Name: fabrication of 3d cardiac microtissue arrays using human ipsc-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells
Uploaded: 2021-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells at JoVE.com

Agradecemos à Dra. O apoio ao financiamento foi fornecido pelo Programa de Pesquisa de Doenças Relacionadas ao Tabaco (TRDRP) da Universidade da Califórnia, T29FT0380 (D.T.) e 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) e 17MERIT33610009 (J.C.W.); e Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 e NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

1. Meio, reagente, preparação de placas de cultura
<ol><li>Solução de lavagem celular para cultura celular: Use 1x salina tamponada de fosfato (PBS) ou solução de sal balanceada Hanks (HBSS) sem cálcio ou magnésio.</li>
	<li>Mídia de diferenciação de cardiomiocócito<ol>
<li>Prepare a diferenciação Média #1 adicionando suplemento de 10 mL (50x B27 mais insulina) a 500 mL de meio basal cardiomiócito (RPMI 1640).</li>
		<li>Prepare a diferenciação Média #2 adicionando suplemento de 10 mL (50x B27 menos ...

<ol>
	<li>Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hurdles+to+clinical+translation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 156166 (2018).</li><li>Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stem+cell+organoids.">Engineering stem cell organoids.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cardiac+microtissues+composed+of+cardiomyocytes+and+endothelial+cells+co-differentiated+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).</li><li>Kurokawa, Y. K., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+the+cardiac+microenvironment:+Multicellular+microphysiological+systems+for+drug+screening.">Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).</li><li>Cartledge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+crosstalk+between+cardiac+fibroblasts+and+adult+cardiomyocytes+by+soluble+mediators.">Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators.</a> Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).</li><li>Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+non-myocyte+cells+show+enhanced+pharmacological+function+suggestive+of+contractile+maturity+in+stem+cell+derived+cardiomyocyte+microtissues.">Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues.</a> Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+regulate+myocardial+proliferation+through+beta1+integrin+signaling.">Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling.</a> Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).</li><li>Brutsaert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+endothelial-myocardial+signaling:+its+role+in+cardiac+growth,+contractile+performance,+and+rhythmicity.">Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity.</a> Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).</li><li>Huebsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+video-based+analysis+of+contractility+and+calcium+flux+in+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+cultured+over+different+spatial+scales.">Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pravastatin+reverses+obesity-induced+dysfunction+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+via+a+nitric+oxide-dependent+mechanism.">Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism.</a> European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).</li><li>Williams, I. M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).</li><li>Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 1-7 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+in+vitro+modeling+of+cardiac+fibrosis.">Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis.</a> Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+via+second+heart+field+progenitors.">Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors.</a> Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-iPSC-derived+cardiac+stromal+cells+enhance+maturation+in+3d+cardiac+microtissues+and+reveal+non-cardiomyocyte+contributions+to+heart+disease.">Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease.</a> Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).</li><li>Burridge, P. W., Holmstr&#246;m, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+culture+and+cardiomyocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/&#946;-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/&#946;-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+Advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+expression+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-+and+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells.">Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells.</a> Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Gu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+cells.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).</li><li>Acharya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+transcription+factor+Tcf21+is+required+for+lineage-specific+EMT+of+cardiac+fibroblast+progenitors.">The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors.</a> Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).</li><li>Wessels, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardially+derived+fibroblasts+preferentially+contribute+to+the+parietal+leaflets+of+the+atrioventricular+valves+in+the+murine+heart.">Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart.</a> Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).</li><li>Ali, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+heterogeneity+of+cardiac+fibroblasts+does+not+predict+pathological+proliferation+and+activation.">Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation.</a> Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).</li><li>McMurtrey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytic+and+numerical+models+of+oxygen+and+nutrient+diffusion,+metabolism+dynamics,+and+architecture+optimization+in+three-dimensional+tissue+constructs+with+applications+and+insights+in+cerebral+organoids.">Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids.</a> Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).</li><li>Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+customized+extracellular+niche+engineering:+progress+in+cell-entrapment+technologies.">Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies.</a> Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).</li><li>Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+Multi-dimensional+induced+pluripotent+stem+cells-based+model+platforms+to+assess+cardiotoxicity+in+cancer+therapies.">Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies.</a> Front Pharmacol. 12, 39 (2021).</li><li>Rhee, J. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+secondary+iron+overload+cardiomyopathy+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).</li><li>Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+in+cardiovascular+development,+disease,+and+medicine.">Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).</li><li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+considerations+for+single-cell+RNA+sequencing+approaches.">Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).</li><li>Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-wide+approaches+in+induced+pluripotent+stem+cell+models.">Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models.</a> Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).</li><li>Maddah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+platform+for+functional+characterization+of+stem-cell-derived+cardiomyocytes+with+applications+in+cardiotoxicity+testing.">A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing.</a> Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).</li><li>Sala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Musclemotion:+A+versatile+open+software+tool+to+quantify+cardiomyocyte+and+cardiac+muscle+contraction+in+vitro+and+in+vivo.">Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).</li></ol>

