Name: a mouse model to investigate the role of cancer-associated fibroblasts in tumor growth
Uploaded: 2020-12-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth at JoVE.com

De auteurs willen alle leden van het Coller-laboratorium bedanken voor hun nuttige input. H.A.C. was de Milton E. Cassel geleerde van de Rita Allen Foundation. We erkennen NIH / NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, Melanoma Research Alliance Team Science Award, Cancer Research Institute Clinical Laboratory Integration Program Award, het Iris Cantor Women's Health Center / UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, University of California Cancer Research Coordinating Committee, David Geffen School of Medicine Metabolism Theme Award, het Clinical Translational Science Institute en Jonsson Comprehensive Cancer Center, Innovation Awards van het Broad Stem Cell Research Center (Rose Hills en Ha Gaba), een Award van de UCLA SPORE in Prostate Cancer (National Cancer Institute of the National Institutes of Health onder awardnummer P50CA092131), een Innovation Award van het Broad Stem Cell Center, het Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research aan de UCLA, het Tumor Cell Biology Training Program (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), het Dermatology T32 Program aan UCLA AR071307 en het UCLA Muscle Cell Biology, Pathophysiology and Therapeutics T32 Training Program 5 T32 AF 65972.

Alle beschreven experimenten werden goedgekeurd door het Animal Care Committee van de Universiteit van Californië, Los Angeles.
OPMERKING: Selecteer kankercellen en fibroblasten die overeenkomen met de gastheermuizen voor muizenstam. Selecteer kankercellen en fibroblasten die overeenkomen met het geslacht van de gastheermuis. Verkrijg muizen uit broedkolonies of koop ze van gerenommeerde leveranciers. Introduceer tumoren in muizen die ~ 8-10 weken oud zijn. Muizen met vacht bevinden zich in d...

In het experiment in figuur 1 resulteerde het co-introduceren van menselijke dermale fibroblasten met menselijke A2058-melanoomcellen in grotere tumoren dan wanneer de melanoomcellen werden geïntroduceerd zonder co-geïnjecteerde fibroblasten. Dit verschil kan gemakkelijk worden gedetecteerd op basis van tumorvolume en tumorgewicht. De resultaten komen overeen met meerdere rapporten dat kanker-geassocieerde fibroblasten tumorgroei kunnen bevorderen 5,6,7,8.</sup...

