Name: single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2020-12-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Die Autoren danken Cairn Research Ltd. für ihren freundlichen finanziellen Beitrag, der die Produktionskosten dieser Veröffentlichung gedeckt hat. Darüber hinaus danken wir Frau Ines Mueller und Frau Stefanie Kestel für die hervorragende technische Unterstützung.
Die Forschung der Autoren wird vom Deutschen Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Vo 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 und im Rahmen der Exzellenzstrategie - EXC 2067/1- 390729940) und der Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20) unterstützt.

1. Zelluläre Präparate
HINWEIS: Menschliche iPSCs, die in diesem Protokoll verwendet werden, wurden von gesunden Spendern abgeleitet und in Monoschichten unter Verwendung vollständig definierter niedermolekularer Modulations- von WNT-Signal- und Laktatreinigungstechniken wie zuvor beschrieben12,13,14unterschieden. iPSC-CMs wurden alle 2-3 Tage mit einem unten beschriebenen Kulturmedium gepflegt.
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	<li>Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+fluorescent+voltage+indicators+for+studying+membrane+potential.">Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).</li><li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+using+a+library+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+reveals+disease-specific+patterns+of+cardiotoxicity.">Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li><li>Horv&#225;th, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+resting+membrane+potential+and+low+inward+rectifier+potassium+currents+are+not+inherent+features+of+hiPSC-derived+cardiomyocytes.">Low resting membrane potential and low inward rectifier potassium currents are not inherent features of hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 822-833 (2018).</li><li>Salama, G., Morad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merocyanine+540+as+an+optical+probe+of+transmembrane+electrical+activity+in+the+heart.">Merocyanine 540 as an optical probe of transmembrane electrical activity in the heart.</a> Science. 191 (4226), 485-487 (1976).</li><li>Hortigon-Vinagre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+ratiometric+fluorescence+measurements+of+the+voltage+sensitive+dye+Di-4-ANEPPS+to+examine+action+potential+characteristics+and+drug+effects+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">The use of ratiometric fluorescence measurements of the voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS to examine action potential characteristics and drug effects on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Toxicological Sciences. 154 (2), 320-331 (2016).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Miller, E. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+atrial+cytosolic+calcium+handling+contributes+to+the+development+of+postoperative+atrial+fibrillation.">Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation.</a> Cardiovascular Research. , 162 (2020).</li><li>Gross, E., Bedlack, R. S., Loew, L. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins.">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li><li>Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photostable+silicon+rhodamine+platform+for+optical+voltage+sensing.">A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (33), 10767-10776 (2015).</li><li>Deal, P. E., Kulkarni, R. U., Al-Abdullatif, S. H., Miller, E. 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J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+&amp;+tissues.">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells &amp; tissues.</a> Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).</li><li>Kappadan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+optical+measurement+of+cardiac+restitution,+contraction,+and+fibrillation+dynamics+in+beating+vs.+blebbistatin-uncoupled+isolated+rabbit+hearts.">High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).</li><li>Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. 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Hier beschreiben wir ein grundlegendes Protokoll, um auf einfache Weise detaillierte AP-Profile von isolierten iPSC-CMs zu erfassen, die für die elektrophysiologische Modellierung und das kardiale Drogenscreening geeignet sind. Wir erkennen regelmäßige, robuste APs aus unseren spärlich gesäten iPSC-CMs, was sowohl auf Indikatorfunktionalität als auch auf methodische Genauigkeit hindeutet.
Aufgrund des breiten Spektrums kommerzieller Methoden für die iPSC-Reprogrammierung und der fehlend...

