Name: a mouse model to investigate the role of cancer-associated fibroblasts in tumor growth
Uploaded: 2020-12-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del laboratorio Coller per l'utile contributo. H.A.C. era lo studioso Milton E. Cassel della Rita Allen Foundation. Riconosciamo NIH / NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, Melanoma Research Alliance Team Science Award, Cancer Research Institute Clinical Laboratory Integration Program Award, Iris Cantor Women's Health Center / UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, University of California Cancer Research Coordinating Committee, David Geffen School of Medicine Metabolism Theme Award, Clinical Translational Science Institute e Jonsson Comprehensive Cancer Center, Innovation Awards dal Broad Stem Cell Research Center (Rose Hills e Ha Gaba), un premio dall'UCLA SPORE in Prostate Cancer (National Cancer Institute of the National Institutes of Health con il numero di premio P50CA092131), un premio per l'innovazione dal Broad Stem Cell Center, l'Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research dell'UCLA, il Tumor Cell Biology Training Program (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), il Dermatology T32 Program presso UCLA AR071307 e l'UCLA Muscle Cell Biology, Pathophysiology and Therapeutics T32 Training Program 5 T32 AF 65972.

Tutti gli esperimenti descritti sono stati approvati dall'Animal Care Committee dell'Università della California, Los Angeles.
NOTA: Selezionare le cellule tumorali e i fibroblasti che corrispondono ai topi ospiti per il ceppo di topo. Selezionare le cellule tumorali e i fibroblasti che corrispondono al sesso del topo ospite. Ottieni topi da colonie riproduttive o acquistali da fornitori affidabili. Introdurre tumori nei topi che sono ~ 8-10 settimane di età. I topi con pelliccia saranno nel...

Nell'esperimento nella Figura 1, la co-introduzione di fibroblasti dermici umani con cellule di melanoma umano A2058 ha provocato tumori più grandi rispetto a quando le cellule di melanoma sono state introdotte senza fibroblasti co-iniettati. Questa differenza potrebbe essere facilmente rilevata in base al volume del tumore e al peso del tumore. I risultati sono coerenti con molteplici segnalazioni che i fibroblasti associati al cancro possono promuovere la crescita ...