Binnen de micro-omgeving van de tumor is een van de meest prominente celtypen de kanker-geassocieerde fibroblast (CAF)1. Deze carcinoom-geassocieerde fibroblasten kunnen een tumoronderdrukkende rol spelen 2,3. S100A-tot expressie brengende fibroblasten scheiden bijvoorbeeld collageen af die kankerverwekkende stoffen kunnen inkapselen en beschermen tegen carcinoomvorming4. Verder veroorzaakt uitputting van α-gladde spieractine (SMA)-positieve myofibroblasten bij alvleesklierkanker immunosuppressie en versnelt de progressie van alvleesklierkanker2. CAFs kunnen ook co-evolueren met kankercellen en tumorprogressie bevorderen 5,6,7,8. Fibroblasten kunnen extracellulaire matrixeiwitten synthetiseren en afscheiden die een tumorbevorderende omgeving creëren8. Deze extracellulaire matrixeiwitten kunnen mechanische verstijving van het weefsel veroorzaken, wat geassocieerd is met tumorprogressie 9,10. De afgezette extracellulaire matrix kan fungeren als een fysieke barrière die immuuninfiltratie remt11. Matrixafzetting door CAFs is ook in verband gebracht met tumorinvasie, omdat is aangetoond dat fibronectine gegenereerd door CAFs tumorinvasie bevordert12. CAFs bevorderen angiogenese en rekruteren immunosuppressieve cellen naar de micro-omgeving van de tumor door het scheiden van transformerende groeifactor-β (TGF-β), vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), interleukine-6 (IL-6) en CXC-chemokine ligand 12 (CXCL12) 13,14,15. Vanwege hun centrale rol bij het bevorderen van tumorgroei, zijn kanker-geassocieerde fibroblasten een opkomend doelwit voor anti-kankertherapie 6,16,17,18.
Het onderstaande protocol beschrijft een methode om te testen hoe fibroblasten de groei van tumoren beïnvloeden in een goed ingeburgerd en veelgebruikt muismodel van tumorgroei. Om het belang van fibroblasten in de micro-omgeving van de tumor te begrijpen, werd het standaardprotocol voor het introduceren van kankercellen in muizen om hun groei te volgen aangepast om fibroblasten op te nemen met de introductie van kankercellen. De kankercellen kunnen subcutaan of intradermaal worden ingebracht. Intradermale introductie zou resulteren in tumoren die ontstaan uit de huid zelf. Xenografts waarin kankercellen en fibroblasten samen in muizen worden geïnjecteerd, vormen een belangrijk methodologisch hulpmiddel voor het ontleden van de rol van fibroblasten, subpopulaties van fibroblasten en eiwitfactoren in het vermogen om kankergroei te bevorderen 19,20,21. Een gedetailleerd protocol voor co-injectie van kankercellen en fibroblasten in muizen wordt verstrekt. Deze methode kan worden gebruikt om de aan- of afwezigheid van fibroblasten te vergelijken, om fibroblasten uit verschillende bronnen te vergelijken20, of om fibroblasten te vergelijken met en zonder expressie van specifieke eiwitten19. Nadat de kankercellen en fibroblasten zijn geïntroduceerd, kan de tumorgrootte in de loop van de tijd worden gecontroleerd. Aan het einde van de experimenten kunnen tumoren worden ontleed en gewogen. Door de tumorgroei in de loop van de tijd te volgen, kan het belang van verschillende factoren worden ontleed.
Er zijn alternatieve benaderingen mogelijk voor het bestuderen van de rol van fibroblasten in tumorgroei. Als voorbeeld zijn er op Cre-loxed gebaseerde modellen die voorzien in weefselspecifieke knock-out van genen met drivers die bij voorkeur tot expressie komen in fibroblasten. Dergelijke benaderingen bieden ook mogelijkheden om de rol van specifieke genen en routes in fibroblasten voor tumorprogressie te onderzoeken. In vergelijking met op Cre-lox gebaseerde benaderingen, zou het verstrekte protocol een aanzienlijk snellere benadering vertegenwoordigen voor het monitoren van de rol van fibroblasten, omdat tumorgroei gedurende slechts enkele weken zou worden gevolgd. De geboden aanpak is ook aanzienlijk goedkoper omdat het niet nodig is om kolonies van genetisch gemanipuleerde muizen te genereren en te huisvesten. Het verstrekte protocol kan worden gebruikt om snel het effect van knockdown van verschillende genen te testen met behulp van shRNA's in plaats van muizenkolonies te moeten ontwikkelen. De geboden aanpak is ook flexibeler omdat het een vergelijking mogelijk zou maken van verschillende aantallen fibroblasten, verschillende verhoudingen van kankercellen en fibroblasten, knockdown van verschillende genen en zelfs vergelijking van fibroblasten van verschillende weefsellocaties of soorten. Een Cre-lox benadering zou het voordeel hebben dat de fibroblasten in de muizen aanwezig zijn in een meer fysiologische context.
Het hier gerapporteerde protocol zou waardevol zijn voor wetenschappers die de effecten van fibroblasten op tumorgroei snel en kosteneffectief willen volgen. Dit protocol is vooral waardevol voor wetenschappers die verschillende subsets van fibroblasten of fibroblasten uit verschillende bronnen onderzoeken op tumorgroei op tumorgroei. Als het belangrijk is dat tumorinitiatie plaatsvindt in een fysiologische context, dan moeten genetisch gemanipuleerde muismodellen worden overwogen.
Er zijn verschillende mogelijke benaderingen voor het uitvoeren van deze experimenten. Immuun-competente muizen kunnen worden gebruikt als gastheren, wat onderzoek naar fibroblast-immuuncelinteracties mogelijk zou maken. Voor immuun-competente muismodellen moeten muizenkankercellen en muizenembryonale fibroblasten (MEF's) worden geïnjecteerd. Het gebruik van MEF's stelt de onderzoeker ook in staat om te profiteren van het brede scala aan knock-out muizenstammen om de aan- of afwezigheid van een interessant gen te testen. Als alternatief kunnen immuundeficiënte muizen worden gebruikt om de rol van menselijke fibroblasten te testen bij het bevorderen van de groei van tumoren bij muizen die zijn afgeleid van menselijke kankercellen. Introductie van de kankercellen kan subcutaan of orthotopisch worden uitgevoerd. Voor melanoom, zoals hieronder beschreven, kan het tumor-fibroblastmengsel intradermaal worden geïnjecteerd voor orthotopische injectie die de locatie in de huid waar een melanoom zich zou ontwikkelen nauwer simuleert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26G Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal clipper miniARCO with surgical blade #40</td>
			<td>WAHL Professional</td>
			<td>8787-450A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic nude mice (NU/J)</td>
			<td>The Jackson labs</td>
			<td>002019</td>
			<td>These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174; CRL-11147&#8482;</td>
			<td>This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multi Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblasts&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-201-012</td>
			<td>We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS USP grade for injection into mice</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-61A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tissue-culture grade PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterle 25 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>667225B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 100 x 20 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 150 x 20 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 60 x 15 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model to investigate the role of cancer-associated fibroblasts in tumor growth

Kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs) kunnen een belangrijke rol spelen in tumorgroei door het creëren van een tumorbevorderende micro-omgeving. Modellen om de rol van CAFs in de tumormicro-omgeving te bestuderen, kunnen nuttig zijn voor het begrijpen van het functionele belang van fibroblasten, fibroblasten uit verschillende weefsels en specifieke genetische factoren in fibroblasten. Muismodellen zijn essentieel voor het begrijpen van de bijdragen aan tumorgroei en -progressie in een in vivo context. Hier wordt een protocol gegeven waarin kankercellen worden gemengd met fibroblasten en in muizen worden geïntroduceerd om tumoren te ontwikkelen. Tumorgroottes in de loop van de tijd en uiteindelijke tumorgewichten worden bepaald en vergeleken tussen groepen. Het beschreven protocol kan meer inzicht geven in de functionele rol van CAFs in tumorgroei en -progressie.

A2058 menselijke melanoomcellen en primaire menselijke dermale fibroblasten werden gekweekt onder steriele omstandigheden. Cellen werden verzameld en drie keer gewassen met PBS. Immunodeficiënte muizen (NU/J - Foxn1 naaktstam) werden subcutaan geïnjecteerd op één flank met alleen al 0,25 miljoen A2058 melanoomcellen. Op de andere flank werden muizen geïnjecteerd met een mengsel van 0,25 miljoen A2058-melanoomcellen en 0,75 miljoen fibroblasten. Cellen werden geïnjecteerd in 12 immuu...

Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth at JoVE.com

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Een protocol om kankercellen en fibroblasten samen te injecteren en de tumorgroei in de loop van de tijd te volgen, wordt verstrekt. Dit protocol kan worden gebruikt om de moleculaire basis voor de rol van fibroblasten als regulatoren van tumorgroei te begrijpen.

Een muismodel om de rol van kanker-geassocieerde fibroblasten in tumorgroei te onderzoeken

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Engraftment van de tumor in een muismodel van Xenograft van menselijke mantel cel lymfoom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Een methode om de effecten van milieu verrijking op de dikke darm Microbiome biodiversiteit in een muismodel van het Colon-Tumor definiëren

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Verrijking van de Phosphopeptide in combinatie met kwantitatieve Label-vrije Spectrometrie van de massa te onderzoeken van de Phosphoproteome in prostaatkanker

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitale Polymerase Chain Reaction Assay voor de genetische variatie in een sporadische familiale adenomateuze Polyposis patiënt met behulp van de Chip-in-a-tube-indeling

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In vivo remming van MicroRNA te verminderen tumor groei bij muizen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolatie van proximale vloeistoffen om de tumormicro-omgeving van pancreasadenocarcinoom te onderzoeken

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Isolatie van primaire kanker-geassocieerde fibroblasten uit een syngenetisch muizenmodel van borstkanker voor de studie van gerichte nanodeeltjes

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Een ex vivo hersenschijfmodel om borstkanker te bestuderen en te targeten Hersen gemetastaseerde tumorgroei

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Een driedimensionaal sferoïde model om de tumor-stromale interactie bij hepatocellulair carcinoom te onderzoeken

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...