Name: derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening
Uploaded: 2021-01-16T15:00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

وقد أجري هذا البحث على خط الشعاع MX1 في السنكروترون الأسترالي، وهو جزء من ANSTO. ويود المؤلفون أن ينوهوا بأعضاء مختبري شيروين وبرونينغ لإجراء مناقشات حول هذا العمل. كما يود المؤلفان أن ينوها بالدكتورة سانتوش بانجيكار والدكتورة ليندا وايت - شيروين اللذين ساهما في العمل الأصلي الذي كان رائداً في هذا البروتوكول.
ويعترف بالتمويل التالي: مجلس البحوث الأسترالي (منحة رقم. DP150103009 و DP160101450 إلى كيث E. شيروين); جامعة أديلايد (منحة برنامج التدريب على البحوث الحكومية الأسترالية ل جيا كوين ترونج وستيفاني نغوين).

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

يتطلب تحديد بنية بروتين جديد في غياب نموذج homology مناسب للاستبدال الجزيئي مراحل تجريبية. هذه الأساليب تتطلب دمج الذرات الثقيلة في الكريستال البروتين الذي يضيف مستوى من التعقيد إلى خط أنابيب تحديد هيكل ويمكن أن أعرض العديد من العقبات التي يجب معالجتها. ويمكن دمج الذرات الثقيلة مباشرة في البروتين من خلال التعبير المسمى باستخدام سيلينوميثيونين وسيلينوسشتاين. وبما أن هذه الطريقة مكلفة وشاقة ويمكن أن تؤدي إلى انخفاض غلة البروتين، وغالبا ما يتم التعبير عن البروتين المسمى بعد أن تم العثور على ظروف التبلور وتحسينها مع البروتين غير المسمى. بدلا من ذلك، يمكن اشتقاق البلورات عن طريق نقع في محلول يحتوي على ذرات ثقيلة22،63،64. وغالبا ما يستخدم هذا الأسلوب بلورات ذات جودة عالية، وبالتالي يتم تنفيذ بعد طريقة تبلور قوية قد تم بالفعل تطوير. الحصول بنجاح على الكريستال مشتق باستخدام هذه الطريقة يتطلب المزيد من التحسين لإجراءات النقع وفحص المركبات مراحل مختلفة، وبالتالي إضافة المزيد من الوقت لعملية شاقة بالفعل.
يمكن إجراء التبلور المشترك للبروتين مع الذرة الثقيلة في مرحلة الفحص ، وبالتالي تبسيط العملية بشكل فعال والحد من خطوات التلاعب بالكريستال التي يمكن أن تسبب الضرر. ومع ذلك ، لا يزال هناك سيناريو محتمل للحصول على عدد قليل من ضربات التبلور الأولي ومشكلة اختيار مركب ذرة ثقيلة متوافق. العديد من المركبات التدريجي المتاحة حاليا لا تتفق مع الزلاجة, المخازن المؤقتة والمواد المضافة التي توجد عادة في ظروف التبلور. قد تكون غير قابلة للذوبان في المخزونات الكبريتية والفوسفات، وchelate إلى سيترات وخلات، والرد بشكل غير موات مع هيبس وترايس المخازن المؤقتة أو تصبح معزولة من قبل DTT β-mercaptoethanol21. وبما أن مركب المراحل I3C لا يعاني من هذه التنافرات، فهو مركب قوي للتدرج يمكن أن يكون قابلاً للعديد من الظروف المختلفة.
