Name: egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica
Uploaded: 2020-10-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica at JoVE.com

TO en TD werden ondersteund door respectievelijk JSPS KAKENHI-subsidienummers 19H02970 en 20H02999.

1. Onderhoud van laboratoriumkolonies
<ol><li>Gebruik voor het onderhoud van wildtype- en mutantpopulaties een grote plastic container (460 mm x 360 mm x 170 mm) met regelmatig kunstmatig visvoer, water in plastic bekers met een ventilatiegat aan de bovenkant, een gevouwen papier om de insecten te verbergen en gelaagd katoen voor het leggen van eieren (figuur 2A). Houd alle T. domestica culturen binnen 37 °C incubators en stel de relatieve luchtvochtigheid (RH) in elke container ...

<ol>
	<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadi&#263;, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+expression+pattern+of+labial,+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect.">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li><li>Farris, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+organization+of+the+mushroom+bodies+of+Thermobia+domestica+(Zygentoma,+Lepismatidae):+Insights+into+mushroom+body+evolution+from+a+basal+insect.">Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect.</a> Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).</li><li>Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+analysis+of+the+clock+genes,+Clock+and+cycle,+in+the+firebrat+Thermobia+domestica.">Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).</li><li>Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+RNAi+analysis+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica:+Distal-less+is+required+to+form+caudal+filament.">Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).</li><li>Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nymphal+RNAi+analysis+reveals+novel+function+of+scalloped+in+antenna,+cercus+and+caudal+filament+formation+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica.">Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).</li><li>Bell&#233;s, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Drosophila:+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects.">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li><li>Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+heritable+targeted+mutagenesis+in+Thermobia+domestica:+A+genetic+tool+in+an+apterygote+development+model+of+wing+evolution.">CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution.</a> Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).</li><li>Nji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+odorant+receptor+gene+family+in+insects.">The origin of the odorant receptor gene family in insects.</a> eLife. 7, 1-13 (2018).</li><li>Noble-Nesbitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+balance+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).+Exchanges+of+water+with+the+atmosphere.">Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere.</a> Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).</li><li>Sweetman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+ecology+of+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).">Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard).</a> Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).</li><li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Hormones. , (1994).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+detection,+quantification+and+enrichment+of+subtle+allelic+alterations.">Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations.</a> DNA Research. 19, 423-433 (2012).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li><li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+notes+upon+the+firebrat,+Thermobia+domestica+Packard.">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li></ol>

Voor de succesvolle generatie van de gewenste T. domestica mutant met CRISPR/Cas9 is het eerst belangrijk om een voldoende aantal geënsceneerde embryo's te verzamelen voor injectie. Voor een constante verzameling van een voldoende aantal T. domestica-eieren, is de sleutel om een geschikte grootte van de container te selecteren om een lagere populatiedichtheid te hebben, omdat het zou helpen bij het succesvol voltooien van een reeks complex paringsgedrag, dat wordt herhaald na elke vervelling voor volwa...

Thermobia domestica behoort tot een van de meest basale insectenorden, Zygentoma, die een voorouderlijke ametaboleuze en vleugelloze levenscyclus behoudt. Een dergelijke basale fylogenetische positie en voorouderlijke kenmerken stellen deze soort als een aantrekkelijk model voor het bestuderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan het succes van insecten op aarde, die meer dan 70% van de beschreven diersoorten bestrijken1. T. domestica wordt al lang voornamelijk gebruikt om voorouderlijke kenmerken van insectenfysiologie te bestuderen vanwege de geschikte kenmerken als laboratoriummodel, zoals een relatief korte levenscyclus (2,5-3,0 maanden van embryo tot reproductieve volwassene; Figuur 1A) en een gemakkelijke fokkerij. In de afgelopen drie decennia is het gebruik ervan uitgebreid om voorouderlijke kenmerken van verschillende eigenschappen zoals lichaamsplan, neurale differentiatie en circadiane ritmes2,3,4te onderzoeken.
De toepassing van geavanceerde genetische instrumenten in T. domestica zou dergelijke bijdragen op een breed onderzoeksgebied verder kunnen versnellen. Succesvolle RNA interferentie (RNAi)-gemedieerde gen knockdown in embryo's, nimfen en volwassenen is gemeld in T. domestica4,5,6. De efficiëntie van systemische RNAi is nog steeds sterk afhankelijk van soorten - het is bijvoorbeeld over het algemeen hoog in coleoptera, terwijl het laag is in de lepidoptera-orde7. De efficiëntie en duur van de RNAi knockdown in T. domestica moet nog worden beoordeeld. Naast RNAi, hebben we eerder gemeld een succesvolle CRISPR / Cas9-gemedieerde gen knock-out in T. domestica8. Het CRISPR/Cas-systeem is op grote schaal toegepast voor genoombewerking bij insecten, met name voor gerichte gen knock-out. Het gebruik ervan kan worden uitgebreid voor andere toepassingen, zoals genverslaggevertest, cellijntracking en manipulatie van transcriptieactiviteit door exogene constructies in te kloppen na de vaststelling van een protocol voor het leveren van componenten van het CRISPR/Cas-systeem inkernen 9. In combinatie met de gepubliceerde genoomassemblage10zou het brede gebruik en de verdere ontwikkeling van de CRISPR/Cas-gebaseerde genoombewerking in T. domestica studies vergemakkelijken die zich richten op de evolutionaire mechanismen achter het uitstekende adaptieve succes van insecten. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor embryomicro-injectie en voor het paren van volwassen T. domestica om een mutante stam te genereren met CRISPR/Cas9. Gezien deze nieuwe methode bespreken we het belang van het overwegen van de unieke biologie van niet-traditionele modelsoorten voor succesvolle toepassingen van deze technieken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>83-3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &#181;g</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1081060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-static cleaner</td>
			<td>Hozan</td>
			<td>Z-292</td>
			<td>for removing static electricity from a 24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier Box 20.7L</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>4-5606-01</td>
			<td>Large container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 4i</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Electronic microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotip II, injection capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242957000</td>
			<td>Glass injection capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pack 2440mL</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>5-068-25</td>
			<td>Middle-sized container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR-554-PJ</td>
			<td>for 37 &#176;C incubation. No need to humidify inside the incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>KFX-101</td>
			<td>PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-8</td>
			<td>for holding the micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td>for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiceTac</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>NW-5</td>
			<td>Double-sided tape to place eggs on a glass slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush (horse hair)</td>
			<td>Pentel</td>
			<td>ZBS1-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant culture dish</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>310100</td>
			<td>Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX 12 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX 12</td>
			<td>More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talcum powder</td>
			<td>Maruishi</td>
			<td>877113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra Goldfish Gold Growth</td>
			<td>Spectrum Brands</td>
			<td></td>
			<td>Artificial regular fish food</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica

De vuurstilte Thermobia domestica is een ametabolische, vleugelloze soort die geschikt is voor het bestuderen van de ontwikkelingsmechanismen van insecten die hebben geleid tot hun succesvolle evolutionaire straling op aarde. De toepassing van genetische instrumenten zoals genoombewerking is de sleutel tot het begrijpen van genetische veranderingen die verantwoordelijk zijn voor evolutionaire transities in een Evo-Devo-benadering. In dit artikel beschrijven we ons huidige protocol voor het genereren en onderhouden van mutante stammen van T. domestica. We rapporteren een droge injectiemethode, als alternatief voor de gerapporteerde natte injectiemethode, waarmee we stabiel hoge overlevingspercentages in geïnjecteerde embryo's kunnen verkrijgen. We rapporteren ook een geoptimaliseerde omgevingsinstelling om volwassenen te paren en volgende generaties met een hoog rendement te verkrijgen. Onze methode onderstreept het belang om rekening te houden met de unieke biologie van elke soort voor de succesvolle toepassing van genoombewerkingsmethoden op niet-traditionele modelorganismen. We voorspellen dat deze genoombewerkingsprotocollen zullen helpen bij de implementatie van T. domestica als laboratoriummodel en om de ontwikkeling en toepassing van nuttige genetische hulpmiddelen bij deze soort verder te versnellen.

In onze handen kunnen ongeveer 100 eieren goed worden geïnjecteerd met een enkele injectie capillair wanneer het de juiste punt heeft(figuur 3C). Injectie van gRNA/Cas9 ribonucleoproteïne complex in embryo's binnen de eerste 8 uur na het leggen van eieren resulteert in indels op de gRNA gerichte site. Dit veroorzaakt biallelic mutaties in sommige cellen van de geïnjecteerde generatie (G0) en dus mutant mozaïek fenotypes worden meestal verkregen in G0. Wanneer dit protocol bijvoorbeeld we...

Watch this Scientific Journal Video about Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica at JoVE.com

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

We bieden een gedetailleerd protocol voor het fokken, micro-injectie van eieren en voor een efficiënte paring van de firebrat Thermobia domestica om mutante stammen te genereren en te onderhouden na genoombewerking.

Ei micro-injectie en efficiënte paring voor genoombewerking in de Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficiënte Gene Transfer in Chick netvliezen voor primaire cel Cultuurwetenschappen: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporatie Aanpak

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

Identificatie van de kritische Voorwaarden voor Immunokleuring in de erwtenbladluis Embryo&#39;s: Toenemende Tissue permeabiliteit en Afnemende Achtergrond kleuring

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Micro-injectie voor Transgenese en Genome Bewerken in Threespine Stekelbaarzen

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo micro-injectie en elektroporatie in de chordate<em&gt; Doorschijnende zakpijp</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

Verzameling na paring sperma van de vrouwelijke voortplantingssysteem en de waardering van sperma vloeibaar in muizen

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Een efficiënte strategie voor het genereren van weefsel toepassingsspecifieke binaire transcriptie systemen in Drosophila door het bewerken van het genoom

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Microinjection-gebaseerd systeem voor In Vivo implantatie van embryonale Cardiomyocytes in het aviaire Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Celcelfusie van genoom bewerkte cellijnen voor Perturbatie van cellulaire structuur en functie

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...