Para gerar microtissues cardíacas a partir de iPSC-CMs pré-diferenciados, iPSC-CEs e iPSC-CFs, é essencial obter uma cultura altamente pura para um melhor controle dos números celulares após a compactação celular inibida pelo contato dentro das microtissues cardíacas. Recentemente, Giacomelli et. al.18 demonstraram a fabricação de microtissues cardíacas utilizando iPSC-CMs, iPSC-CEs e iPSC-CFs. As microtissues cardíacas geradas usando o método descrito consistem em ~5.000 células (70...

A descoberta de medicamentos e a modelagem de doenças no campo da pesquisa cardiovascular enfrentam diversos desafios devido à falta de amostras clinicamente relevantes e ferramentas translacionais inadequadas1. Modelos pré-clínicos altamente complexos ou supersimplificados em modelos de célula única in vitro não apresentam condições fisiocessiológicas de forma reprodutível. Portanto, várias plataformas miniaturizadas projetadas em tecido evoluíram para ajudar a preencher a lacuna, com o objetivo de alcançar um equilíbrio entre a facilidade de aplicação de forma de alta produtividade e a recapitulação fiel da função tecidual2,3. Com o advento da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC), as ferramentas de engenharia de tecidos podem ser aplicadas a células específicas do paciente com ou sem estado de doenças cardiovasculares subjacentes para responder a perguntas de pesquisa4,5,6. Tais modelos de tecido projetado com composição celular semelhante ao tecido cardíaco poderiam ser utilizados em esforços de desenvolvimento de medicamentos para testar para cardiotoxicidade e disfunção induzida por alterações patológicas no comportamento de um ou vários tipos de células.
Microtissues auto-montados ou organoides derivados de iPSCs humanos são estruturas tridimensionais (3D) que são conjuntos em miniatura semelhantes a tecidos que exibem semelhanças funcionais com suas contrapartes in vivo. Existem várias abordagens diferentes que permitem a formação de organoides in situ via diferenciação direcionada de iPSCs ou através da formação de corpos embrióides4. Os organoides resultantes são uma ferramenta indispensável para estudar processos morfogenéticos que impulsionam a organogênese. No entanto, a presença de uma variedade de populações celulares e diferenças na auto-organização podem levar à variabilidade nos desfechos entre diferentes organoides5. Alternativamente, células pré-diferenciadas que são auto-montadas em microtissues com tipos de células específicas do tecido para estudar interações células locais são excelentes modelos, onde é viável isolar os componentes auto-montados. Particularmente em pesquisas cardíacas humanas, o desenvolvimento de microtissues cardíacas 3D com componentes multicelulares provou ser desafiador quando as células são derivadas de diferentes linhas de pacientes ou fontes comerciais.
Para melhorar nossa compreensão mecanicista dos comportamentos celulares em um modelo fisiologicamente relevante, personalizado e in vitro, idealmente todos os tipos de células componentes devem ser derivados da mesma linha de pacientes. No contexto de um coração humano, um modelo in vitro cardíaco verdadeiramente representativo capturaria o crosstalk entre tipos de células predominantes, ou seja, cardiomócitos (CMs), células endoteliais (CE) e fibroblastos cardíacos (CFs)6,7. A recapitulação fiel de um miocárdio não requer apenas alongamento biofísico e estimulação eletrofisiológica, mas também sinalização celular-célula que surge de tipos celulares de suporte como ECs e CFs8. Os CFs estão envolvidos na síntese da matriz extracelular e na manutenção da estrutura tecidual; e em estado patológico, os CFs podem induzir a fibrose e alterar a condução elétrica nos CMs9. Da mesma forma, as CE podem regular propriedades contratuais de CMs através de sinalização paracrina e fornecimento de demandas metabólicas vitais10. Portanto, há a necessidade de microtissues cardíacas humanas compostas por todos os três principais tipos de células para permitir que experimentos fisiologicamente relevantes de alta produtividade sejam realizados.
Aqui, descrevemos uma abordagem inferior na fabricação de microtissues cardíacas por derivação de cardiomiócitos derivados do iPSC (iPSC-CMs), células endoteliais derivadas do iPSC (iPSC-ECs) e fibroblastos cardíacos derivados do iPSC (iPSC-CFs) e sua cultura 3D em microtissue cardíacos uniformes. Este método fácil de gerar microtissues cardíacas espontaneamente pode ser utilizado para modelagem de doenças e testes rápidos de drogas para compreensão funcional e mecanicista da fisiologia cardíaca. Além disso, tais plataformas multicelulares de microtissue cardíacas poderiam ser exploradas com técnicas de edição de genomas para emular a progressão de doenças cardíacas ao longo do tempo sob condições crônicas ou agudas de cultura.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D micro-molds</td>
			<td>Microtissues</td>
			<td>12-81 format</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9104697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement minus Insulin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement plus Insulin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel, hESC-qualified matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin T Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-120-403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-110-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDR2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-81707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V13242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>4942086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium</td>
			<td></td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 basal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit</td>
			<td>LifeLIne Cell Technology</td>
			<td>LS-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose free RPMI medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11879-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF-165</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1-endo</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Sorting Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Rinsing Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11835055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>red</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin Alexa Fluor&#174; 488-conjugated Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC2105G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of 3d cardiac microtissue arrays using human ipsc-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells

A geração de cardiomiócitos humanos (CMs), fibroblastos cardíacos (CFs) e células endoteliais (CE) de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) proporcionou uma oportunidade única para estudar a interação complexa entre diferentes tipos de células cardiovasculares que impulsionam o desenvolvimento de tecidos e doenças. Na área de modelos de tecido cardíaco, várias abordagens tridimensionais sofisticadas (3D) usam cardiomiócitos pluripotentes induzidos derivados de células-tronco (iPSC-CMs) para imitar relevância fisiológica e ambiente de tecido nativo com uma combinação de matrizes extracelulares e crosslinkers. No entanto, esses sistemas são complexos para fabricar sem experiência em microfabização e requerem várias semanas para se auto-montar. Mais importante, muitos desses sistemas não possuem células vasculares e fibroblastos cardíacos que compõem mais de 60% dos não-miócitos no coração humano. Aqui descrevemos a derivação de todos os três tipos de células cardíacas de iPSCs para fabricar microtissues cardíacas. Esta técnica de moldagem de réplica fácil permite a cultura de microtissue cardíaco em placas de cultura celular multi-bem padrão por várias semanas. A plataforma permite o controle definido pelo usuário sobre tamanhos de microtissue com base na densidade inicial de semeadura e requer menos de 3 dias para que a automontagem atinja contrações microtissuas cardíacas observáveis. Além disso, as microtissues cardíacas podem ser facilmente digeridas, mantendo alta viabilidade celular para interrogatório unicelular com o uso de citometria de fluxo e sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq). Imaginamos que este modelo in vitro de microtissues cardíacas ajudará a acelerar os estudos de validação na descoberta de medicamentos e modelagem de doenças.

Caracterização de icometria e citometria de fluxo de CMs, CEs e CFs derivados do iPSC Para gerar microtissues cardíacas compostas por iPSC-CMs, iPSC-CEs e iPSC-CFs, todos os três tipos de células são diferenciados e caracterizados individualmente. A diferenciação in vitro de iPSCs para iPSC-CMs melhorou nos últimos anos. No entanto, o rendimento e a pureza dos iPSC-CMs diferem de linha para linha. O protocolo atual produz mais de 75% de iPSC-CMs puros que começam a bater espontaneam...

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Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Aqui, descrevemos uma metodologia fácil de usar para gerar matrizes microtissue cardíacas auto-montadas em 3D compostas de cardiomiócitos pluripotentes pluripotentes induzidos pelo homem, cardiomiócitos, fibroblastos cardíacos e células endoteliais. Esta técnica de necessidade de células fáceis de usar e baixas para gerar microtissues cardíacas pode ser implementada para modelagem de doenças e estágios iniciais do desenvolvimento de medicamentos.