في هذه الدراسة، يتم عرض طريقة مبسطة لإنتاج بلورات مشتقة جاهزة لتدرج ساد من خلال التبلور المتزامن لمركب I3C التدريجي و rMMS. ويؤدي الجمع بين كل من التقنيات إلى زيادة عدد مرات التبلور، مع وجود العديد من الظروف التي تحسنت خصائص المورفولوجيا والنقود. في كل من حالات اختبار NTD و HEWL، تم تحديد شروط جديدة في شاشة I3C-rMMS التي كانت غائبة عندما لم يكن I3C موجوداً. يحتمل، قد I3C ربط لصالح البروتين، وتسهيل تشكيل وتثبيت اتصالات الكريستال27. وهذا بدوره قد يؤدي إلى التبلور وربما تحسين خصائص الحيود. بالإضافة إلى كونه مركب متوافق مع شاشات مصفوفة متفرقة، I3C هو أيضا مركب مراحل جذابة نظرا لخصائصه الجوهرية. المجموعات الوظيفية التي تتناوب مع اليود على سقالة حلقة العطرية تسمح ملزمة محددة للبروتينات. وهذا يؤدي إلى زيادة الإشغال ويحتمل أن يقلل من إشارة الخلفية23. وعلاوة على ذلك، فإن ترتيب التشتت الشاذ في مثلث متساوي الأضلاع واضح في البنية الفرعية ويمكن استخدامه للتحقق بسرعة من تثبيت I3C (الشكل 4B و 4C). وأخيرا، فإنه يمكن أن تنتج إشارة شاذة مع إشعاع سينكروترون قابل للتواؤم وكذلك الكروم والنحاس الدورية مصادر الأشعة السينية الأنود. وبالتالي، يمكن تطبيقه على العديد من مهام سير العمل المختلفة. وبما أن I3C متاح على نطاق واسع وغير مكلف للشراء ، فإن هذا النهج في متناول معظم مختبرات البيولوجيا الهيكلية.
هناك العديد من الاعتبارات التجريبية التي يجب معالجتها عند استخدام أسلوب I3C-rMMS. لا يمكن تطبيق هذه الطريقة إذا لم يكن بالإمكان الحصول على المواد البلورية الأولية للبروتين. في الحالات الصعبة، يمكن أيضا أن تستخدم المواد البلورية من بروتين متماثل لتوليد مخزون البذور. وقد أظهرت هذه النهج البذر عبر لrMMS بعض النتائج الواعدة7. تحسين عدد البلورات من خلال تخفيف مخزون البذور هو خطوة حاسمة، والتي لا ينبغي إغفالها، لتعظيم فرصة إنتاج بلورات كبيرة ذات جودة عالية والحصول على بيانات الحيود المناسبة. وإذا كان هناك عدد قليل من المواقع المحددة في الوحدة غير المتماثلة، ينبغي تحسين الظروف المؤدية إلى التبلور مع زيادة تركيز I3C. وهذا قد يزيد من شغل I3C لتعظيم إشارة شاذة والمساعدة البلورة اشتقاق.
يمكن أن تكون هناك حالات حيث قد لا يكون هذا الأسلوب هو الطريقة المثلى لاشتقاق بلورات البروتين. كما يزيد حجم البروتين أو البروتين المعقدة، وعدد محدود من مواقع I3C على سطح البروتين قد لا توفر ما يكفي من قوة المراحل لحل الهيكل. في هذه السيناريوهات حيث يشتبه في أن حجم البروتين يعوق التدرج، قد يكون وضع وسم سيلينوميثيونين للبروتين نهجا أكثر قابلية للتطبيق على مراحل البروتين. إذا كان البروتين لديه أعداد كافية من بقايا الميثيونين في البروتين (يوصى بوجود الميثيونين واحد على الأقل لكل 100 بقايا65)ويمكن تحقيق دمج السيلينيومثيونين عالي الكفاءة في البروتين (كما هو الحال في أنظمة التعبير البكتيري66)، فإن ذرات السيلينيوم متعددة الإشغال عالية ستكون موجودة في البلورات لمرحلة الهيكل.
بالإضافة إلى ذلك، قد تكون بعض البروتينات بطبيعتها غير مناسبة لاشتقاقها باستخدام I3C. مواقع الربط I3C على البروتينات تعتمد على بنية البروتين. قد توجد بروتينات تحتوي بشكل طبيعي على بقع قليلة مكشوفة متوافقة مع I3C ملزم. وبالتالي، فإنه ليس من غير المتوقع أن تكون هناك صعوبات في بلورة بعض البروتينات المستهدفة مع I3C.

