Name: a mouse model to investigate the role of cancer-associated fibroblasts in tumor growth
Uploaded: 2020-12-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du laboratoire Coller pour leur contribution utile. H.A.C. était le boursier Milton E. Cassel de la Fondation Rita Allen. Nous remercions NIH/NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, Melanoma Research Alliance Team Science Award, Cancer Research Institute Clinical Laboratory Integration Program Award, Iris Cantor Women’s Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, University of California Cancer Research Coordinating Committee, David Geffen School of Medicine Metabolism Theme Award, le Clinical Translational Science Institute et le Jonsson Comprehensive Cancer Center, Prix de l’innovation du Broad Stem Cell Research Center (Rose Hills et Ha Gaba), un prix de l’UCLA SPORE in Prostate Cancer (National Cancer Institute of the National Institutes of Health sous le numéro d’attribution P50CA092131), un prix de l’innovation du Broad Stem Cell Center, le Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research de l’UCLA, le programme de formation en biologie des cellules tumorales (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), le programme de dermatologie T32 à UCLA AR071307 et le programme de formation T32 de biologie des cellules musculaires de l’UCLA, de physiopathologie et de thérapeutique 5 T32 AF 65972.

Toutes les expériences décrites ont été approuvées par le Comité de protection des animaux de l’Université de Californie à Los Angeles.
REMARQUE: Sélectionnez les cellules cancéreuses et les fibroblastes qui correspondent aux souris hôtes pour la souche de souris. Sélectionnez les cellules cancéreuses et les fibroblastes qui correspondent au sexe de la souris hôte. Procurez-vous des souris provenant de colonies de reproduction ou achetez-les auprès de fournisseurs réputés. I...

Dans l’expérience de la figure 1, l’introduction concomitante de fibroblastes dermiques humains avec des cellules de mélanome A2058 humaines a entraîné des tumeurs plus grandes que lorsque les cellules de mélanome ont été introduites sans fibroblastes co-injectés. Cette différence pourrait être facilement détectée en fonction du volume tumoral et du poids de la tumeur. Les résultats sont cohérents avec plusieurs rapports selon lesquels les fibroblastes associés au cancer p...

