Name: a mouse model to investigate the role of cancer-associated fibroblasts in tumor growth
Uploaded: 2020-12-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke alle medlemmerne af Coller-laboratoriet for nyttige input. H.A.C. var Milton E. Cassel lærd af Rita Allen Foundation. Vi anerkender NIH / NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, Melanom Research Alliance Team Science Award, Cancer Research Institute Clinical Laboratory Integration Program Award, Iris Cantor Women's Health Center / UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, University of California Cancer Research Coordination Committee, David Geffen School of Medicine Metabolism Theme Award, Clinical Translational Science Institute og Jonsson Comprehensive Cancer Center, Innovationspriser fra Broad Stem Cell Research Center (Rose Hills og Ha Gaba), en pris fra UCLA SPORE i prostatakræft (National Cancer Institute of the National Institutes of Health under tildelingsnummer P50CA092131), en innovationspris fra Broad Stem Cell Center, Eli og Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research ved UCLA, Tumorcellebiologi træningsprogram (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), dermatologi T32-programmet ved UCLA AR071307 og UCLA muskelcellebiologi, patofysiologi og terapi T32 træningsprogram 5 T32 AF 65972.

Alle beskrevne forsøg blev godkendt af Animal Care Committee ved University of California, Los Angeles.
BEMÆRK: Vælg kræftceller og fibroblaster, der matcher værtsmusene for musestamme. Vælg kræftceller og fibroblaster, der matcher værtsmusens køn. Få mus fra avlskolonier eller køb dem fra velrenommerede leverandører. Indfør tumorer i mus, der er ~ 8-10 uger gamle. Mus med pels vil være i telogen eller hvilefasen af hårsækkecyklussen. Planlæg for et forhold på 0,5 til 3 fibro...

I eksperimentet i figur 1 resulterede samtidig introduktion af humane dermale fibroblaster med humane A2058 melanomceller i større tumorer, end når melanomcellerne blev introduceret uden co-injicerede fibroblaster. Denne forskel kunne let påvises baseret på tumorvolumen og tumorvægt. Resultaterne er i overensstemmelse med flere rapporter om, at kræftassocierede fibroblaster kan fremme tumorvækst 5,6,7,8.<sup class="...

