35mm 유리 바닥 접시로 조심스럽게 옮기고 PBS를 추가하여 미세 조직을 침수합니다. 15 밀리리터 만성 튜브에 넓은 또는 1 밀리 리터 파이펫 팁을 사용하여 중간 하나와 원형 오목에서 마이크로 티슈를 플러시하고, 정착 할 수 있도록. 그런 다음, 매체를 흡인하고 1 밀리리터 PBS로 헹구세요.효소 소화 완충제 200~300마이크로리터를 넣고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 미세 조직을 1 분 동안 부드럽게 섞고 인큐베이션을 반복합니다. 인큐베이션 후, 마이크로티티를 일반 1밀리리터 파이펫 팁과 격렬하게 섞어 단일 세포로 소화합니다.탁탁세포 현탁액을 획득하고, 5%의 FBS를 함유한 5밀리리터의 세포 현탁액을 즉시 중화한다. 40 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 변형시키고 총 세포 수를 계산합니다. 원심 분리는 섭씨 4도에서 5 분 동안 300 배 G에서 단일 셀 서스펜션을 분리합니다.FITC 부속서 V 및 프로피듐 요오드, 또는 TO-PRO-3 죽은 세포 배제 염료로 부속 결합 버퍼에서 셀을 흡인하고 재침표하고 얼음에서 10 분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 감산 형결력 버퍼의 300 마이크로리터를 세포 현탁액에 추가하고 유동 세포 측정 분석을 위해 원형 하단 FACS 튜브로 전송한다. 정제유도만능 줄기 세포 유래 심근세포, 내피세포 및 심장 섬유아세포는 위상 대비 현미경을 사용하여 시각화하였다.상이한 세포 유형의 순도는 면역 염색 및 유동 세포측정을 사용하여 결정되었다. 트로포닌 T는 심근세포에 대한 마커로 사용되었고, 90% 이상의 순도가 달성되었다. 혈소판 내피 세포 접착 분자 CD31 및 바이멘틴은 내피 세포 및 심장 섬유아세포에 대한 마커로 사용되었으며, 각각 98 및 96% 이상의 순도를 나타냈다.면역형광 염색은 심근세포가 가장 무겁고 미세 조직의 중심을 점유했다는 것을 밝혔으며, 내피 세포는 미세 조직 전체에 흩어져 있었고, 심장 섬유아세포는 주로 주변을 점유했다. 이 속도 1 및 Liberase TL을 사용하여 마이크로 조직의 소화는 배양에서 2 주 후에 더 적은 세포세포로 높게 실행 가능한 세포 비율 귀착되었습니다. 독소루비신 유도 용량 의존 심장 독성의 높은 농도에 심장 미세 조직의 1 시간 노출.마이크로 조직 수축, 벡터 운동은 미세 조직 전반에 걸쳐 평균 수축 프로파일을 나타내는 의사 열지도를 생성하였다. 심장 미세 조직의 수축 운동은 수축 속도, 이완 속도 및 두 수축 주기 사이의 시간으로 계산된 박동 속도로 측정된 양수 피크를 생성했습니다. 심장 미세 조직의 수축은 문화권에서 4 주 이상 일관되었습니다.세포 가열은 이 특정 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나이며, 마이크로웰 내에서균분포를 위해 세포 현탁액을 아가로즈 어레이로 조심스럽게 분배하고 오버플로를 방지해야 합니다. 이러한 미세 조직의 최적화된 방사선 프로토콜을 사용하여, 이들 중 하나는 다이목다른 치료 조건으로 인해 세포 특이적 유전자 발현 패턴을 이해하기 위해 단세포 RNA-seq 또는 단일 세포 ATAC-seq와 같은 높은 처리량 시퀀싱 기술을 적용할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

심장 조직 공학을위한 섬유소 히드로겔에 Cardiomyocytes의 캡슐

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

연구

생체공학

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

콘트라스트 계산하기 관류 고정 시편의 단층 촬영을 이용하여 인간의 심장 정맥 시스템의 해부학 적 재건

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

3D Bioprinting을 이용한 Spheroids의 기계적 통합을 보여주는 심장 조직의 생성

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

특별 한 광학 전송 인간의 혈 청에 심장 Biomarkers 척도를 사용 하 여

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

비 계-무료 3 차원 심장 조직 창조의 그물 형 기반 방법

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

iPSC 유래 내피 세포의 퍼퓨비드 3D 혈관신생 발아연구를 위한 표준화 및 확장 성 분석

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

재발 동작 전위 기록을 위한 멀티웰 마이크로 전극 어레이의 인간 iPSC 유래 심근구 네트워크

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

인간 조직형 심장 슬라이스의 이중 전압 및 칼슘 광학 매핑에 의한 전임상 심장 전극생리학 평가

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...