Name: fabrication of 3d cardiac microtissue arrays using human ipsc-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells
Uploaded: 2021-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells at JoVE.com

Vi takker Dr. Amanda Chase for hennes nyttige tilbakemelding på manuskriptet. Finansieringsstøtte ble gitt av Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) ved University of California, T29FT0380 (D.T.) og 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) og 17MERIT33610009 (J.C.W.); og National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 og NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

1. Medium, reagens, kulturplatepreparat
<ol><li>Cellevaskløsning for cellekultur: Bruk 1x fosfatbufret saltvann (PBS) eller Hanks balansert saltoppløsning (HBSS) uten kalsium eller magnesium.</li>
	<li>Kardiomyocytt differensieringsmedier<ol>
<li>Forbered differensiering Medium #1 ved å tilsette 10 ml supplement (50x B27 pluss insulin) til 500 ml kardiomyocytt basalmedium (RPMI 1640).</li>
		<li>Forbered differensiering Medium #2 ved å tilsette 10 ml supplement (50x B27 minus insulin) til 500 ml kardiomyocytt basal...

<ol>
	<li>Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hurdles+to+clinical+translation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 156166 (2018).</li><li>Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stem+cell+organoids.">Engineering stem cell organoids.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cardiac+microtissues+composed+of+cardiomyocytes+and+endothelial+cells+co-differentiated+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).</li><li>Kurokawa, Y. K., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+the+cardiac+microenvironment:+Multicellular+microphysiological+systems+for+drug+screening.">Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).</li><li>Cartledge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+crosstalk+between+cardiac+fibroblasts+and+adult+cardiomyocytes+by+soluble+mediators.">Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators.</a> Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).</li><li>Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+non-myocyte+cells+show+enhanced+pharmacological+function+suggestive+of+contractile+maturity+in+stem+cell+derived+cardiomyocyte+microtissues.">Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues.</a> Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Brutsaert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+endothelial-myocardial+signaling:+its+role+in+cardiac+growth,+contractile+performance,+and+rhythmicity.">Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity.</a> Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).</li><li>Huebsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+video-based+analysis+of+contractility+and+calcium+flux+in+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+cultured+over+different+spatial+scales.">Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pravastatin+reverses+obesity-induced+dysfunction+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+via+a+nitric+oxide-dependent+mechanism.">Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism.</a> European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).</li><li>Williams, I. M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).</li><li>Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 1-7 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+in+vitro+modeling+of+cardiac+fibrosis.">Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis.</a> Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+via+second+heart+field+progenitors.">Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors.</a> Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-iPSC-derived+cardiac+stromal+cells+enhance+maturation+in+3d+cardiac+microtissues+and+reveal+non-cardiomyocyte+contributions+to+heart+disease.">Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease.</a> Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).</li><li>Burridge, P. W., Holmstr&#246;m, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+culture+and+cardiomyocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/&#946;-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/&#946;-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+Advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+expression+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-+and+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells.">Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells.</a> Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Gu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+cells.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).</li><li>Acharya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+transcription+factor+Tcf21+is+required+for+lineage-specific+EMT+of+cardiac+fibroblast+progenitors.">The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors.</a> Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).</li><li>Wessels, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardially+derived+fibroblasts+preferentially+contribute+to+the+parietal+leaflets+of+the+atrioventricular+valves+in+the+murine+heart.">Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart.</a> Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).</li><li>Ali, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+heterogeneity+of+cardiac+fibroblasts+does+not+predict+pathological+proliferation+and+activation.">Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation.</a> Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).</li><li>McMurtrey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytic+and+numerical+models+of+oxygen+and+nutrient+diffusion,+metabolism+dynamics,+and+architecture+optimization+in+three-dimensional+tissue+constructs+with+applications+and+insights+in+cerebral+organoids.">Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids.</a> Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).</li><li>Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+customized+extracellular+niche+engineering:+progress+in+cell-entrapment+technologies.">Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies.</a> Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).</li><li>Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+Multi-dimensional+induced+pluripotent+stem+cells-based+model+platforms+to+assess+cardiotoxicity+in+cancer+therapies.">Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies.</a> Front Pharmacol. 12, 39 (2021).</li><li>Rhee, J. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+secondary+iron+overload+cardiomyopathy+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).</li><li>Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+in+cardiovascular+development,+disease,+and+medicine.">Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).</li><li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+considerations+for+single-cell+RNA+sequencing+approaches.">Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).</li><li>Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-wide+approaches+in+induced+pluripotent+stem+cell+models.">Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models.</a> Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).</li><li>Maddah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+platform+for+functional+characterization+of+stem-cell-derived+cardiomyocytes+with+applications+in+cardiotoxicity+testing.">A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing.</a> Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).</li><li>Sala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Musclemotion:+A+versatile+open+software+tool+to+quantify+cardiomyocyte+and+cardiac+muscle+contraction+in+vitro+and+in+vivo.">Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).</li></ol>

