Name: egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica
Uploaded: 2020-10-20T15:00:00
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To y TD fueron apoyados por los números de subvención JSPS KAKENHI 19H02970 y 20H02999, respectivamente.

1. Mantenimiento de colonias de laboratorio
<ol><li>Para el mantenimiento de poblaciones de wildtype y mutantes, utilice un recipiente de plástico grande (460 mm x 360 mm x 170 mm) con alimentos artificiales regulares para peces, agua en vasos de plástico con un orificio de ventilación en la parte superior, un papel doblado para ocultar los insectos y algodón en capas para poner huevos(Figura 2A). Mantenga todos los cultivos de T. domestica dentro de incubadoras de 37 °C y es...

<ol>
	<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadi&#263;, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+expression+pattern+of+labial,+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect.">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li><li>Farris, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+organization+of+the+mushroom+bodies+of+Thermobia+domestica+(Zygentoma,+Lepismatidae):+Insights+into+mushroom+body+evolution+from+a+basal+insect.">Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect.</a> Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).</li><li>Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+analysis+of+the+clock+genes,+Clock+and+cycle,+in+the+firebrat+Thermobia+domestica.">Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).</li><li>Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+RNAi+analysis+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica:+Distal-less+is+required+to+form+caudal+filament.">Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).</li><li>Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nymphal+RNAi+analysis+reveals+novel+function+of+scalloped+in+antenna,+cercus+and+caudal+filament+formation+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica.">Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).</li><li>Bell&#233;s, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Drosophila:+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects.">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li><li>Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+heritable+targeted+mutagenesis+in+Thermobia+domestica:+A+genetic+tool+in+an+apterygote+development+model+of+wing+evolution.">CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution.</a> Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).</li><li>Nji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+odorant+receptor+gene+family+in+insects.">The origin of the odorant receptor gene family in insects.</a> eLife. 7, 1-13 (2018).</li><li>Noble-Nesbitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+balance+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).+Exchanges+of+water+with+the+atmosphere.">Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere.</a> Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).</li><li>Sweetman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+ecology+of+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).">Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard).</a> Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).</li><li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Hormones. , (1994).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+detection,+quantification+and+enrichment+of+subtle+allelic+alterations.">Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations.</a> DNA Research. 19, 423-433 (2012).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li><li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+notes+upon+the+firebrat,+Thermobia+domestica+Packard.">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li></ol>

Para la generación exitosa del mutante T. domestica deseado con CRISPR/Cas9, primero es importante recoger un número suficiente de embriones escenificados para la inyección. Para una recolección constante de un número suficiente de huevos T. domestica, la clave es seleccionar un tamaño adecuado del recipiente para tener una menor densidad de población porque ayudaría a completar con éxito una serie de comportamientos complejos de apareamiento, que se repite después de cada muda adulta<sup clas...