Inden for tumormikromiljøet er en af de mest fremtrædende celletyper den kræftassocierede fibroblast (CAF)1. Disse carcinomassocierede fibroblaster kan spille en tumorundertrykkende rolle 2,3. For eksempel udskiller S100A-ekspressive fibroblaster kollagener, der kan indkapsle kræftfremkaldende stoffer og beskytte mod dannelse af karcinom4. Endvidere forårsager udtømning af α-glat muskelactin (SMA)-positive myofibroblaster i kræft i bugspytkirtlen immunsuppression og fremskynder progression af kræft i bugspytkirtlen2. CAF'er kan også udvikle sig sammen med kræftceller og fremme tumorprogression 5,6,7,8. Fibroblaster kan syntetisere og udskille ekstracellulære matrixproteiner, der skaber et tumorfremmende miljø8. Disse ekstracellulære matrixproteiner kan forårsage mekanisk afstivning af vævet, hvilket er forbundet med tumorprogression 9,10. Den deponerede ekstracellulære matrix kan fungere som en fysisk barriere, der hæmmer immuninfiltration11. Matrixaflejring af CAF'er har også været forbundet med tumorinvasion, da fibronectin genereret af CAF'er har vist sig at fremme tumorinvasion12. CAF'er fremmer angiogenese og rekrutterer immunosuppressive celler til tumormikromiljøet ved at udskille transformerende vækstfaktor-β (TGF-β), vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF), interleukin-6 (IL-6) og CXC-kemokinligand 12 (CXCL12) 13,14,15. På grund af deres centrale rolle i at fremme tumorvækst er kræftassocierede fibroblaster et voksende mål for kræftbehandling 6,16,17,18.
Protokollen nedenfor beskriver en metode til at teste, hvordan fibroblaster påvirker væksten af tumorer i en veletableret og udbredt musemodel for tumorvækst. For at forstå vigtigheden af fibroblaster i tumormikromiljøet blev standardprotokollen for introduktion af kræftceller i mus for at overvåge deres vækst ændret til at omfatte fibroblaster med kræftcelleintroduktionen. Kræftcellerne kan indføres subkutant eller intradermalt. Intradermal introduktion ville resultere i tumorer, der opstår fra selve huden. Xenotransplantater, hvor kræftceller og fibroblaster injiceres sammen i mus, repræsenterer et vigtigt metodologisk værktøj til at dissekere rollen som fibroblaster, subpopulationer af fibroblaster og proteinfaktorer i evnen til at fremme kræftvækst 19,20,21. En detaljeret protokol for samtidig injektion af kræftceller og fibroblaster i mus er tilvejebragt. Denne metode kan bruges til at sammenligne tilstedeværelsen eller fraværet af fibroblaster, til at sammenligne fibroblaster fra forskellige kilder20 eller til at sammenligne fibroblaster med og uden ekspression af specifikke proteiner19. Efter kræftceller og fibroblaster er introduceret, tumor størrelse kan overvåges over tid. Ved afslutningen af forsøgene kan tumorer dissekeres og vejes. Ved at overvåge tumorvækst over tid kan betydningen af forskellige faktorer dissekeres.
Der er mulige alternative tilgange til at studere fibroblasternes rolle i tumorvækst. Som et eksempel er der Cre-loxed-baserede modeller, der giver mulighed for vævsspecifik knockout af gener med drivere udtrykt fortrinsvis i fibroblaster. Sådanne tilgange giver også muligheder for at undersøge rollen som specifikke gener og veje i fibroblaster til tumorprogression. Sammenlignet med Cre-lox-baserede tilgange ville den leverede protokol repræsentere en signifikant hurtigere tilgang til overvågning af fibroblasters rolle, fordi tumorvækst ville blive overvåget over blot et par uger. Den leverede tilgang er også betydeligt billigere, fordi den ikke kræver generering og opbevaring af kolonier af genetisk manipulerede mus. Den medfølgende protokol kan bruges til hurtigt at teste effekten af knockdown af forskellige gener ved hjælp af shRNA'er i stedet for at skulle udvikle musekolonier. Den leverede tilgang er også mere fleksibel, fordi den vil give mulighed for en sammenligning af forskellige antal fibroblaster, forskellige forhold mellem kræftceller og fibroblaster, knockdown af forskellige gener og endda sammenligning af fibroblaster fra forskellige vævssteder eller arter. En Cre-lox-tilgang ville have den fordel, at fibroblasterne er til stede i musene i en mere fysiologisk sammenhæng.
Protokollen rapporteret her ville være værdifuld for forskere, der søger at overvåge virkningerne af fibroblaster på tumorvækst hurtigt og omkostningseffektivt. Denne protokol er især værdifuld for forskere, der undersøger forskellige undergrupper af fibroblaster eller fibroblaster fra forskellige kilder på tumorvækst på tumorvækst. Hvis det er vigtigt, at tumorinitiering sker i en fysiologisk sammenhæng, bør genetisk manipulerede musemodeller overvejes.
Der er flere mulige tilgange til at udføre disse eksperimenter. Immunkompetente mus kan bruges som værter, hvilket ville muliggøre undersøgelse af fibroblast-immuncelleinteraktioner. For immunkompetente musemodeller skal musekræftceller og museembryonale fibroblaster (MEF'er) injiceres. Brugen af MEF'er giver også efterforskeren mulighed for at drage fordel af den brede vifte af knockout-musestammer til at teste tilstedeværelsen eller fraværet af et gen af interesse. Alternativt kan immun-mangelfulde mus bruges til at teste rollen som humane fibroblaster i at fremme væksten af tumorer i mus, der stammer fra humane kræftceller. Introduktion af kræftcellerne kan udføres subkutant eller ortopisk. For melanom, som beskrevet nedenfor, kan tumor-fibroblastblandingen injiceres intradermalt til ortopisk injektion, der nærmere simulerer det sted i huden, hvor et melanom ville udvikle sig.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26G Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal clipper miniARCO with surgical blade #40</td>
			<td>WAHL Professional</td>
			<td>8787-450A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic nude mice (NU/J)</td>
			<td>The Jackson labs</td>
			<td>002019</td>
			<td>These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174; CRL-11147&#8482;</td>
			<td>This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multi Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblasts&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-201-012</td>
			<td>We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS USP grade for injection into mice</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-61A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tissue-culture grade PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterle 25 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>667225B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 100 x 20 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 150 x 20 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 60 x 15 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model to investigate the role of cancer-associated fibroblasts in tumor growth