في مجال البيولوجيا الهيكلية، ويعتبر التصوير البلوري بالأشعة السينية على أنها تقنية معيار الذهب لتحديد هياكل التحليل الذري للجزيئات الكبيرة. وقد استخدمت على نطاق واسع لفهم الأساس الجزيئي للأمراض، وتوجيه مشاريع تصميم المخدرات الرشيد وتوضيح الآلية الحفازة للإنزيمات1،2. على الرغم من أن البيانات الهيكلية توفر ثروة من المعرفة، فإن عملية التعبير عن البروتين وتنقيته، والتبلور وتحديد الهيكل يمكن أن تكون شاقة للغاية. وتواجه هذه المشاريع عادة عدة اختناقات تعوق تقدم هذه المشاريع، ويجب معالجة هذه العقبات لتبسيط عملية تحديد الهيكل البلوري بكفاءة.
بعد التعبير المتلفز والتنقية، يجب تحديد الظروف الأولية التي تؤدي إلى التبلور والتي غالباً ما تكون جانباً شاقاً ويستغرق وقتاً طويلاً في التصوير البلوري بالأشعة السينية. شاشات مصفوفة متفرقة تجارية تقوم بتوحيد الشروط المعروفة والمنشرة وقد تم تطويرها لتخفيف هذا عنق الزجاجة3,4. ومع ذلك، فمن الشائع لتوليد عدد قليل من الزيارات من هذه الشاشات الأولية على الرغم من استخدام عينات البروتين نقية للغاية ومركزة. يشير ملاحظة قطرات واضحة إلى أن البروتين قد لا يكون الوصول إلى مستويات التشبع الفائق المطلوبة لnuclecleate الكريستال. لتشجيع نوات الكريستال والنمو، يمكن إضافة البذور المنتجة من بلورات موجودة من قبل إلى الظروف وهذا يسمح لزيادة أخذ العينات من مساحة التبلور. قدم إيرتون وStoddard لأول مرة طريقة فحص مصفوفة microseed5. سحقت بلورات رديئة الجودة لجعل مخزون البذور ومن ثم تضاف بشكل منهجي إلى ظروف بلورة تحتوي على أملاح مختلفة لتوليد بلورات جديدة ذات جودة الحيود التي لم تكن قد شكلت خلاف ذلك. وقد تم تحسين هذه التقنية من قبل D'Arcy وآخرون الذين طوروا فحص مصفوفة البذور الدقيقة العشوائية (rMMS) التي تم إدخال البذور في شاشة تبلور المصفوفة الاحتياطية6،7. هذا يحسن النوعية من بلورة ويزيد الرقم من بلورة يضرب على معدل بعامل من 7.
بعد أن يتم إنتاج البلورات بنجاح ويتم الحصول على نمط الحيود بالأشعة السينية ، هناك اختناق آخر في شكل حل "مشكلة المرحلة". أثناء عملية الحصول على البيانات، يتم تسجيل شدة الحيود (متناسب مع مربع السعة) ولكن يتم فقدان معلومات المرحلة، مما يؤدي إلى مشكلة المرحلة التي توقف تحديد الهيكل الفوري8. إذا كان البروتين الهدف أسهم هوية عالية تسلسل لبروتين مع بنية محددة سابقا، يمكن استخدام استبدال الجزيئية لتقدير معلومات المرحلة9،10،11،12. على الرغم من أن هذه الطريقة سريعة وغير مكلفة، قد لا تكون هياكل النموذج متوفرة أو مناسبة. نجاح طريقة الاستبدال الجزيئي المستندة إلى نموذج homology ينخفض بشكل ملحوظ كما تسلسل الهوية تنخفض إلى أقل من 35٪13. في حالة عدم وجود نموذج homology مناسبة، ab initio الأساليب، مثل ARCIMBOLDO14،15 و16AMPLE، يمكن اختبارها. وتستخدم هذه الطرق نماذج أو أجزاء متنبأ بها حسابياً كنقاط انطلاق للاستبدال الجزيئي. وينتظّر "AMPLE" الذي يستخدم نماذج خادعة متوقّفاً كنقاط انطلاق، من أجل حلّ هياكل من البروتينات الكبيرة (>100 بقايا) والبروتينات التي تحتوي في الغالب على β. ARCIMBOLDO، الذي يحاول احتواء أجزاء صغيرة لتمتد إلى هيكل أكبر، يقتصر على البيانات عالية الدقة (≤2 Å) وقدرة الخوارزميات على توسيع الأجزاء إلى هيكل كامل.
