Name: fabrication of 3d cardiac microtissue arrays using human ipsc-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells
Uploaded: 2021-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells at JoVE.com

Agradecemos a la Dra. Amanda Chase por sus útiles comentarios sobre el manuscrito. El apoyo financiero fue proporcionado por el Programa de Investigación de Enfermedades Relacionadas con el Tabaco (TRDRP) de la Universidad de California, T29FT0380 (D.T.) y 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) y 17MERIT33610009 (J.C.W.); y National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 y NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

1. Medio, reactivo, preparación de placas de cultivo
<ol><li>Solución de lavado celular para cultivo celular: Use solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) sin calcio ni magnesio.</li>
	<li>Medios de diferenciación cardiomiocitaria<ol>
<li>Prepare el medio de diferenciación # 1 agregando un suplemento de 10 ml (50x B27 más insulina) a 500 ml de medio basal de cardiomiocitos (RPMI 1640).</li>
		<li>Prepare el medio de diferenciación # 2 agregando un suplemento de 1...

<ol>
	<li>Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hurdles+to+clinical+translation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 156166 (2018).</li><li>Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+the+cardiac+microenvironment:+Multicellular+microphysiological+systems+for+drug+screening.">Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).</li><li>Cartledge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+crosstalk+between+cardiac+fibroblasts+and+adult+cardiomyocytes+by+soluble+mediators.">Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators.</a> Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).</li><li>Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+endothelial-myocardial+signaling:+its+role+in+cardiac+growth,+contractile+performance,+and+rhythmicity.">Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity.</a> Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).</li><li>Huebsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+video-based+analysis+of+contractility+and+calcium+flux+in+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+cultured+over+different+spatial+scales.">Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pravastatin+reverses+obesity-induced+dysfunction+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+via+a+nitric+oxide-dependent+mechanism.">Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism.</a> European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).</li><li>Williams, I. M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).</li><li>Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 1-7 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+in+vitro+modeling+of+cardiac+fibrosis.">Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis.</a> Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+via+second+heart+field+progenitors.">Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors.</a> Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).</li><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-iPSC-derived+cardiac+stromal+cells+enhance+maturation+in+3d+cardiac+microtissues+and+reveal+non-cardiomyocyte+contributions+to+heart+disease.">Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease.</a> Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).</li><li>Burridge, P. W., Holmstr&#246;m, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+culture+and+cardiomyocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/&#946;-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/&#946;-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Buikema, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+and+reduced+cell-cell+contact+synergistically+induce+massive+expansion+of+functional+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+Advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+expression+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-+and+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells.">Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells.</a> Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Gu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+cells.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).</li><li>Acharya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+transcription+factor+Tcf21+is+required+for+lineage-specific+EMT+of+cardiac+fibroblast+progenitors.">The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors.</a> Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).</li><li>Wessels, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardially+derived+fibroblasts+preferentially+contribute+to+the+parietal+leaflets+of+the+atrioventricular+valves+in+the+murine+heart.">Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart.</a> Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).</li><li>Ali, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+heterogeneity+of+cardiac+fibroblasts+does+not+predict+pathological+proliferation+and+activation.">Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation.</a> Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).</li><li>McMurtrey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytic+and+numerical+models+of+oxygen+and+nutrient+diffusion,+metabolism+dynamics,+and+architecture+optimization+in+three-dimensional+tissue+constructs+with+applications+and+insights+in+cerebral+organoids.">Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids.</a> Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).</li><li>Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+customized+extracellular+niche+engineering:+progress+in+cell-entrapment+technologies.">Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies.</a> Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).</li><li>Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+Multi-dimensional+induced+pluripotent+stem+cells-based+model+platforms+to+assess+cardiotoxicity+in+cancer+therapies.">Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies.</a> Front Pharmacol. 12, 39 (2021).</li><li>Rhee, J. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+secondary+iron+overload+cardiomyopathy+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).</li><li>Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+in+cardiovascular+development,+disease,+and+medicine.">Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).</li><li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+considerations+for+single-cell+RNA+sequencing+approaches.">Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).</li><li>Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-wide+approaches+in+induced+pluripotent+stem+cell+models.">Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models.</a> Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).</li><li>Maddah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+platform+for+functional+characterization+of+stem-cell-derived+cardiomyocytes+with+applications+in+cardiotoxicity+testing.">A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing.</a> Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).</li><li>Sala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Musclemotion:+A+versatile+open+software+tool+to+quantify+cardiomyocyte+and+cardiac+muscle+contraction+in+vitro+and+in+vivo.">Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).</li></ol>