Kræftassocierede fibroblaster (CAF'er) kan spille en vigtig rolle i tumorvækst ved at skabe et tumorfremmende mikromiljø. Modeller til at studere CAFs rolle i tumormikromiljøet kan være nyttige til at forstå den funktionelle betydning af fibroblaster, fibroblaster fra forskellige væv og specifikke genetiske faktorer i fibroblaster. Musemodeller er afgørende for at forstå bidragyderne til tumorvækst og progression i en in vivo-sammenhæng. Her tilvejebringes en protokol, hvor kræftceller blandes med fibroblaster og indføres i mus for at udvikle tumorer. Tumorstørrelser over tid og endelige tumorvægte bestemmes og sammenlignes mellem grupper. Den beskrevne protokol kan give mere indsigt i CAF'ernes funktionelle rolle i tumorvækst og progression.

A2058 humane melanomceller og primære humane dermale fibroblaster blev dyrket under sterile forhold. Celler blev opsamlet og vasket tre gange med PBS. Immunodeficiente mus (NU/J - Foxn1 nøgen stamme) blev injiceret subkutant på den ene flanke med 0,25 millioner A2058 melanomceller alene. På den anden flanke blev mus injiceret med en blanding af 0,25 millioner A2058 melanomceller og 0,75 millioner fibroblaster. Celler blev injiceret i 12 immundefekte mus. Injektioner i venstre og højr...

Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth at JoVE.com

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

En protokol til co-injicere kræftceller og fibroblaster og overvåge tumorvækst over tid er tilvejebragt. Denne protokol kan bruges til at forstå det molekylære grundlag for fibroblasternes rolle som regulatorer af tumorvækst.

En musemodel til at undersøge rollen som kræftassocierede fibroblaster i tumorvækst

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Tumor Engraftment i en Xenograft musemodel af menneskelige Mantle celle lymfom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

En metode til at definere virkningerne af miljøberigelse på tyktarmen Microbiome biodiversitet i en mus tyktarmen tumoren Model

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide berigelse kombineret med etiket-fri kvantitativ massespektrometri til at undersøge Phosphoproteome i Prostata Cancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for den genetiske Variation i en sporadisk familiær adenomatøs polypose Patient med formatet Chip i rør

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In vivo hæmning af MicroRNA at mindske tumor vækst i mus

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

En 3D Spheroid model som et mere fysiologisk system for kræft-associeret fibroblaster differentiering og invasion in vitro undersøgelser

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolering af proksimale væsker for at undersøge tumormikromiljøet af pancreas adenocarcinom

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Isolering af primær cancer-associerede fibroblaster fra en Syngeneic Murine Model af brystkræft til undersøgelse af målrettede nanopartikler

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

En Ex Vivo Brain Slice Model til at studere og målrette brystkræft hjernemetastatisk tumorvækst

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

En tredimensionel spheroid model til at undersøge tumor-stromal interaktion i hepatocellulær karcinom

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...