Die elektrophysiologische Modellierung von Kardiomyozyten und der Aufbau effizienter Plattformen für das kardiale Arzneimittelscreening sind essentiell für die Entwicklung therapeutischer Strategien für eine Vielzahl von Arrhythmusstörungen. Die rasche Expansion der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) hat vielversprechende Fortschritte in der Modellierung menschlicher Krankheiten und pharmakologischen Untersuchungen mit isolierten patientenbasierten Kardiomyozyten (iPSC-CM) ermöglicht. "Goldstandard" -Techniken zur elektrophysiologischen Charakterisierung dieser Zellen durch Patch-Clamp (Strom-Clamp) können die Morphologie und Dauer des Aktionspotentials (AP) quantifizieren, diese Methode ist jedoch unglaublich komplex und langsam und nicht gut für die Datenerfassung mit hohem Durchsatz geeignet1. Es wird regelmäßig berichtet, dass iPSC-CMs im Vergleich zu adulten nativen Kardiomyozyten ein erhöhtes diastolisches Membranpotenzial und einen erhöhten Ableitstrom aufweisen2. Es wird vermutet, dass eine kleinere Zellgröße und eine reduzierte Membrankapazität, die in iPSC-CMs beobachtet werden, bei der Verwendung der Strom-Klemm-Technik zu systematischen Fehlern führen können, was vielleicht diese Abweichungen erklärt3. Um die Nützlichkeit einer iPSC-CM-Plattform zu maximieren, ist eine zusätzliche Methode wertvoll, um den Durchsatz zu erhöhen und die Datengenauigkeit bei der Charakterisierung von Transmembranspannungsänderungen auf Einzelzellenebene in iPSC-CMs sicherzustellen.
Spannungsempfindliche Farbstoffe (VSD) sind seit langem eine vorgeschlagene Methode, um eine schnellere, nicht-invasive und gleichwertige Analyse der kardialen AP-Kinetik im Vergleich zu denen herkömmlicher Techniken zu ermöglichen4. Eine aktuelle Studie hat die Eignung der ratiometrischen spannungsempfindlichen Sondenphotometrie zur genauen Quantifizierung des kardialen AP5nachgewiesen. Darüber hinaus verleiht die Fähigkeit, optische Photometrieansätze leicht zu skalieren, diese Technik für groß angelegte Kardiotoxizitätsbildschirme, die für die Entwicklung therapeutischer Medikamente (z. B. CiPA) von entscheidender Bedeutung sind. Die Entwicklung standardisierter Kardiotoxizitätsprotokolle in einer verblindeten Multi-Site-Studie unter Verwendung von Mikroelektrodenarrays und optischen Spannungssensoren hat den Schlüsselwert dieses Ansatzes gezeigt6.
Viele potentiometrische Farbstoffe sind kommerziell erhältlich, und die laufende synthetische Entwicklung neuer Sonden zeigt ein aufregendes Potenzial, ihre Wirksamkeit über eine Vielzahl von kardialen und neuronalen Konstrukten hinweg zu rationalisieren. Der ideale VSD hat eine erhöhte Kinetik und Empfindlichkeit und zeigt gleichzeitig eine verminderte kapazitive Belastung, Photobleaching und Zytotoxizität. Das kürzlich synthetisierte VF2.1Cl (FluoVolt) drückt viele dieser vorteilhaften Eigenschaften aus, hauptsächlich aufgrund seiner neuartigen drahtbasierten Molekülstruktur, die von anderen Mitgliedern der neuen VoltageFluor (VF) -Familie geteilt wird7. Im Gegensatz zu herkömmlichen elektrochromen VSDs, bei denen einfache Sonden molekular und elektrisch mit der Plasmamembran konjugieren, besteht dieser Farbstoff aus einem passiv eingefügten, membranübergreifenden synthetischen Draht, der einen elektronenreichen Donor mit einem modifizierten Fluoreszeinfluorophor (FITC) paart. Mechanistische Details sind in Abbildung 1 dargestellt. Dieser Farbstoff zeigt eine ausgezeichnete Empfindlichkeit gegenüber Membranspannungsschwankungen und zeigt eine Änderung der Emissionsintensität um 27% pro 100 mV im Gegensatz zu ~ 10% bei anderen gängigen Sonden bei vergleichbaren Geschwindigkeiten7. Darüber hinaus interagieren drahtbasierte PeT-Systeme nicht direkt mit dem zellulären elektrischen Feld, was zu minimalen elektrischen Störungen und vernachlässigbaren Änderungen der zellulären kapazitiven Last führt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig01.jpg"> Abbildung 1: Chemische, spektrale und mechanistische Parameter des VF2.1Cl-Farbstoffs. (A) Chemische Struktur von VF2.1Cl. Zu den zu beachtenen molekularen Merkmalen gehören mehrere Alkylgruppen innerhalb des molekularen Phenylenvinylendrahtes, die das Einsetzen in die Plasmamembran erleichtern. Eine negativ geladene Sulfonsäuregruppe, die mit der FITC-Sonde konjugiert ist, sorgt für eine Fluorophorstabilisierung auf der extrazellulären Oberfläche und unterstützt die nahezu senkrechte Insertion relativ zum elektrischen Feld der Lipiddoppelschicht. (B) Vereinfachtes Schema der senkrechten VF2.1Cl-Einbettung in die Plasmamembran einer Zielzelle. (C) Absorptions- und Emissionsspektren des VF2.1Cl-Farbstoffs. Spectra ist identisch mit denen von Standard-FITC- und GFP-Sonden. (D) Darstellung der mechanistischen Wirkungsweise von VF2.1Cl. Unter Ruhebedingungen (hyperpolarisiert) treiben negative intrazelluläre Spannungen freie Elektronen in Richtung des rostralen Fluorophors. Die Elektronenhäufigkeit stellt sicher, dass der photoinduzierte Elektronentransfer (PeT) als Weg aus dem angeregten Zustand nach der optischen Anregung bevorzugt wird, wodurch die Fluoreszenz effektiv abgeschreckt wird. Im Gegensatz