إذا فشلت طرق الاستبدال الجزيئية، يجب استخدام طرق مباشرة مثل الاستبدال الأيزومورفي17و18 والتشتت الشاذ عند طول موجة واحد (SAD19)أو أطوال موجية متعددة (MAD20). هذا هو الحال في كثير من الأحيان لهياكل جديدة حقا، حيث يجب أن تكون البلورة أو اشتقاق مع ذرة ثقيلة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق نقع أو البلورة المشتركة مع مركب ذرة ثقيلة، تعديل الكيميائية (مثل 5-bromouracil دمج في الجيش الملكي النيبالي) أو تعبير البروتين المسمى (مثل دمج الأحماض الأمينية سيلينوميثيونين أو selenocysteine في الهيكل الأساسي)21،22. وهذا يزيد من تعقيد عملية التبلور ويتطلب المزيد من الفرز والتحسين.
وهناك فئة جديدة من مركبات المراحل، بما في ذلك I3C (5-أمينو-2،4،6-triiodoisophthalic حامض) وB3C (5-أمينو-2،4،6-tribromoisophthalic حامض)، تقدم مزايا مثيرة على المركبات المراحلية الموجودة مسبقا23،24،25. يتميز كل من I3C و B3C سقالة حلقة عطرية مع ترتيب بالتناوب من التشتت الشاذ المطلوب لطرق المراحل المباشرة والمجموعات الوظيفية الأمينية أو الكربوكسيلات التي تتفاعل على وجه التحديد مع البروتين وتوفير خصوصية موقع ملزم. ويسمح الترتيب الثلاثي متساوي الأضلاع اللاحق لمجموعات المعادن الثقيلة بتبسيط التحقق من البنية الفرعية لتدرجها. في وقت كتابة هذا التقرير، هناك 26 I3C الهياكل ملزمة في بنك بيانات البروتين (PDB)، منها 20 تم حلها باستخدام SAD phasing26.
هذا البروتوكول يحسن فعالية خط أنابيب تحديد الهيكل من خلال الجمع بين أساليب اشتقاق المعادن الثقيلة وفحص rMMS لزيادة عدد ضربات التبلور في وقت واحد وتبسيط عملية اشتقاق الكريستال. لقد أثبتنا أن هذه الطريقة كانت فعالة للغاية مع بيض البيض lysozyme و المجال من رواية بروتين lysin من bacteriophage P6827. يتم وصف حل الهيكل باستخدام خط أنابيب تحديد هيكل Auto-Rickshaw الآلي للغاية ، والمصمم خصيصًا لمجمع I3C التدريجي. هناك خطوط أنابيب الآلي الأخرى التي يمكن استخدامها مثل AutoSol28، اللجان29 و CRANK230. يمكن أيضاً استخدام الحزم غير الكاملة الآلية مثل SHELXC/D/E31،32،33. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص للباحثين الذين يدرسون البروتينات التي تفتقر إلى نماذج متجانسة في PDB ، من خلال تقليل عدد خطوات الفحص والتحسين بشكل كبير. شرط مسبق لهذه الطريقة هو بلورات البروتين أو الترسبات البلورية من البروتين المستهدف، التي تم الحصول عليها من تجارب التبلور السابقة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL disposable luer lock syringes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>T3SS10LAT</td>
			<td>Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used for hanging drop crystal tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-506</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22178</td>
			<td>Commonly referred to as I3C in the article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-297</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18X18-2</td>
			<td>Coverslips for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning vacuum grease</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-510</td>
			<td>Used for sealing hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette 0.1 &#956;L-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 2 &#956;L-20 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1153247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 20 &#956;L-200 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1152006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>HIR92601.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Approximately 95% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IndexHT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope illuminator</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>FT192/230</td>