For å generere hjertemikrobrikker fra forhåndsdifferensierte iPSC-CMer, iPSC-OKKER og iPSC-CFer, er det viktig å få en svært ren kultur for bedre kontroll av cellenumre etter kontakthemmet cellekomprimering i hjertemikrotissuene. Nylig, Giacomelli et. al.18 har demonstrert fabrikasjonen av hjertemikroter ved hjelp av iPSC-CMer, iPSC-OKKER og iPSC-CFer. Hjertemikroser som genereres ved hjelp av den beskrevne metoden, består av ~5000 celler (70 % iPSC-CMer, 15 % iPSC-ECer og 15 % iPSC-CFer). I...

Legemiddeloppdagelse og sykdomsmodellering innen kardiovaskulær forskning står overfor flere utfordringer på grunn av mangel på klinisk relevante prøver og utilstrekkelige translasjonsverktøy1. Svært komplekse prekliniske modeller eller forenklede in vitro encellede modeller viser ikke patofysiologiske forhold på en reproduserbar måte. Derfor har flere miniatyriserte vevskonstruerte plattformer utviklet seg for å bidra til å bygge bro over gapet, med mål om å oppnå en balanse mellom brukervennlighet på en høy gjennomstrømningsmåte og trofast recapitulation av vevsfunksjon2,3. Med ankomsten av indusert pluripotent stamcelle (iPSC) teknologi, vev engineering verktøy kan brukes på pasientspesifikke celler med eller uten underliggende kardiovaskulær sykdom tilstand for å svare på forskningsspørsmål4,5,6. Slike vevskonstruerte modeller med cellulær sammensetning som ligner hjertevevet, kan brukes i narkotikautviklingsarbeidet for å teste for kardiotoksisitet og dysfunksjon forårsaket av patologiske endringer i oppførselen til en eller flere celletyper.
Selvmonterte mikrotissuer eller organoider avledet fra menneskelige iPSCer er tredimensjonale (3D) strukturer som er miniatyrvevlignende forsamlinger som viser funksjonelle likheter med sine in vivo-kolleger . Det finnes flere forskjellige tilnærminger som tillater dannelse av organoider in situ via rettet differensiering av iPSC eller gjennom dannelsen av embryoide legemer4. De resulterende organoidene er et uunnværlig verktøy for å studere morfogenetiske prosesser som driver organogenese. Tilstedeværelsen av en rekke cellepopulasjoner og forskjeller i selvorganisering kan imidlertid føre til variasjon i resultatene mellom forskjellige organoider5. Alternativt er forhåndsdifferensierte celler som er selvmontert i mikrobehov med vevsspesifikke celletyper for å studere lokale cellecelleinteraksjoner gode modeller, der det er mulig å isolere de selvmonterte komponentene. Spesielt i menneskelig hjerteforskning har utvikling av 3D-hjertemikrobehov med multicellulære komponenter vist seg å være utfordrende når celler er avledet fra forskjellige pasientlinjer eller kommersielle kilder.
For å forbedre vår mekanistiske forståelse av celleatferd i en fysiologisk relevant, personlig, in vitro-modell, bør ideelt sett alle komponentcelletyper avledes fra samme pasientlinje. I sammenheng med et menneskehjerte ville en virkelig representativ hjerteintromodell fange krysstale blant dominerende celletyper, nemlig kardiomyocytter (CMs), endotelceller (ECs) og hjertefibroblaster (CFs) 6,7. Den trofaste recapitulation av et myokardi krever ikke bare biofysisk strekk og elektrofysiologisk stimulering, men også cellecellesignalering som oppstår fra støttende celletyper som ECs og CFs8. CFer er involvert i syntesen av ekstracellulær matrise og opprettholde vevsstruktur; og i en patologisk tilstand kan CFer indusere fibrose og endre elektrisk ledning i CMs9. På samme måte kan ECer regulere kontraktilegenskaper til CMs gjennom parakrinesignalering og levering av vitale metabolske krav10. Derfor er det behov for menneskelige hjertemikrobehov som består av alle de tre hovedcelletypene for å tillate fysiologisk relevante høygjennomstrømningseksperimenter.
Her beskriver vi en nedenfra-og-opp-tilnærming i fabrikasjon av hjertemikroter ved avledning av humane iPSC-avledede kardiomyocytter (iPSC-CMs), iPSC-avledede endotelceller (iPSC-OKKER) og iPSC-avledede hjertefibroblaster (iPSC-CFer) og deres 3D-kultur i ensartede hjertemikrotissyndematriser. Denne facile metoden for å generere spontant slå hjertemikrotissues kan brukes til sykdomsmodellering og rask testing av legemidler for funksjonell og mekanistisk forståelse av hjertefysiologi. Videre kan slike multicellulære hjertemikrotissueplattformer utnyttes med genomredigeringsteknikker for å etterligne hjertesykdomsprogresjon over tid under kroniske eller akutte kulturforhold.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D micro-molds</td>
			<td>Microtissues</td>
			<td>12-81 format</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9104697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement minus Insulin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement plus Insulin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel, hESC-qualified matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin T Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-120-403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-110-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDR2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-81707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V13242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>4942086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium</td>
			<td></td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 basal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit</td>
			<td>LifeLIne Cell Technology</td>
			<td>LS-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose free RPMI medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11879-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF-165</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1-endo</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Sorting Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Rinsing Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11835055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>red</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin Alexa Fluor&#174; 488-conjugated Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC2105G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of 3d cardiac microtissue arrays using human ipsc-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells

Generering av humane kardiomyocytter (CMs), hjertefibroblaster (CFer) og endotelceller (ECs) fra induserte pluripotente stamceller (iPSCer) har gitt en unik mulighet til å studere det komplekse samspillet mellom forskjellige kardiovaskulære celletyper som driver vevsutvikling og sykdom. Innen hjertevevsmodeller bruker flere sofistikerte tredimensjonale (3D) tilnærminger indusert pluripotent stamcelleavledede kardiomyocytter (iPSC-CMs) for å etterligne fysiologisk relevans og innfødt vevsmiljø med en kombinasjon av ekstracellulære matriser og krysskoblinger. Imidlertid er disse systemene komplekse å fremstille uten mikrofabrikasjonskompetanse og krever flere uker å montere seg selv. Viktigst av alt mangler mange av disse systemene vaskulære celler og hjertefibroblaster som utgjør over 60% av de ikke-fyocyttene i menneskehjertet. Her beskriver vi avledningen av alle tre hjertecelletyper fra iPSC til fabrikat hjertemikrotissues. Denne facile kopi molding teknikken tillater hjerte mikrotissue kultur i standard multi-brønn celle kultur plater i flere uker. Plattformen tillater brukerdefinert kontroll over mikrotissestørrelser basert på innledende såddtetthet og krever mindre enn 3 dager for selvmontering for å oppnå observerbare hjertemikrotissuekontraksjoner. Videre kan hjertemikrotissuene lett fordøyes samtidig som høy celle levedyktighet for encellet forhør med bruk av strømningscytometri og encellet RNA-sekvensering (scRNA-seq). Vi ser for oss at denne in vitro-modellen av hjertemikroter vil bidra til å akselerere valideringsstudier i legemiddeloppdagelse og sykdomsmodellering.

Immunstaining og strømningscytometrikarakterisering av iPSC-avledede CMer, ECer og CFer For å generere hjertemikroser som består av iPSC-CMer, iPSC-OKKER og iPSC-CFer, er alle tre celletypene differensiert og karakterisert individuelt. In vitro differensiering av iPSCer til iPSC-CMs har forbedret seg de siste årene. Avkastningen og renheten til iPSC-CMer varierer imidlertid fra linje til linje. Den nåværende protokollen gir over 75% rene iPSC-CMer som spontant begynner å slå rundt dag...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells at JoVE.com

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Her beskriver vi en brukervennlig metodikk for å generere 3D-selvmonterte hjertemikrotissuekjeder sammensatt av pre-differensierte menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller. Denne brukervennlige og lave cellen som krever teknikk for å generere hjertemikroser kan implementeres for sykdomsmodellering og tidlige stadier av narkotikautvikling.