dazu beeinflusst ein depolarisiertes Membranpotential die Elektronenbewegung nach unten und begünstigt die Fluoreszenz bei optischer Anregung. Die resultierende Fluoreszenzantwort ist linear mit der Membranspannung verbunden und kann präzise genutzt werden, um detaillierte zeitliche Informationen über die zelluläre elektrophysiologische Kinetik zu sammeln. (E) Repräsentative Hellfeld- (obere) und Fluoreszenzaufnahmen bei 470 nm (unten) von Leporin-Kardiomyozyten, die mit VF2.1Cl. (F) Z-Stapel eines einzelnen geladenen Kardiomyozyten beladen sind. Pfeile zeigen Bereiche mit klarer Lokalisation von VF2.1Cl auf der Zellmembran an. Die Bilder wurden mit einem konfokalen System mit rotierender Scheibe aufgenommen, das aus einem konfokalen X-lightv3-Spinnscheibenkopf mit einem 50 μm-Lochmuster besteht. LDI-7 Beleuchtung; Prime95B Kamera und ein PlanApo Lambda 100x Objektiv. Maßstabsleiste: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die mit VF2.1Cl konjugierte FITC-Sonde stellt sicher, dass sie effektiv unter Standard- und GFP-Filterkonfigurationen eingesetzt werden kann und nur ein Einkanalerfassungssystem benötigt, die beide gemeinsame Merkmale von fluoreszierenden Bildgebungsplattformen sind. Die Analyse dichter menschlicher iPSC-CM-Monoschichten mit diesem Farbstoff wurde kürzlich berichtet8,9,10,11. Unser Protokoll unterscheidet sich von diesen Studien aufgrund unserer Untersuchung einzelner, isolierter iPSC-CMs, die von den elektrischen und parakrinen Einflüssen dichter synzytriler Monoschichten unbeirrt sind, und unserer Verwendung eines erschwinglichen und anpassbaren Photometriesystems im Gegensatz zu komplexen konfokalen oder Weitfeld-Bildgebungsanordnungen.
Hier beschreiben wir unser Protokoll zur schnellen Erfassung und Analyse robuster optischer APs aus isolierten humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten und nativen Kardiomyozyten (siehe Ergänzungsdatei). Wir verwenden VF2.1Cl in Verbindung mit einer anpassbaren State-of-the-Art-Plattform für Einzelzell-Photometrie-Messungen. Diese Versuchsprotokolle wurden von der Ethikkommission der Universitätsmedizin Göttingen genehmigt (Nr. 09.10.15).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 Trypsin EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>HN04.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose anhydrous&#160;BioChemica</td>
			<td>ITW Reagents</td>
			<td>A1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt Membrane Potential Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>HN77.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamanin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21829-25-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor Y27632</td>
			<td>Stemolecule</td>
			<td>04-0012-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15040033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>495LP Dichroic Beamsplitter&#160;</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circle Coverslips, Thickness 0</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CB00100RA020MNT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1550B</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual OptoLED Power Supply&#160;</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET470/40x Excitation Filter&#160;</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET535/50m</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etched Neubauer Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Cubes&#160;</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Inverted Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MonoLED</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiport Adaptors&#160;</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myopacer Cell Stimulator&#160;</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optomask Shutter&#160;</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optoscan System Controller</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH-1 Temperature Controlled Platform&#160;&#160;</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier Detector&#160;</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT Amplifier Insert</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT Supply Insert</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC-26G Open Bath Chamber&#160;</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA-OLY/2AL Stage Adaptor&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T565lpxr Dichroic Beamsplitter&#160;</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T660lpxr Dichroic Beamsplitter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-20 Dual Channel Temperature Controller&#160;</td>
			<td>npi Electronic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLFLN 40X Objective</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB 3.0 Colour Camera&#160;</td>
			<td>Imaging Source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex 11.1</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampfit 11.1</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IC Capture 2.4&#160;</td>
			<td>Imaging Source&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