			<td>Light source to illuminate crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/ION HT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Liquid Dispenser</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel with scalpel blade no. 15</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>LV-SMSCPO15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope&#160;</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>EMZ-5TR</td>
			<td>Microscope for visualising crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>RAVM1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening

ويتطلب توضيح بنية البروتين باستخدام التصوير البلوري بالأشعة السينية بلورات diffracting عالية الجودة وحل حسابي لمشكلة مرحلة الحيود. وغالبا ما تستمد الهياكل الجديدة التي تفتقر إلى نموذج علم الهموم المناسب مع ذرات ثقيلة لتوفير معلومات المرحلة التجريبية. البروتوكول المقدمة يولد بكفاءة بلورات البروتين المشتقة من خلال الجمع بين فحص مصفوفة microseeding عشوائية مع اشتقاق مع جزيء ذرة ثقيلة I3C (5-amino-2،4،6-triiodoisophthalic acid). من خلال دمج I3C في شعرية الكريستال، يمكن حل مشكلة مرحلة الانعراج بكفاءة باستخدام تشتت أحادي الطول الموجي الشاذ (SAD) على مراحل. ترتيب المثلث متساوي الأضلاع من ذرات اليود في I3C يسمح للتحقق السريع من بنية فرعية شاذة الصحيح. وسيكون هذا البروتوكول مفيدا لعلماء الأحياء الهيكلية الذين يحلون الهياكل الجزيئية الكلية باستخدام تقنيات تستند إلى البلورات مع الاهتمام بالتداوي التجريبية.

دمج I3C في rMMS يمكن أن تولد ظروف جديدة تدعم نمو البلورة المشتقة وقد أظهرت فعالية فحص rMMS المتزامنة و I3C اشتقاق في اثنين من البروتينات, الدجاج البيض الأبيض lysozyme (HEWL, التي تم الحصول عليها كمسحوق lyophilized) والموضع المفترض Orf11 lysin N-terminal المجال (Orf11 NTD) من bacteriophage P68. تم فحص كل بروتين ضد PEG /ION HT تحت أربعة ظروف مختلفة بما في ذلك: غير المصنفة، المصنفة، غير المصنفة مع I3C وبذر مع I3C (الشكل 1). وبالنسبة لكلا البروتينين، فإن الإضافة الوحيدة لـ I3C لم تزيد من عدد الظروف المؤدية إلى التبلور. في حالة Orf11 NTD، تم تحديد حالة مناسبة واحدة فقط مع وبدون I3C (الشكل 1B). عندما تم إضافة I3C إلى شاشات HEWL ، تم تقليل عدد الزيارات من 31 إلى 26 ، مما يسلط الضوء على التعقيدات الإضافية للبلورة عند إدخال مركبات التدرج(الشكل 1A). بما يتفق مع دراسات أخرى، إضافة البذور إلى شاشات مصفوفة التجارية متفرق لتوليد شاشة rMMS زيادة كبيرة في عدد من الظروف التبلور ممكن لكلا البروتينات، مما أدى إلى زيادة 2.1 و 6 أضعاف لـ HEWL و Orf11 NTD، على التوالي6،61 (الشكل 1). الأهم من ذلك ، إضافة في وقت واحد من I3C والبذور زيادة عدد الزيارات نسبة إلى شاشة غير مرئية ، مما يدل على زيادة 2.3 و 7 أضعاف لـ HEWL و Orf11 NTD ، على التوالي. العديد من البلورات من rMMS في وجود I3C إظهار مورفولوجيا الكريستال ممتازة (الشكل 2).
البذر يسمح بالسيطرة الدقيقة من عدد الكريستال في شاشات I3C rMMS في تجارب البذور الدقيقة، يمكن التحكم في عدد البذور التي أدخلت في تجربة التبلور عن طريق تخفيف مخزون البذور وهذا يسمح للتحكم الدقيق في النوى في انخفاض7،36. وهذا يسمح في كثير من الأحيان أكبر بلورات لتشكيل منذ هناك انخفاض المنافسة من جزيئات البروتين في مواقع nucleation. هذه الميزة تمتد أيضا إلى أسلوب I3C-rMMS وقد تم إثبات بنجاح في كل من HEWL و ORF11 NTD. استجمام حالة تبلور تم تحديدها من شاشة I3C-rMMS مع مخزون البذور المخففة أسفرت عن بلورات أقل ولكن أكبر(الشكل 3).