Fabrikasjon av 3D cardiac microtissue arrays ved hjelp av humane iPSC-avledede kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Protokollen kombinerer kraften i å generere menneskelige kardiovaskulære celletyper ved hjelp av induserte pluripotente stamceller og en allsidig teknikk for å generere slående hjertesfæroider på mindre enn 72 timer. Disse hjertesfæroidene kan brukes til sykdomsmodellering og legemiddeltesting. En av de viktigste fordelene med denne facile teknikken er at man kan generere nesten 1000 slående hjertesfæroider i en standard 12-brønns plate.Og viktigst av alt, hver hjertesfæroid kan analyses for sin kontraktile funksjon ved hjelp av bildebehandlingsbasert teknikk. Etter å ha smeltet agarose i mikrobølgeovnen, plasser den i biosikkerhetsskapet og la det avkjøles i tre minutter. Pipette 700 mikroliter av smeltet agarose og legg den til silikonmikromold av en ni til ni array, og pass på å unngå å generere bobler.Plasser forsiktig formen på den forkjølede isblokken for å akselerere agarosevarigheten. Når agarose blir gjennomsiktig, bøy forsiktig kantene på mikromold for å tape agarose-kopien og skrell forsiktig kopien fra alle sider for å løsne den fra silikonmikromold. Overfør agarose mikrotissuebrettet som inneholder 81 sirkulære utsparinger til en steril 12-brønnsplate, legg deretter to milliliter PBS til agarose mikrotissuebrettet, og inspiser det under mikroskopet for eventuelle fanget bobler eller uregelmessig formede brønner.Senk agarosebrettet ned i to milliliter 70% etanol over natten, etterfulgt av UV-behandling i biosikkerhetsskapet i en time. Fjern 70% etanol og vask to ganger med destillert vann, og en gang med to milliliter PBS. Når den induserte pluripotente stamcellen avledede kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller telles etter trypsinisering og nøytralisering, plasser cellesuspensjonene på isen.I et nytt rør blander du de induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller. Fjern deretter PBS fra brønnen og cellefrøkammeret uten å berøre fordypningene, og tilsett 200 mikroliter av cellefjæringen dråpevis. La cellene bosette seg ved 37 grader Celsius i en karbondioksidinkubator i to timer.Tilsett mikrovevsfabrikasjonsmedium rundt agaroseformen for å dekke overflaten av det indre kammeret. Etter 24 timer, følg for selvmonterte og kompakte sfæroider i de sirkulære fordypningene. Bytt medium annenhver dag for å opprettholde sfæroidene.Vanligvis, etter 48 timer, kan spontan juling av sfæroidene observeres. Kultur de enkelte celletypene separat på kjellermembranmatrisemediet, eller gelatinbelagte kammersklier. Skyll hjertemikrotisene forsiktig ut av de sirkulære fordypningene, og samle dem i et 15 milliliter krønikerør.Aspirer mediet og skyll cellene eller mikrotissuene, med en milliliter PBS. Deretter fikser du cellene eller mikrotissues med fikseringsbuffer som inneholder 4,2% PFA og inkuberer ved romtemperatur. Aspirer PFA og inkuber cellene eller mikrotissuene med en milliliter permeabiliserende løsning.Deretter aspirerer du løsningen og skyller med to til tre milliliter PBS. Tilsett 500 til 1000 mikroliter blokkeringsløsning til cellene og inkuber i minst en time for kammersklier, og i tre til fire timer for mikrotissues. Inkuber prøvene med konjugerte antistoffer i blokkeringsløsningen i en time for kammersklier, og over natten ved fire grader Celsius for hjertemikrotissuene.Vask kammeret glir tre ganger med 500 mikroliter på 0,1%Tween 20, med fem minutters varighet mellom hver vask, og utfør deretter en sluttvask med PBS. Vask hjertemikrovevet fem ganger med to milliliter 0,1% Tween 20, med en 20 minutters varighet mellom hver vask. Utfør deretter en sluttvask i ytterligere 20 minutter.Inkuber cellene eller mikrotissues med DAPI før konfokal mikroskopi, overfør deretter hjertemikrotissuene forsiktig til en 35 millimeter glassbunnsfat, og tilsett PBS for å nedsenke mikrotissy. Skyll mikrotisene ut av de sirkulære utsparingene med middels en ved hjelp av en bred eller en milliliter pipettespiss i et 15 milliliter kronisk rør, og la dem bosette seg. Deretter aspirerer du mediet og skyller med en milliliter PBS.Tilsett 200 til 300 mikroliter av enzymets fordøyelsesbuffer og inkuber i 10 minutter ved 37 grader Celsius. Bland deretter mikrotissues forsiktig i ett minutt, og gjenta inkubasjonen. Etter inkubasjonen