Para generar microtejidos cardíacos a partir de iPSC-CM, iPSC-CE e iPSC-CC prediferenciados, es esencial obtener un cultivo altamente puro para un mejor control del número de células después de la compactación celular inhibida por contacto dentro de los microtejidos cardíacos. Recientemente, Giacomelli et. al.18 han demostrado la fabricación de microtejidos cardíacos utilizando iPSC-CMs, iPSC-ECs y iPSC-CFs. Los microtejidos cardíacos generados utilizando el método descrito consisten en ...

El descubrimiento de fármacos y el modelado de enfermedades en el campo de la investigación cardiovascular se enfrentan a varios desafíos debido a la falta de muestras clínicamente relevantes y a herramientas traslacionales inadecuadas1. Los modelos preclínicos altamente complejos o los modelos unicelulares in vitro demasiado simplificados no presentan condiciones fisiopatológicas de manera reproducible. Por lo tanto, varias plataformas miniaturizadas de ingeniería tisular han evolucionado para ayudar a cerrar la brecha, con el objetivo de lograr un equilibrio entre la facilidad de aplicación de una manera de alto rendimiento y la recapitulación fiel de la función tisular2,3. Con el advenimiento de la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), las herramientas de ingeniería de tejidos se pueden aplicar a células específicas del paciente con o sin estado de enfermedad cardiovascular subyacente para responder a las preguntas de investigación4,5,6. Tales modelos de ingeniería tisular con composición celular similar al tejido cardíaco podrían utilizarse en los esfuerzos de desarrollo de fármacos para probar la cardiotoxicidad y la disfunción inducidas por cambios patológicos en el comportamiento de uno o varios tipos de células.
Los microtejidos u organoides autoensamblados derivados de iPSCs humanas son estructuras tridimensionales (3D) que son ensamblajes en miniatura similares a tejidos que exhiben similitudes funcionales con sus contrapartes in vivo . Existen varios enfoques diferentes que permiten la formación de organoides in situ a través de la diferenciación dirigida de iPSCs o a través de la formación de cuerpos embrionarios4. Los organoides resultantes son una herramienta indispensable para estudiar los procesos morfogenéticos que impulsan la organogénesis. Sin embargo, la presencia de una variedad de poblaciones celulares y las diferencias en la autoorganización pueden conducir a la variabilidad en los resultados entre diferentes organoides5. Alternativamente, las células prediferenciadas que se autoensamblan en microtisajes con tipos de células específicas de tejidos para estudiar las interacciones célula-célula locales son excelentes modelos, donde es factible aislar los componentes autoensamblados. Particularmente en la investigación cardíaca humana, el desarrollo de microtejidos cardíacos 3D con componentes multicelulares ha demostrado ser un desafío cuando las células se derivan de diferentes líneas de pacientes o fuentes comerciales.
Para mejorar nuestra comprensión mecanicista de los comportamientos celulares en un modelo in vitro fisiológicamente relevante, personalizado, idealmente todos los tipos de células componentes deben derivarse de la misma línea de pacientes. En el contexto de un corazón humano, un modelo cardíaco in vitro verdaderamente representativo capturaría la diafonía entre los tipos de células predominantes, a saber, cardiomiocitos (CM), células endoteliales (CE) y fibroblastos cardíacos (CEF)6,7. La recapitulación fiel de un miocardio no solo requiere estiramiento biofísico y estimulación electrofisiológica, sino también señalización célula-célula que surge del soporte de tipos celulares como las CE y las CEF8. Los CF están involucrados en la síntesis de la matriz extracelular y el mantenimiento de la estructura del tejido; y en estado patológico, los CF pueden inducir fibrosis y alterar la conducción eléctrica en los CM9. Del mismo modo, las CE pueden regular las propiedades contráctiles de los CM a través de la señalización paracrina y el suministro de demandas metabólicas vitales10. Por lo tanto, existe la necesidad de microtejidos cardíacos humanos compuestos por los tres tipos principales de células para permitir que se realicen experimentos de alto rendimiento fisiológicamente relevantes.
Aquí, describimos un enfoque de abajo hacia arriba en la fabricación de microtejidos cardíacos mediante la derivación de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC (iPSC-CM), células endoteliales derivadas de iPSC (iPSC-EC) y fibroblastos cardíacos derivados de iPSC (iPSC-CFs) y su cultivo 3D en matrices de microtissue cardíacos uniformes. Este método fácil de generar microtejidos cardíacos que laten espontáneamente se puede utilizar para el modelado de enfermedades y pruebas rápidas de medicamentos para la comprensión funcional y mecanicista de la fisiología del corazón. Además, tales plataformas de microtejidos cardíacos multicelulares podrían explotarse con técnicas de edición del genoma para emular la progresión de la enfermedad cardíaca a lo largo del tiempo en condiciones de cultivo crónicas o agudas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D micro-molds</td>
			<td>Microtissues</td>
			<td>12-81 format</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9104697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement minus Insulin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement plus Insulin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel, hESC-qualified matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin T Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-120-403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-110-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDR2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-81707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V13242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>4942086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium</td>
			<td></td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 basal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit</td>
			<td>LifeLIne Cell Technology</td>
			<td>LS-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose free RPMI medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11879-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13256029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF-165</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1-endo</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Sorting Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Rinsing Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11835055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>red</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin Alexa Fluor&#174; 488-conjugated Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC2105G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of 3d cardiac microtissue arrays using human ipsc-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells

La generación de cardiomiocitos humanos (CM), fibroblastos cardíacos (CF) y células endoteliales (CE) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) ha brindado una oportunidad única para estudiar la compleja interacción entre diferentes tipos de células cardiovasculares que impulsa el desarrollo de tejidos y la enfermedad. En el área de los modelos de tejido cardíaco, varios enfoques tridimensionales sofisticados (3D) utilizan cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-CM) para imitar la relevancia fisiológica y el entorno del tejido nativo con una combinación de matrices extracelulares y reticulantes. Sin embargo, estos sistemas son complejos de fabricar sin experiencia en microfabricación y requieren varias semanas para autoensamblarse. Lo más importante es que muchos de estos sistemas carecen de células vasculares y fibroblastos cardíacos que constituyen más del 60% de los no miocitos en el corazón humano. Aquí describimos la derivación de los tres tipos de células cardíacas a partir de iPSC para fabricar microtejidos cardíacos. Esta técnica de moldeo de réplica fácil permite el cultivo de microtinue cardíaco en placas de cultivo celular estándar de múltiples pocillos durante varias semanas. La plataforma permite el control definido por el usuario sobre los tamaños de microtejidos en función de la densidad de siembra inicial y requiere menos de 3 días para que el autoensamblaje logre contracciones observables de microtejidos cardíacos. Además, los microtejidos cardíacos se pueden digerir fácilmente mientras se mantiene una alta viabilidad celular para el interrogatorio de una sola célula con el uso de citometría de flujo y secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq). Prevemos que este modelo in vitro de microtejidos cardíacos ayudará a acelerar los estudios de validación en el descubrimiento de fármacos y el modelado de enfermedades.

Caracterización de inmunotinción y citometría de flujo de CM, CE y CG derivados de iPSC Para generar microtejidos cardíacos compuestos de iPSC-CM, iPSC-CE e iPSC-CEF, los tres tipos de células se diferencian y caracterizan individualmente. La diferenciación in vitro de iPSCs a iPSC-CMs ha mejorado en los últimos años. Sin embargo, el rendimiento y la pureza de los iPSC-CM difieren de una línea a otra. El protocolo actual produce más del 75% de iPSC-CM puros que espontáneamente comi...

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Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Aquí, describimos una metodología fácil de usar para generar matrices de microtejidos cardíacos autoensamblados en 3D compuestos por cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes prediferenciadas inducidas por humanos, fibroblastos cardíacos y células endoteliales. Esta técnica fácil de usar y de baja capacidad de células para generar microtejidos cardíacos se puede implementar para el modelado de enfermedades y las primeras etapas del desarrollo de fármacos.