All'interno del microambiente tumorale, uno dei tipi di cellule più importanti è il fibroblasto associato al cancro (CAF)1. Questi fibroblasti associati al carcinoma possono svolgere un ruolo soppressivo del tumore 2,3. Ad esempio, i fibroblasti che esprimono S100A secernono collageni che possono incapsulare agenti cancerogeni e proteggere dalla formazione di carcinoma4. Inoltre, l'esaurimento dei miofibroblasti positivi all'actina α-liscia (SMA) nel cancro del pancreas provoca immunosoppressione e accelera la progressione del cancro del pancreas2. I CAF possono anche co-evolvere con le cellule tumorali e promuovere la progressione tumorale 5,6,7,8. I fibroblasti possono sintetizzare e secernere proteine della matrice extracellulare che creano un ambiente che promuove il tumore8. Queste proteine della matrice extracellulare possono causare irrigidimento meccanico del tessuto, che è associato alla progressione del tumore 9,10. La matrice extracellulare depositata può agire come una barriera fisica che inibisce l'infiltrazione immunitaria11. La deposizione di matrice da parte dei CAF è stata anche associata all'invasione tumorale poiché la fibronectina generata dai CAF ha dimostrato di promuovere l'invasione tumorale12. I CAF promuovono l'angiogenesi e reclutano cellule immunosoppressive nel microambiente tumorale secernendo il fattore di crescita trasformante β (TGF-β), il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), l'interleuchina-6 (IL-6) e il ligando CXC-chemochine 12 (CXCL12) 13,14,15. A causa del loro ruolo centrale nel promuovere la crescita tumorale, i fibroblasti associati al cancro sono un bersaglio emergente per la terapia anti-cancro 6,16,17,18.
Il protocollo seguente descrive un metodo per testare come i fibroblasti influenzano la crescita dei tumori in un modello murino di crescita tumorale ben consolidato e ampiamente utilizzato. Al fine di comprendere l'importanza dei fibroblasti nel microambiente tumorale, il protocollo standard per l'introduzione di cellule tumorali nei topi per monitorare la loro crescita è stato modificato per includere i fibroblasti con l'introduzione delle cellule tumorali. Le cellule tumorali possono essere introdotte per via sottocutanea o intradermica. L'introduzione intradermica provocherebbe tumori che derivano dalla pelle stessa. Gli xenotrapianti in cui cellule tumorali e fibroblasti vengono co-iniettati nei topi rappresentano un importante strumento metodologico per sezionare il ruolo dei fibroblasti, sottopopolazioni di fibroblasti e fattori proteici nella capacità di promuovere la crescita del cancro 19,20,21. Viene fornito un protocollo dettagliato per la co-iniezione di cellule tumorali e fibroblasti nei topi. Questo metodo può essere utilizzato per confrontare la presenza o l'assenza di fibroblasti, per confrontare fibroblasti provenienti da fonti diverse20, o per confrontare fibroblasti con e senza espressione di proteine specifiche19. Dopo l'introduzione delle cellule tumorali e dei fibroblasti, la dimensione del tumore può essere monitorata nel tempo. Alla fine degli esperimenti, i tumori possono essere sezionati e pesati. Monitorando la crescita del tumore nel tempo, è possibile sezionare l'importanza di diversi fattori.
Esistono possibili approcci alternativi per studiare il ruolo dei fibroblasti nella crescita tumorale. Ad esempio, ci sono modelli basati su Cre-lox che prevedono il knockout tessuto-specifico di geni con driver espressi preferenzialmente nei fibroblasti. Tali approcci offrono anche l'opportunità di studiare il ruolo di geni e percorsi specifici nei fibroblasti per la progressione del tumore. Rispetto agli approcci basati su Cre-lox, il protocollo fornito rappresenterebbe un approccio significativamente più rapido al monitoraggio del ruolo dei fibroblasti perché la crescita del tumore verrebbe monitorata in poche settimane. L'approccio fornito è anche significativamente meno costoso perché non richiede la generazione e l'alloggiamento di colonie di topi geneticamente modificati. Il protocollo fornito può essere utilizzato per testare rapidamente l'effetto del knockdown di diversi geni utilizzando shRNA piuttosto che dover sviluppare colonie di topi. L'approccio fornito è anche più flessibile perché consentirebbe un confronto tra diversi numeri di fibroblasti, diversi rapporti di cellule tumorali e fibroblasti, abbattimento di geni diversi e persino confronto di fibroblasti da diversi siti o specie di tessuti. Un approccio Cre-lox avrebbe il vantaggio che i fibroblasti sono presenti all'interno dei topi in un contesto più fisiologico.
Il protocollo qui riportato sarebbe prezioso per gli scienziati che cercano di monitorare gli effetti dei fibroblasti sulla crescita del tumore in modo rapido ed economico. Questo protocollo è particolarmente prezioso per gli scienziati che studiano diversi sottoinsiemi di fibroblasti o fibroblasti da diverse fonti sulla crescita del tumore sulla crescita del tumore. Se è importante che l'inizio del tumore avvenga in un contesto fisiologico, dovrebbero essere presi in considerazione modelli murini geneticamente modificati.
Esistono diversi approcci possibili per eseguire questi esperimenti. I topi immunocompetenti possono essere utilizzati come ospiti, il che consentirebbe di studiare le interazioni fibroblasto-cellule immunitarie. Per i modelli murini immunocompetenti, devono essere iniettate cellule tumorali di topo e fibroblasti embrionali di topo (MEF). L'uso di MEF consente inoltre allo sperimentatore di sfruttare l'ampia gamma di ceppi murini knockout per testare la presenza o l'assenza di un gene di interesse. In alternativa, i topi immunodeficienti possono essere utilizzati per testare il ruolo dei fibroblasti umani nel promuovere la crescita dei tumori nei topi derivati da cellule tumorali umane. L'introduzione delle cellule tumorali può essere eseguita per via sottocutanea o ortotopica. Per il melanoma, come descritto di seguito, la miscela tumore-fibroblasto può essere iniettata per via intradermica per iniezione ortotopica che simula più da vicino la posizione all'interno della pelle in cui si svilupperebbe un melanoma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26G Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal clipper miniARCO with surgical blade #40</td>
			<td>WAHL Professional</td>
			<td>8787-450A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic nude mice (NU/J)</td>
			<td>The Jackson labs</td>
			<td>002019</td>
			<td>These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174; CRL-11147&#8482;</td>
			<td>This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multi Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblasts&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-201-012</td>
			<td>We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS USP grade for injection into mice</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-61A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tissue-culture grade PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterle 25 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>667225B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 100 x 20 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 150 x 20 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 60 x 15 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model to investigate the role of cancer-associated fibroblasts in tumor growth

