Name: a mouse model to investigate the role of cancer-associated fibroblasts in tumor growth
Uploaded: 2020-12-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לכל חברי מעבדת קולר על תרומתם המועילה. H.A.C. היה חוקר מילטון א. קסל של קרן ריטה אלן. אנו מכירים ב- NIH/NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, פרס המדע של צוות ברית המחקר למלנומה, פרס תוכנית שילוב מעבדה קלינית של המכון לחקר הסרטן, המרכז לבריאות האישה ע"ש איריס קנטור / מענק UCLA CTSI NIH UL1TR000124, הוועדה המתאמת לחקר הסרטן באוניברסיטת קליפורניה, פרס נושא חילוף החומרים של בית הספר לרפואה ע"ש דיוויד גפן, המכון למדע תרגומי קליני ומרכז הסרטן המקיף ג'ונסון, פרסי חדשנות מהמרכז לחקר תאי גזע רחבים (רוז הילס והא גאבה), פרס מטעם UCLA SPORE בסרטן הערמונית (המכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר P50CA092131), פרס חדשנות ממרכז תאי גזע רחבים, מרכז אלי ואדית ברוד לרפואה רגנרטיבית ומחקר תאי גזע באוניברסיטת UCLA, תוכנית ההכשרה לביולוגיה של תאי הגידול (פרס שירות המחקר הלאומי המוסדי של רות ל. קירששטיין # T32 CA009056), תוכנית דרמטולוגיה T32 ב- UCLA AR071307, ותוכנית ההכשרה לביולוגיה של תאי שריר, פתופיזיולוגיה וטיפולים T32 של UCLA 5 T32 AF 65972.

כל הניסויים המתוארים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס.
הערה: בחר תאים סרטניים ופיברובלסטים המתאימים לעכברים המארחים עבור זן עכבר. בחר תאים סרטניים ופיברובלסטים המתאימים למין העכבר המארח. להשיג עכברים ממושבות רבייה או לרכוש אותם מספק?...

בניסוי באיור 1, החדרה משותפת של פיברובלסטים עוריים אנושיים עם תאי מלנומה אנושיים מסוג A2058 הביאה לגידולים גדולים יותר מאשר כאשר תאי המלנומה הוצגו ללא פיברובלסטים בהזרקה משותפת. הבדל זה יכול להיות מזוהה בקלות על סמך נפח הגידול ומשקל הגידול. התוצאות עולות בקנה אחד עם דיווחים ?...