Fabricación de matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, fibroblastos cardíacos y células endoteliales

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

El protocolo combina el poder de generar tipos de células cardiovasculares humanas utilizando células madre pluripotentes inducidas y una técnica versátil para generar esferoides cardíacos en menos de 72 horas. Estos esferoides cardíacos se pueden utilizar para el modelado de enfermedades y pruebas de drogas. Una de las principales ventajas de esta técnica fácil es que se podrían generar casi 1000 esferoides cardíacos en una placa estándar de 12 pocillos.Y lo más importante, todos y cada uno de los esferoides cardíacos se pueden ensayar por su función contráctil utilizando una técnica basada en imágenes. Después de derretir la agarosa en el microondas, colóquela en el gabinete de bioseguridad y deje que se enfríe durante tres minutos. Pipetee 700 microlitros de la agarosa fundida y agréguela al micromoldo de silicona de una matriz de nueve por nueve, teniendo cuidado de evitar generar burbujas.Coloque cuidadosamente el molde en el bloque de hielo prefrío para acelerar la duración de la agarosa. Una vez que la agarosa se vuelve translúcida, doble cuidadosamente los bordes del micromoldo para perder la réplica de agarosa y pelar suavemente la réplica de todos los lados para separarla del micromold de silicona. Transfiera la bandeja de microtejigas de agarosa que contiene 81 huecos circulares a una placa estéril de 12 pocillos, luego agregue dos mililitros de PBS a la bandeja de microtinaja de agarosa e inspecciónela bajo el microscopio en busca de burbujas atrapadas o pozos de forma irregular.Sumerja la bandeja de agarosa en dos mililitros de etanol al 70% durante la noche, seguido de un tratamiento UV en el gabinete de bioseguridad durante una hora. Retire el etanol al 70% y lave dos veces con agua destilada, y una vez con dos mililitros de PBS. Una vez que los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas, los fibroblastos cardíacos y las células endoteliales se cuentan después de la tripsinización y neutralización, coloque las suspensiones celulares en el hielo.En un nuevo tubo, mezcle los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas, los fibroblastos cardíacos y las células endoteliales. Luego, retire el PBS del pozo y la cámara de siembra celular sin tocar los huecos, y agregue 200 microlitros de la suspensión celular gota a gota. Permita que las células se asienten a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono durante dos horas.Agregue un medio de fabricación de micro tejidos que rodea el molde de agarosa para cubrir la superficie de la cámara interna. Después de 24 horas, observe los esferoides autoensamblados y compactos en los huecos circulares. Cambie el medio cada dos días para mantener los esferoides.Por lo general, después de 48 horas, se puede observar un latido espontáneo de los esferoides. Cultive los tipos de células individuales por separado en un medio de matriz de membrana basal o en portaobjetos de cámara recubiertos de gelatina. Enjuague suavemente los microtusores cardíacos de los huecos circulares y recójalos en un tubo de crónica de 15 mililitros.Aspirar el medio y enjuagar las células o los microtejidos, con un mililitro de PBS. Luego, fije las células o los microtejidos con un tampón de fijación que contenga 4.2% de PFA e incube a temperatura ambiente. Aspirar el PFA e incubar las células o los microtejidos con un mililitro de solución permeabilizante.Luego, aspire la solución y enjuague con dos o tres mililitros de PBS. Agregue de 500 a 1000 microlitros de solución de bloqueo a las células e incube durante al menos una hora para los portaobjetos de la cámara, y durante tres a cuatro horas para los microtejidos. Incubar las muestras con anticuerpos conjugados en la solución de bloqueo durante una hora para los portaobjetos de la cámara, y durante la noche a cuatro grados centígrados para los microtejidos cardíacos.Lave los deslizadores de la cámara tres veces con 500 microlitros de 0.1% Tween 20, con cinco minutos de duración entre cada lavado, luego realice un lavado final con PBS. Lave los micro tejidos cardíacos cinco veces con dos mililitros de 0.1%Tween 20, con una duración de 20 minutos entre cada lavado. Luego, realice un lavado final durante 20 minutos adicionales.Incube las células o los microtejidos con DAPI antes de la microscopía confocal, luego transfiera cuidadosamente los microtejidos cardíacos a un plato de fondo de vidrio de 35 milímetros y agregue PBS para sumergir el microtejido. Enjuague los microtejidos de los huecos circulares con uno mediano usando una punta de pipeta ancha o de un mililitro en un tubo crónico de 15 mililitros, y deje que se asienten. Luego, aspire el medio y enjuague con un mililitro PBS.Agregue de 200 a 300 microlitros del tampón de digestión enzimática e incube durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Luego mezcle los microtejidos suavemente durante un minuto y repita la incubación. Después