Fabricação de matrizes microtissue cardíacas 3D usando Cardiomiócitos derivados do iPSC humano, fibroblastos cardíacos e células endoteliais

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

O protocolo combina o poder de gerar tipos de células cardiovasculares humanas usando células-tronco pluripotentes induzidas e uma técnica versátil para gerar esferoides cardíacos em menos de 72 horas. Estes esferoides cardíacos podem ser usados para modelagem de doenças e testes de drogas. Uma das principais vantagens desta técnica fácil é que se poderia gerar quase 1000 esferoides cardíacos batendo em uma placa padrão de 12 poços.E o mais importante, cada esferoide cardíaco pode ser testado para sua função contratil usando técnica baseada em imagem. Depois de derreter surgiu no micro-ondas, coloque-o no armário de biossegurança e deixe esfriar por três minutos. Pipeta 700 microliters da agarose derretida e adicioná-lo ao micromold de silicone de uma matriz de nove por nove, tomando cuidado para evitar gerar bolhas.Coloque cuidadosamente o molde no bloco de gelo pré-frio para acelerar a duração da agarose. Uma vez que a agarose se torne translúcida, dobre cuidadosamente as bordas do micromold para losen a réplica agarose e retire suavemente a réplica de todos os lados para desvincula-la do micromold de silicone. Transfira a bandeja de microtissue agarose contendo 81 recessos circulares em uma placa estéril de 12 poços, em seguida, adicione dois mililitros de PBS à bandeja de microtissue agarose, e inspecione-a sob o microscópio para quaisquer bolhas presas ou poços de forma irregular.Submergir a bandeja de agarose em dois mililitros de 70% de etanol durante a noite, seguido pelo tratamento UV no armário de biossegurança por uma hora. Retire o 70% do etanol e lave duas vezes com água destilada, e uma vez com dois mililitros de PBS. Uma vez que os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos, fibroblastos cardíacos e células endoteliais são contados após a tentação e neutralização, coloque as suspensões celulares no gelo.Em um novo tubo, misture os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos, fibroblastos cardíacos e células endoteliais. Em seguida, remova o PBS do poço e da câmara de semeadura celular sem tocar nos recessos e adicione 200 microliters da suspensão celular dropwise. Permita que as células se instalem a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por duas horas.Adicione o meio de fabricação de micro tecidos ao redor do molde de agarose para cobrir a superfície da câmara interna. Após 24 horas, observe para esferoides auto-montados e compactos nos recessos circulares. Troque o meio a cada dois dias para manter os esferoides.Normalmente, após 48 horas, pode-se observar espancamento espontâneo dos esferoides. Cultume os tipos de células individuais separadamente no meio da matriz da membrana do porão, ou slides de câmara revestidos de gelatina. Tire suavemente os microtissues cardíacos dos recessos circulares, e colete-os em um tubo de crônica de 15 mililitros.Aspire o meio e enxágue as células ou os microtissues, com um mililitro de PBS. Em seguida, fixar as células ou os microtissues com tampão de fixação contendo 4,2% pfa e incubar à temperatura ambiente. Aspire o PFA e incuba as células ou os microtissues com um mililitro de solução permeabilizante.Em seguida, aspire a solução e enxágue com dois a três mililitros de PBS. Adicione 500 a 1000 microliters de solução de bloqueio às células e incubar por pelo menos uma hora para os slides da câmara, e por três a quatro horas para os microtissues. Incubar as amostras com anticorpos conjugados na solução de bloqueio por uma hora para os slides da câmara, e durante a noite a quatro graus Celsius para os microtissues cardíacos.Lave os slides da câmara três vezes com 500 microlitres de 0,1%Tween 20, com cinco minutos de duração entre cada lavagem, em seguida, realize uma lavagem final com PBS. Lave os micro tecidos cardíacos cinco vezes com dois mililitros de 0,1%Tween 20, com uma duração de 20 minutos entre cada lavagem. Em seguida, faça uma lavagem final por mais 20 minutos.Incubar as células ou os microtissues com DAPI antes da microscopia confocal, em seguida, transfira cuidadosamente os microtissues cardíacos para um prato de fundo de vidro de 35 milímetros, e adicione PBS para submergir o microtissue. Tire os microtissues dos recessos circulares com um médio usando uma ponta de pipeta larga ou mililitro em um tubo crônico de 15 mililitros, e permita que eles se instalem. Em seguida, aspire o meio e enxágue com um mililitro PBS.Adicione 200 a 300 microliters do tampão de digestão da enzima e incubar por 10 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, misture os microtissues suavemente por um minuto