Dans le microenvironnement tumoral, l’un des types de cellules les plus importants est le fibroblaste associé au cancer (CAF)1. Ces fibroblastes associés au carcinome peuvent jouer un rôle suppresseur de tumeur 2,3. Par exemple, les fibroblastes exprimant S100A sécrètent des collagènes qui peuvent encapsuler des substances cancérigènes et protéger contre la formation de carcinomes4. De plus, l’épuisement des myofibroblastes positifs à l’actine α musculaire lisse (SMA) dans le cancer du pancréas provoque une immunosuppression et accélère la progression du cancer du pancréas2. Les CAF peuvent également co-évoluer avec les cellules cancéreuses et favoriser la progression tumorale 5,6,7,8. Les fibroblastes peuvent synthétiser et sécréter des protéines de matrice extracellulaire qui créent un environnement favorisant les tumeurs8. Ces protéines de la matrice extracellulaire peuvent provoquer un raidissement mécanique du tissu, qui est associé à la progression tumorale 9,10. La matrice extracellulaire déposée peut agir comme une barrière physique qui inhibe l’infiltration immunitaire11. Le dépôt de matrice par les CAF a également été associé à l’invasion tumorale, car il a été démontré que la fibronectine générée par les CAF favorise l’invasion tumorale12. Les CAF favorisent l’angiogenèse et recrutent des cellules immunosuppressives dans le microenvironnement tumoral en sécrétant le facteur de croissance transformant β (TGF-β), le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF), l’interleukine-6 (IL-6) et le ligand CXC-chimiokine 12 (CXCL12)13,14,15. En raison de leur rôle central dans la promotion de la croissance tumorale, les fibroblastes associés au cancer sont une cible émergente pour la thérapie anticancéreuse 6,16,17,18.
Le protocole ci-dessous décrit une méthode pour tester comment les fibroblastes affectent la croissance des tumeurs dans un modèle murin bien établi et largement utilisé de la croissance tumorale. Afin de comprendre l’importance des fibroblastes dans le microenvironnement tumoral, le protocole standard d’introduction de cellules cancéreuses chez la souris pour surveiller leur croissance a été modifié pour inclure les fibroblastes avec l’introduction des cellules cancéreuses. Les cellules cancéreuses peuvent être introduites par voie sous-cutanée ou intradermique. L’introduction intradermique entraînerait des tumeurs qui proviennent de la peau elle-même. Les xénogreffes dans lesquelles des cellules cancéreuses et des fibroblastes sont co-injectés à des souris représentent un outil méthodologique important pour disséquer le rôle des fibroblastes, des sous-populations de fibroblastes et des facteurs protéiques dans la capacité à favoriser la croissance du cancer 19,20,21. Un protocole détaillé pour la co-injection de cellules cancéreuses et de fibroblastes chez la souris est fourni. Cette méthode peut être utilisée pour comparer la présence ou l’absence de fibroblastes, pour comparer des fibroblastes provenant de différentes sources20, ou pour comparer des fibroblastes avec et sans expression de protéines spécifiques19. Après l’introduction des cellules cancéreuses et des fibroblastes, la taille de la tumeur peut être surveillée au fil du temps. À la fin des expériences, les tumeurs peuvent être disséquées et pesées. En surveillant la croissance tumorale au fil du temps, l’importance de différents facteurs peut être disséquée.
Il existe des approches alternatives possibles pour étudier le rôle des fibroblastes dans la croissance tumorale. À titre d’exemple, il existe des modèles basés sur Cre-loxed qui permettent l’élimination spécifique des tissus des gènes avec des facteurs exprimés préférentiellement dans les fibroblastes. De telles approches offrent également la possibilité d’étudier le rôle de gènes et de voies spécifiques dans les fibroblastes pour la progression tumorale. Par rapport aux approches basées sur Cre-lox, le protocole fourni représenterait une approche beaucoup plus rapide pour surveiller le rôle des fibroblastes, car la croissance tumorale serait surveillée en quelques semaines seulement. L’approche fournie est également beaucoup moins coûteuse car elle ne nécessite pas de générer et de loger des colonies de souris génétiquement modifiées. Le protocole fourni peut être utilisé pour tester rapidement l’effet de knockdown de différents gènes en utilisant des shRNA plutôt que d’avoir besoin de développer des colonies de souris. L’approche fournie est également plus souple car elle permettrait de comparer différents nombres de fibroblastes, différents ratios de cellules cancéreuses et de fibroblastes, d’éliminer différents gènes et même de comparer des fibroblastes de différents sites tissulaires ou espèces. Une approche Cre-lox aurait l’avantage que les fibroblastes sont présents chez les souris dans un contexte plus physiologique.
Le protocole rapporté ici serait utile pour les scientifiques qui cherchent à surveiller les effets des fibroblastes sur la croissance tumorale rapidement et de manière rentable. Ce protocole est particulièrement utile pour les scientifiques qui étudient différents sous-ensembles de fibroblastes ou de fibroblastes provenant de différentes sources sur la croissance tumorale sur la croissance tumorale. S’il est important que l’initiation de la tumeur se produise dans un contexte physiologique, des modèles murins génétiquement modifiés doivent être envisagés.
Il existe plusieurs approches possibles pour effectuer ces expériences. Les souris immunocompétentes peuvent être utilisées comme hôtes, ce qui permettrait d’étudier les interactions fibroblastes-cellules immunitaires. Pour les modèles murins immunocompétents, des cellules cancéreuses de souris et des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) doivent être injectés. L’utilisation de MEF permet également au chercheur de tirer parti du large éventail de souches de souris knock-out pour tester la présence ou l’absence d’un gène d’intérêt. Alternativement, les souris immunodéficientes peuvent être utilisées pour tester le rôle des fibroblastes humains dans la promotion de la croissance des tumeurs chez les souris dérivées de cellules cancéreuses humaines. L’introduction des cellules cancéreuses peut être effectuée par voie sous-cutanée ou orthotopique. Pour le mélanome, comme décrit ci-dessous, le mélange tumeur-fibroblaste peut être injecté par voie intradermique pour une injection orthotopique qui simule plus étroitement l’emplacement dans la peau où un mélanome se développerait.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26G Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal clipper miniARCO with surgical blade #40</td>
			<td>WAHL Professional</td>
			<td>8787-450A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic nude mice (NU/J)</td>
			<td>The Jackson labs</td>
			<td>002019</td>
			<td>These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174; CRL-11147&#8482;</td>
			<td>This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multi Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblasts&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-201-012</td>
			<td>We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS USP grade for injection into mice</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-61A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tissue-culture grade PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterle 25 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>667225B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 100 x 20 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 150 x 20 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 60 x 15 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model to investigate the role of cancer-associated fibroblasts in tumor growth

Les fibroblastes associés au cancer (CAF) peuvent jouer un rôle important dans la croissance tumorale en créant un microenvironnement favorisant la tumeur. Les modèles pour étudier le rôle des CAF dans le microenvironnement tumoral peuvent être utiles pour comprendre l’importance fonctionnelle des fibroblastes, des fibroblastes de différents tissus et des facteurs génétiques spécifiques dans les fibroblastes. Les modèles murins sont essentiels pour comprendre les contributeurs à la croissance et à la progression tumorales dans un contexte in vivo. Ici, un protocole dans lequel les cellules cancéreuses sont mélangées avec des fibroblastes et introduites chez la souris pour développer des tumeurs est fourni. La taille des tumeurs au fil du temps et le poids final de la tumeur sont déterminés et comparés entre les groupes. Le protocole décrit peut fournir plus d’informations sur le rôle fonctionnel des CAF dans la croissance et la progression tumorales.

Des cellules de mélanome humain A2058 et des fibroblastes dermiques humains primaires ont été cultivés dans des conditions stériles. Les cellules ont été collectées et lavées trois fois avec du PBS. Des souris immunodéficientes (NU/J - souche nue Foxn1) ont été injectées par voie sous-cutanée sur un flanc avec 0,25 million de cellules de mélanome A2058 seulement. Sur l’autre flanc, des souris ont été injectées avec un mélange de 0,25 million de cellules de mélanome A...

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A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Un protocole pour co-injecter des cellules cancéreuses et des fibroblastes et surveiller la croissance tumorale au fil du temps est fourni. Ce protocole peut être utilisé pour comprendre la base moléculaire du rôle des fibroblastes en tant que régulateurs de la croissance tumorale.

Un modèle murin pour étudier le rôle des fibroblastes associés au cancer dans la croissance tumorale

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

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