de la incubación, mezcle los microtejidos vigorosamente con una punta de pipeta regular de un mililitro para digerirlo en células individuales.Obtenga una suspensión de células turbias, y neutralice inmediatamente la suspensión celular con cinco mililitros de medio que contengan 5% fbs. Cuele la suspensión celular a través de un colador celular de 40 micrómetros y cuente el número total de células. Centrifugar la suspensión unicelular a 300 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Aspirar el sobrenadante y resuspendir las células en tampón de unión a anexinas con FITC Annexin V y yoduro de propidio, o colorante de exclusión de células muertas TO-PRO-3, e incubar durante 10 minutos en hielo. Después de la incubación, agregue 300 microlitros del tampón de unión a la anexina a la suspensión celular y transfiéralo a un tubo FACS de fondo redondo para el análisis de citometría de flujo. Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas purificadas, las células endoteliales y los fibroblastos cardíacos se visualizaron mediante microscopía de contraste de fase.La pureza de los diferentes tipos de células se determinó mediante inmunomanchación y citometría de flujo. La troponina T se utilizó como marcador de cardiomiocitos, y se logró una pureza superior al 90%. La molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias CD31 y vimentina se utilizaron como marcadores para células endoteliales y fibroblastos cardíacos, e indicaron una pureza superior al 98 y 96%, respectivamente.La tinción de inmunofluorescencia reveló que los cardiomiocitos eran los más pesados y ocupaban el centro de los microtejidos, mientras que las células endoteliales se intercalaban a lo largo de los microtejidos, y los fibroblastos cardíacos ocupaban predominantemente la periferia. La digestión de los microtejidos utilizando este ritmo uno y Liberase TL dio como resultado proporciones celulares altamente viables con menos células apoptóticas después de dos semanas en cultivo. La exposición de una hora de los microtisones cardíacos a una alta concentración de doxorrubicina indujo cardiotoxicidad dependiente de la dosis.La contractilidad de los micro tejidos y el movimiento de los vectores generaron un pseudo mapa de calor que ilustró el perfil de contracción promedio a través del microtejido. El movimiento contráctil de los microtejidos cardíacos generó picos positivos que se midieron como la velocidad de contracción, la velocidad de relajación y la tasa de latido, que se calculó como el tiempo transcurrido entre dos ciclos de contracción. La contractilidad de los microtejidos cardíacos fue consistente durante cuatro semanas en cultivo.El calentamiento de las células es uno de los pasos más importantes en este protocolo en particular, donde se debe tener cuidado de dispensar cuidadosamente la suspensión celular en forma de gota en la matriz de agarosa para una distribución uniforme dentro de los micropocillos y para evitar el desbordamiento. Utilizando el protocolo de radiación optimizado de estos microtejidos, se podría someterlos a tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, como RNA-seq de una sola célula o ATAC-seq de una sola célula para comprender los patrones de expresión génica específicos de la célula que resultan debido a diferentes condiciones de tratamiento.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

La encapsulación de los cardiomiocitos en un hidrogel de fibrina para ingeniería de tejidos cardíacos

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Investigación

Bioingeniería

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Las reconstrucciones anatómicas del sistema venoso cardíaco humana usando tomografía computarizada con contraste de las muestras de perfusión fijos

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Creación de tejido cardiaco que exhibe la integración mecánica de esferoides usando bioprinting 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

Uso de transmisión óptica extraordinaria para cuantificar marcadores cardíacos en suero humano

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocolo para la transferencia de microARN en médula ósea hematopoyéticas células madre adultas para permitir ingeniería celular combinado con orientación magnética

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Un método basado en el molde neto creación libre de andamio tridimensional de tejido cardiaco

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Ensayo estandarizado y escalable para estudiar la brotación angiogénica 3D perfundida de células endoteliales derivadas de iPSC in Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Redes de cardiomiocitos derivados de iPSC humanos en matrices de microelectrodos multipolos para grabaciones potenciales de acción recurrente

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Evaluación de electrofisiología cardíaca preclínica por doble voltaje y mapeo óptico de calcio de cortes cardíacos organotípicos humanos

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...