Thermobia domestica pertenece a una de las órdenes de insectos más basales, Zygentoma, que conserva un ciclo de vida ancestral ametaboloso y sin alas. Tal posición filogenética basal y características ancestrales establecen a esta especie como un modelo atractivo para estudiar los mecanismos subyacentes al éxito de los insectos en la Tierra, que cubren más del 70% de las especies animales descritas1. T. domestica se ha utilizado durante mucho tiempo principalmente para estudiar las características ancestrales de la fisiología de insectos debido a sus características adecuadas como modelo de laboratorio, como un ciclo de vida relativamente corto (2,5–3,0 meses de embrión a adulto reproductor; Figura 1A) y una cría fácil. En las últimas tres décadas, su uso se ha ampliado para investigar características ancestrales de diversos rasgos como el plan corporal, la diferenciación neuronal y los ritmos circadianos2,3,4.
La aplicación de herramientas genéticas avanzadas en T. domestica podría acelerar aún más esas contribuciones en un amplio área de investigación. Se ha notificado una interferencia exitosa del ARN (ARN) en embriones, ninfas y adultos en T. domestica4,5,6. La eficiencia del RNAi sistémico sigue siendo altamente dependiente de las especies, por ejemplo, generalmente es alta en coleoptera, mientras que es baja en el ordenlepidópteros 7. La eficiencia y duración del derribo de la RNAi en T. domestica aún no ha sido evaluada. Además de RNAi, hemos informado previamente de un exitoso knockout genético mediado por CRISPR/Cas9 en T. domestica8. El sistema CRISPR/Cas se ha aplicado ampliamente para la edición del genoma en insectos, particularmente para el knockout genético específico. Su uso podría ampliarse para otras aplicaciones como el ensayo de reporteros genéticos, el seguimiento del linaje celular y la manipulación de la actividad transcripcional mediante el derribo de construcciones exógenas después del establecimiento de un protocolo para la entrega de componentes del sistema CRISPR/Cas en núcleos9. Combinado con el ensamblaje del genoma publicado10,el uso amplio y el desarrollo posterior de la edición del genoma basado en CRISPR/Cas en T. domestica facilitarían estudios centrados en los mecanismos evolutivos detrás del excepcional éxito adaptativo de los insectos. Aquí, describimos un protocolo detallado para la microinyección embrionaria y para aparear T. domestica adulto para generar una cepa mutante usando CRISPR/Cas9. Teniendo en cuenta este novedoso método, discutimos la importancia de considerar la biología única de las especies modelo no tradicionales para aplicaciones exitosas de estas técnicas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>83-3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &#181;g</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1081060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-static cleaner</td>
			<td>Hozan</td>
			<td>Z-292</td>
			<td>for removing static electricity from a 24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier Box 20.7L</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>4-5606-01</td>
			<td>Large container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 4i</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Electronic microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotip II, injection capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242957000</td>
			<td>Glass injection capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pack 2440mL</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>5-068-25</td>
			<td>Middle-sized container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR-554-PJ</td>
			<td>for 37 &#176;C incubation. No need to humidify inside the incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>KFX-101</td>
			<td>PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-8</td>
			<td>for holding the micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td>for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiceTac</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>NW-5</td>
			<td>Double-sided tape to place eggs on a glass slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush (horse hair)</td>
			<td>Pentel</td>
			<td>ZBS1-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant culture dish</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>310100</td>
			<td>Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX 12 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX 12</td>
			<td>More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talcum powder</td>
			<td>Maruishi</td>
			<td>877113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra Goldfish Gold Growth</td>
			<td>Spectrum Brands</td>
			<td></td>
			<td>Artificial regular fish food</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica

El firebrat Thermobia domestica es una especie ametabolosa y sin alas que es adecuada para estudiar los mecanismos de desarrollo de los insectos que condujeron a su exitosa radiación evolutiva en la Tierra. La aplicación de herramientas genéticas como la edición del genoma es la clave para entender los cambios genéticos que son responsables de las transiciones evolutivas en un enfoque Evo-Devo. En este artículo, describimos nuestro protocolo actual para generar y mantener cepas mutantes de T. domestica. Informamos de un método de inyección en seco, como alternativa al método de inyección húmeda notificado, que nos permite obtener tasas de supervivencia establemente altas en embriones inyectados. También informamos de un entorno optimizado para acoplar adultos y obtener generaciones posteriores con alta eficiencia. Nuestro método subraya la importancia de tener en cuenta la biología única de cada especie para la aplicación exitosa de métodos de edición del genoma a organismos modelo no tradicionales. Predicemos que estos protocolos de edición del genoma ayudarán a implementar T. domestica como modelo de laboratorio y a acelerar aún más el desarrollo y la aplicación de herramientas genéticas útiles en esta especie.

En nuestras manos, alrededor de 100 huevos se pueden inyectar bien con un solo capilar de inyección cuando tiene la punta adecuada(Figura 3C). Inyección de gRNA/Cas9 complejo ribonucleoprotein en embriones dentro de las primeras 8 h después de la puesta de óvulos resulta en indels en el sitio objetivo de gRNA. Esto causa mutaciones biallelicas en algunas células de la generación inyectada (G0) y por lo tanto los fenotipos de mosaico mutantes generalmente se obtienen en G0. Por ejemplo,...

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Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Proporcionamos un protocolo detallado para la cría, microinjección de huevos y para el apareamiento eficiente del firebrat Thermobia domestica para generar y mantener cepas mutantes después de la edición del genoma.

Microinyección de óvulos y apareamiento eficiente para la edición del genoma en la thermobia doméstica de firebrat

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

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Transferencia génica eficaz en polluelo retinas para estudios de cultivo celular primario: Un<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Enfoque electroporación

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Investigación

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Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

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Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo<em&gt; Xenopus</em&gt; riñón

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