בתוך המיקרו-סביבה של הגידול, אחד מסוגי התאים הבולטים ביותר הוא הפיברובלסט הקשור לסרטן (CAF)1. פיברובלסטים אלה הקשורים לקרצינומה יכולים למלא תפקיד מדכא גידול 2,3. לדוגמה, פיברובלסטים המבטאים S100A מפרישים קולגנים שיכולים לעטוף חומרים מסרטנים ולהגן מפני היווצרות קרצינומה4. יתר על כן, דלדול של שריר α חלק אקטין (SMA) חיובי myofibroblasts בסרטן הלבלב גורם לדיכוי חיסוני ומאיץ את התקדמות סרטן הלבלב2. CAFs יכולים גם להתפתח יחד עם תאים סרטניים ולקדם את התקדמות הגידול 5,6,7,8. פיברובלסטים יכולים לסנתז ולהפריש חלבוני מטריצה חוץ-תאיים היוצרים סביבה מקדמת גידול8. חלבוני מטריצה חוץ-תאיים אלה יכולים לגרום להתקשות מכנית של הרקמה, אשר קשורה להתקדמות הגידול 9,10. המטריצה החוץ-תאית השוקעת יכולה לשמש כמחסום פיזי המעכב חדירה חיסונית11. שקיעת מטריקס על ידי CAFs נקשרה גם לפלישת גידולים מכיוון שפיברונקטין שנוצר על ידי CAFs הוכח כמקדם פלישה לגידול12. CAFs מקדמים אנגיוגנזה ומגייסים תאים מדכאי חיסון למיקרו-סביבה של הגידול על ידי הפרשת גורם גדילה-β (TGF-β), גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF), אינטרלוקין-6 (IL-6) וליגנד CXC-כימוקין 12 (CXCL12)13,14,15. בגלל תפקידם המרכזי בקידום צמיחת הגידול, פיברובלסטים הקשורים לסרטן הם יעד מתפתח לטיפול אנטי סרטני 6,16,17,18.
הפרוטוקול שלהלן מתאר שיטה לבדיקת האופן שבו פיברובלסטים משפיעים על צמיחת גידולים במודל עכברי מבוסס ונפוץ של צמיחת גידולים. על מנת להבין את חשיבותם של פיברובלסטים במיקרו-סביבה של הגידול, שונה הפרוטוקול הסטנדרטי להחדרת תאים סרטניים לעכברים כדי לעקוב אחר גדילתם כך שיכלול פיברובלסטים עם החדרת התאים הסרטניים. התאים הסרטניים יכולים להיות הציג תת עורית או intradermally. החדרה תוך עורית תגרום לגידולים הנובעים מהעור עצמו. Xenografts שבו תאים סרטניים ופיברובלסטים מוזרקים במשותף לעכברים מייצגים כלי מתודולוגי חשוב לניתוח התפקיד של פיברובלסטים, תת-אוכלוסיות של פיברובלסטים וגורמי חלבון ביכולת לקדם צמיחת סרטן 19,20,21. פרוטוקול מפורט להזרקה משותפת של תאים סרטניים ופיברובלסטים לעכברים מסופק. שיטה זו יכולה לשמש להשוואת נוכחות או היעדר פיברובלסטים, להשוואת פיברובלסטים ממקורות שונים20, או להשוואת פיברובלסטים עם וללא ביטוי של חלבונים ספציפיים19. לאחר החדרת התאים הסרטניים והפיברובלסטים, ניתן לעקוב אחר גודל הגידול לאורך זמן. בתום הניסויים ניתן לנתח ולשקול גידולים. על ידי מעקב אחר צמיחת הגידול לאורך זמן, ניתן לנתח את חשיבותם של גורמים שונים.
ישנן גישות חלופיות אפשריות לחקר תפקידם של פיברובלסטים בצמיחת גידולים. לדוגמה, ישנם מודלים מבוססי Cre-loxed המספקים נוקאאוט ספציפי לרקמות של גנים עם מניעים המתבטאים באופן מועדף בפיברובלסטים. גישות כאלה מספקות גם הזדמנויות לחקור את תפקידם של גנים ומסלולים ספציפיים בפיברובלסטים להתקדמות הגידול. בהשוואה לגישות מבוססות Cre-lox, הפרוטוקול שסופק ייצג גישה מהירה יותר באופן משמעותי לניטור תפקידם של פיברובלסטים מכיוון שצמיחת הגידול תנוטר במשך מספר שבועות בלבד. הגישה המסופקת היא גם זולה משמעותית מכיוון שהיא אינה דורשת ייצור ושיכון מושבות של עכברים מהונדסים גנטית. הפרוטוקול המסופק יכול לשמש לבדיקה מהירה של ההשפעה של הפלת גנים שונים באמצעות shRNA במקום צורך לפתח מושבות עכברים. הגישה המסופקת היא גם גמישה יותר מכיוון שהיא תאפשר השוואה של מספרים שונים של פיברובלסטים, יחסים שונים של תאים סרטניים ופיברובלסטים, הפלת גנים שונים, ואפילו השוואה של פיברובלסטים מאתרי רקמות או מינים שונים. לגישת Cre-lox יהיה יתרון בכך שהפיברובלסטים נמצאים בתוך העכברים בהקשר פיזיולוגי יותר.
הפרוטוקול המדווח כאן יהיה בעל ערך עבור מדענים המבקשים לעקוב אחר ההשפעות של פיברובלסטים על צמיחת הגידול במהירות ובאופן חסכוני. פרוטוקול זה חשוב במיוחד עבור מדענים החוקרים תת-קבוצות שונות של פיברובלסטים או פיברובלסטים ממקורות שונים על צמיחת הגידול על צמיחת הגידול. אם חשוב שהתחלת הגידול תתרחש בהקשר פיזיולוגי, יש לשקול מודלים של עכברים מהונדסים גנטית.
ישנן מספר גישות אפשריות לביצוע ניסויים אלה. עכברים בעלי כשירות חיסונית יכולים לשמש כפונדקאים, מה שיאפשר חקירה של אינטראקציות פיברובלסטיות-חיסוניות בין תאים. עבור מודלים של עכברים בעלי כשירות חיסונית, יש להזריק תאי סרטן עכבר ופיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs). השימוש ב-MEFs גם מאפשר לחוקר לנצל את המגוון הרחב של זני עכברי נוקאאוט כדי לבדוק את נוכחותו או היעדרו של גן מעניין. לחלופין, ניתן להשתמש בעכברים עם חסר חיסוני כדי לבחון את תפקידם של פיברובלסטים אנושיים בקידום הצמיחה של גידולים בעכברים שמקורם בתאים סרטניים אנושיים. החדרת התאים הסרטניים יכולה להתבצע באופן תת עורי או אורתוטופי. עבור מלנומה, כפי שיתואר להלן, ניתן להזריק את תערובת הגידול-פיברובלסטים תוך עורית להזרקה אורתוטופית המדמה באופן הדוק יותר את המיקום בתוך העור שבו תתפתח מלנומה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26G Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal clipper miniARCO with surgical blade #40</td>
			<td>WAHL Professional</td>
			<td>8787-450A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic nude mice (NU/J)</td>
			<td>The Jackson labs</td>
			<td>002019</td>
			<td>These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174; CRL-11147&#8482;</td>
			<td>This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multi Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblasts&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-201-012</td>
			<td>We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS USP grade for injection into mice</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-61A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tissue-culture grade PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterle 25 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>667225B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 100 x 20 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 150 x 20 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 60 x 15 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model to investigate the role of cancer-associated fibroblasts in tumor growth

פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) יכולים למלא תפקיד חשוב בצמיחת הגידול על ידי יצירת מיקרו-סביבה המקדמת גידולים. מודלים לחקר התפקיד של CAFs במיקרו-סביבה של הגידול יכולים להיות מועילים להבנת החשיבות התפקודית של פיברובלסטים, פיברובלסטים מרקמות שונות וגורמים גנטיים ספציפיים בפיברובלסטים. מודלים של עכברים חיוניים להבנת התורמים לצמיחת הגידול ולהתקדמות בהקשר in vivo. כאן, פרוטוקול שבו תאים סרטניים מעורבבים עם פיברובלסטים ומוכנסים לעכברים לפתח גידולים מסופקים. גודל הגידול לאורך זמן ומשקלי הגידול הסופיים נקבעים ומושווים בין קבוצות. הפרוטוקול המתואר יכול לספק תובנה נוספת לגבי התפקיד התפקודי של CAFs בגדילה ובהתקדמות של גידולים.

תאי מלנומה אנושיים A2058 ופיברובלסטים עוריים אנושיים ראשוניים גודלו בתרבית בתנאים סטריליים. התאים נאספו ונשטפו שלוש פעמים עם PBS. עכברים מדוכאי חיסון (NU/J - Foxn1 nude strain) הוזרקו תת עורית על צד אחד עם 0.25 מיליון תאי מלנומה A2058 בלבד. בצד השני הוזרקה לעכברים תערובת של 0.25 מיליון תאי מלנ...

Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth at JoVE.com

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

ניתן פרוטוקול להזרקה משותפת של תאים סרטניים ופיברובלסטים ולמעקב אחר צמיחת הגידול לאורך זמן. פרוטוקול זה יכול לשמש להבנת הבסיס המולקולרי לתפקידם של פיברובלסטים כמווסתים של צמיחת גידולים.

מודל עכברי לחקר התפקיד של פיברובלסטים הקשורים לסרטן בצמיחת הגידול

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Engraftment גידול במודל של עכברים Xenograft של האדם מנטל לימפומה התא

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

שיטה כדי להגדיר את ההשפעות של העשרה סביבתית על המגוון הביולוגי Microbiome המעי הגס במודל של עכברים המעי הגס גידול

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

העשרה Phosphopeptide בשילוב עם ספקטרומטר מסה ללא תווית כמותיים כדי לחקור את Phosphoproteome סרטן הערמונית

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

ב Vivo עיכוב של מיקרואורנה כדי להקטין את צמיחת הגידול בעכברים

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

בידוד של נוזלים פרוקסימליים כדי לחקור את המיקרו-סביבה של הגידול של אדנוקרצינומה של הלבלב

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

בידוד של פיברובלסטים הקשורים לסרטן ראשוני ממודל מורין סינגני של סרטן השד לחקר חלקיקים ממוקדים

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

מודל פרוסת מוח Ex Vivo כדי לחקור ולמקד את צמיחת הגידול הגרורתי של סרטן השד במוח

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

מודל ספרואידי תלת מימדי לחקר האינטראקציה בין גידולים סרטניים בקרצינומה הפטוקולרית

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...