I fibroblasti associati al cancro (CAF) possono svolgere un ruolo importante nella crescita del tumore creando un microambiente che promuove il tumore. I modelli per studiare il ruolo dei CAF nel microambiente tumorale possono essere utili per comprendere l'importanza funzionale dei fibroblasti, dei fibroblasti di diversi tessuti e di specifici fattori genetici nei fibroblasti. I modelli murini sono essenziali per comprendere i fattori che contribuiscono alla crescita e alla progressione del tumore in un contesto in vivo. Qui, viene fornito un protocollo in cui le cellule tumorali vengono mescolate con fibroblasti e introdotte nei topi per sviluppare tumori. Le dimensioni del tumore nel tempo e i pesi finali del tumore sono determinati e confrontati tra i gruppi. Il protocollo descritto può fornire maggiori informazioni sul ruolo funzionale dei CAF nella crescita e nella progressione del tumore.

A2058 cellule di melanoma umano e fibroblasti dermici umani primari sono stati coltivati in condizioni sterili. Le cellule sono state raccolte e lavate tre volte con PBS. Topi immunodeficienti (NU/J - ceppo nudo Foxn1) sono stati iniettati per via sottocutanea su un fianco con 0,25 milioni di cellule di melanoma A2058 da sole. Sull'altro lato, ai topi è stata iniettata una miscela di 0,25 milioni di cellule di melanoma A2058 e 0,75 milioni di fibroblasti. Le cellule sono state iniettate ...

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A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Viene fornito un protocollo per co-iniettare cellule tumorali e fibroblasti e monitorare la crescita del tumore nel tempo. Questo protocollo può essere utilizzato per comprendere le basi molecolari del ruolo dei fibroblasti come regolatori della crescita tumorale.

Un modello murino per studiare il ruolo dei fibroblasti associati al cancro nella crescita tumorale

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Attecchimento del tumore in un modello murino di xenotrapianto di umano linfoma a cellule mantellari

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Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

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Fosfopeptide arricchimento accoppiata alla spettrometria di massa privo di etichetta quantitativa per indagare il Phosphoproteome nel carcinoma della prostata

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

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Reazione a catena della polimerasi digitale per la variazione genetica in un paziente di poliposi adenomatosa familiare sporadica utilizzando il formato di Chip-in-a-tubo

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In vivivo Inibizione del MicroRNA per diminuire la crescita tumorale nei topi

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Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolamento di fluidi prossimali per studiare il microambiente tumorale dell'adenocarcinoma pancreatico

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Isolamento di fibroblasti primari associati al cancro da un modello murino singeneico di cancro al seno per lo studio di nanoparticelle mirate

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

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Un modello di fetta di cervello Ex Vivo per studiare e indirizzare la crescita del tumore metastatico cerebrale del cancro al seno

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