e repita a incubação. Após a incubação, misture os microtissues vigorosamente com uma ponta de pipeta de um mililitro regular para digeri-la em células únicas.Obtenha uma suspensão de célula turva e neutralize imediatamente a suspensão celular com cinco mililitros de meio contendo 5%FBS. Coe a suspensão celular através de um coador de células de 40 micrômetros, e conte o número total de células. Centrifugar a suspensão unicelular a 300 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Aspire o supernatante e resuspenque as células em tampão de ligação anexo com fitc anexo V e iodeto de propidium, ou corante de exclusão de células mortas TO-PRO-3, e incubar por 10 minutos no gelo. Após a incubação, adicione 300 microliters do tampão de ligação de anexação à suspensão celular e transfira-o para um tubo FACS fundo redondo para análise de citometria de fluxo. Cardiomiócitos pluripotentes pluripotentes induzidos, células endoteliais e fibroblastos cardíacos foram visualizados por meio de microscopia de contraste de fase.A pureza de diferentes tipos celulares foi determinada por meio da coloração imuno e citometria de fluxo. Troponina T foi usada como marcador para cardiomiócitos, e mais de 90% de pureza foi alcançada. A molécula de adesão celular endotelial plaquetária CD31 e vimentina foram utilizadas como marcadores para células endoteliais e fibroblastos cardíacos, e indicaram pureza acima de 98 e 96%, respectivamente.A coloração da imunofluorescência revelou que os cardiomiócitos eram os mais pesados e ocupavam o centro das microtissues, enquanto as células endoteliais eram intercaladas ao longo dos microtissuos, e os fibroblastos cardíacos ocupavam predominantemente a periferia. A digestão das microtissues usando este ritmo e liberase TL resultou em proporções celulares altamente viáveis com menos células apoptóticas após duas semanas de cultura. A exposição de uma hora dos microtissues cardíacos a uma alta concentração de doxorubicina induzida dose de cardiotoxicidade dependente.A contratude dos micro tecidos, e o movimento dos vetores geraram um pseudo mapa de calor que ilustrava o perfil médio de contração através do microtissue. O movimento contratil das microtissues cardíacas gerou picos positivos que foram medidos como a velocidade de contração, a velocidade de relaxamento e a taxa de batida, que foi calculada como o tempo entre dois ciclos de contração. A contratilidade das microtissues cardíacas foi consistente ao longo de quatro semanas na cultura.O aquecimento das células é um dos passos mais importantes deste protocolo em particular, onde deve-se tomar cuidado para dispensar cuidadosamente a suspensão da célula dropwise na matriz de agarose para distribuição uniforme dentro dos microwells, e para evitar o transbordamento. Usando o protocolo de radiação otimizado desses microtissues, pode-se sujeitar-os a tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, como RNA-seq de células únicas ou ATAC-seq de células únicas para entender padrões específicos de expressão genética celular resultantes de diferentes condições de tratamento.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Encapsulamento de Cardiomyocytes em um hidrogel de fibrina para engenharia de tecidos cardíacos

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Bioengenharia

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Reconstruções anatômicas do sistema venoso cardíaco humano usando contraste Tomografia computadorizada de Amostras de perfusão-fixados

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Criação de tecido cardíaco exibindo integração mecânica de esferóides usando 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

Usando transmissão óptica extraordinária para quantificar biomarcadores cardíacos no soro humano

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocolo para transferência de MicroRNA na medula óssea-derivado hematopoiéticas células-tronco adultas para habilitar celular engenharia combinada com alvo magnético

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Um método baseado em molde líquido de criação livre de andaime tridimensional de tecido cardíaco

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Ensaio padronizado e escalável para estudar perfundido 3D Angiogênico Sprouting de células endotelias derivadas do iPSC in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Redes humanas de cardiomiócitos derivadas de iPSC em matrizes de microeletrodos Multipoços para gravações em potencial de ação recorrente

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Avaliação de Eletrofisiologia Cardíaca Pré-Plínica por Mapeamento Óptico de Dupla Tensão e Cálcio de Fatias Cardíacas Organotípicas Humanas

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...