blandes mikrotissues kraftig med en vanlig en milliliter pipettespiss for å fordøye den i enkeltceller.Få en uklar celle suspensjon, og umiddelbart nøytralisere celle suspensjon med fem milliliter medium som inneholder 5%FBS. Sil celleopphenget gjennom en 40 mikrometer cellesil, og tell det totale antall celler. Sentrifuger encellet suspensjon ved 300 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius.Aspirer de supernatante og resuspend cellene i annexin binding buffer med FITC Annexin V og propidium jod, eller TO-PRO-3 død celle eksklusjon fargestoff, og inkubere i 10 minutter på is. Etter inkubasjonen legger du til 300 mikroliter av annexinbindingsbufferen til cellefjæringen og overfører den til et rundt bunn-FACS-rør for strømningscytometrianalyse. Rensede induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter, endotelceller og hjertefibroblaster ble visualisert ved hjelp av fasekontrastmikroskopi.Renheten av forskjellige celletyper ble bestemt ved hjelp av immunfarging og strømningscytometri. Troponin T ble brukt som markør for kardiomyocytter, og over 90% renhet ble oppnådd. Platelet endotelcelleadhesjonsmolekylet CD31 og vimentin ble brukt som markører for endotelceller og hjertefibroblaster, og indikerte renhet over henholdsvis 98 og 96%.Immunfluorescence farging avslørte at kardiomyocyttene var de tyngste og okkuperte sentrum av mikrotissues, mens endotelcellene ble ispedd gjennom mikrotissuene, og hjertefibroblaster okkuperte overveiende periferien. Fordøyelsen av mikrotissues ved hjelp av dette tempoet en og Liberase TL resulterte i svært levedyktige celle proporsjoner med færre apoptotiske celler etter to uker i kultur. Den ene timers eksponeringen av hjertemikrotissues til en høy konsentrasjon av doksorubicin indusert doseavhengig kardiotoksisitet.Mikrovevets kontraktilitet, og vektorbevegelsen genererte et pseudovarmekart som illustrerte den gjennomsnittlige sammentrekningsprofilen på tvers av mikrotissyen. Den kontraktile bevegelsen til hjertemikrotissuene genererte positive topper som ble målt som sammentrekningshastigheten, avslapningshastigheten og beathastigheten, som ble beregnet som tid mellom to sammentrekningssykluser. Kontraktiliteten til hjertemikrotissuene var konsistent over fire uker i kulturen.Celleoppvarming er et av de viktigste trinnene i denne spesielle protokollen, hvor man må passe på å forsiktig dispensere cellefjæringen dråpevis inn i agarose-matrisen for jevn fordeling i mikrowells, og for å forhindre overløp. Ved hjelp av den optimaliserte strålingsprotokollen til disse mikrotissuene kan man utsette disse for høy gjennomstrømningssekvenseringsteknologi, for eksempel encellet RNA-seq eller encellet ATAC-seq for å forstå cellespesifikke genuttrykksmønstre som resulterer på grunn av forskjellige behandlingsforhold.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Anatomiske rekonstruksjoner av Human Cardiac venøse systemet ved hjelp av kontrast-computertomografi av Perfusjons-fast Prøver

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Bygging av Definert menneske Engineered Hjerte Vev å studere mekanismer Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Opprettelse av hjertevæv som viser mekanisk integrasjon av sfæroider ved hjelp av 3D bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

Med ekstraordinære optisk girkasse å kvantifisere Cardiac Biomarkers i humant Serum

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokoll for MicroRNA overføring til voksen Ben margtransplantasjon-avledet blodkreft stamceller aktivere cellen Engineering kombinert med magnetiske målretting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

En netto Mold-basert metode skaperverket stillaset-fri tredimensjonale hjerte vev

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Standardisert og skalerbar analyse for å studere Perfusert 3D angiogenic spirende av iPSC-avledet endothelial Cells in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Human iPSC-avledet Cardiomyocyte nettverk opp på Multiwell mikro--elektrode oppstille for tilbakevendende aksjonen muligheter registreringene

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Preklinisk hjertelektrofysiologi vurdering av dual spenning og kalsium optisk kartlegging av humane organotypiske hjerteskiver

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...