Herkömmliche intrazelluläre Mikroelektrodentechniken zur Quantifizierung der Kardiomyozyten-Elektrophysiologie sind extrem komplex, arbeitsintensiv und werden typischerweise bei niedrigem Durchsatz durchgeführt. Die schnelle und kontinuierliche Expansion der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) stellt einen neuen Standard in der kardiovaskulären Forschung dar, und alternative Methoden sind jetzt notwendig, um den Durchsatz elektrophysiologischer Daten auf Einzelzellebene zu erhöhen. VF2.1Cl ist ein kürzlich abgeleiteter spannungsempfindlicher Farbstoff, der eine schnelle einkanalige, hohe Reaktion auf Schwankungen des Membranpotentials bietet. Es verfügt über eine Kinetik, die der anderer vorhandener Spannungsindikatoren überlegen ist, und stellt funktionale Daten zur Verfügung, die denen herkömmlicher Mikroelektrodentechniken entsprechen. Hier demonstrieren wir eine vereinfachte, nicht-invasive Charakterisierung des Aktionspotentials in extern beschleunigten menschlichen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten mit einem modularen und äußerst erschwinglichen Photometriesystem.

<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig03.jpg"> Abbildung 3: Profile des optischen Aktionspotentials (AP) isolierter nativer Kardiomyozyten und humaner induzierter pluripotenter Stammzell-abgeleiteter Kardiomyozyten (iPSC-CM). (A) Repräsentativer optischer AP eines einzelnen murinen Kardiomyozyten (Mitte) mit mittlerer ± SEM von APD50 und APD90 (n = 7, rechts). (B) Repräsentati...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Hier beschreiben wir die optische Erfassung und Charakterisierung von Aktionspotentialen aus induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten mit einem modularen Hochgeschwindigkeits-Photometriesystem.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Forschung

Biotechnik

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Human iPSC-Derived Cardiomyozyte Networks auf Multiwell Micro-Elektroden-Arrays für recurrent Action Potential Recordings

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Geführte Differenzierung reifer Nierenpodozyten aus human induzierten pluripotenten Stammzellen unter chemisch definierten Bedingungen

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Mikrofluidische Herstellung von Core-Shell-Mikrokapseln mit humanen pluripotenten Stammzellsphäroiden

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Isogener Nieren-Glomerulus-Chip aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Evaluierung der kardialen Kontraktilitätsmodulationstherapie in 2D-Kardiomyozyten aus humanen Stammzellen

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...