يمكن استخدام مراحل ساد لحل الهياكل من بلورات مشتقة من الشاشة rMMS I3C بلورات نمت باستخدام مخزون البذور المخففة كما هو موضح في الشكل 3 واستخدمت في حل هيكل البروتينات باستخدام مراحل ساد باستخدام بيانات الحيود من بلورة واحدة(الشكل 4). تم جمع البيانات على خط الشعاع الأسترالي Synchrotron MX162. يتم وصف تفاصيل جمع البيانات المفصلة و حلول البنية في مكان آخر27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig01.jpg"> الشكل 1 - تم استخدام rMMS لتوليد ظروف جديدة لنمو البلورات في وجود I3C لبروتين اختبار اثنين. 96 جيدا بخار نشر تبلور شاشات أجريت باستخدام شاشات مصفوفة التجارية متفرق. (A) تم اختبار البيض البيض Hen lysozyme مع شاشة HT مؤشر. تم البذور الصواني مع بلورات HEWL نمت في 0.2 M الترترات الأمونيوم دباسيتش 7.0، 20٪ (ث / الخامس) البولي إيثيلين جلايكول 3350. (ب)تم اختبار Orf11 NTD من bacteriophage P68 مع شاشة PEG/ION. تم البذور الصواني NTD Orf11 من بلورات من حالة G12 من الشاشة غير المصنفة، ويظهر باللون الأزرق. تظهر الظروف التي تدعم نمو البلورات باللون الأحمر. rMMS البذر في وجود وغياب I3C على حد سواء أعطى أكثر بكثير يضرب الكريستال من الصواني غير مرئية. الشكل المقتبس من ترونغ وآخرون27 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig02.jpg"> الشكل 2 - صور تمثيلية لبلورات نمت من تجارب انتشار البخار الموضحة في الشكل 1 (أ) و (ب). الشكل المقتبس من ترونغ وآخرون27 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig03.jpg"> الشكل 3 - تخفيف مخزون البذور هو وسيلة فعالة للحد من النوى في حالة تبلور وجدت باستخدام طريقة I3C-rMMS، للسيطرة على عدد من البلورات التي تشكل. إن تقليل التنو داخل قطرة غالباً ما يؤدي إلى نمو البلورات إلى أبعاد أكبر. الشكل المقتبس من ترونغ وآخرون27 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig04.jpg"> الشكل 4 -- Orf11 NTD (معرف PDB 6O43) و HEWL (معرف PDB 6PBB) وتبلور باستخدام طريقة I3C - rMMS وحلها باستخدام لصناعة السيارات ريكشو SAD مراحل. (أ)هياكل الشريط من HEWL و Orf11 NTD حلها من خلال مراحل التجريبية. (B) جزيء I3C ملزمة HEWL و Orf11 NTD. (ج) يتم ترتيب ذرات اليود الشاذة في I3C في مثلث متساوي الأضلاع من 6 Å. وبالتالي فإن وجود هذا المثلث في الهيكل الفرعي التدريجي يشير إلى وجود جزيء I3C في هذا الموضع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61984fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

تقدم هذه المقالة طريقة لتوليد بلورات البروتين مشتقة مع I3C (5-أمينو-2،4،6-ثلاثي يودويسوفسثاليك) باستخدام microseeding لتوليد ظروف تبلور جديدة في شاشات مصفوفة متفرقة. يمكن إعداد الصواني باستخدام الروبوتات الاستغناء السائل أو باليد.

اشتقاق بلورات البروتين مع I3C باستخدام عشوائي Microseed مصفوفة الفرز

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

هذا هو بروتوكول التبلور تهدف إلى تحسين نمو الكريستال البروتين في حين اشتقاق في وقت واحد البروتين مع جزيء مراحل لتحديد بنية البروتين عن طريق التصوير البلوري بالأشعة السينية. لتحديد بنية الكريستال بالأشعة السينية من البروتين رواية تماما، هي الأمثل ظروف التبلور لإنتاج بلورات الجودة. في حالة وجود بروتين جديد تمامًا ، يجب إدخال الذرات الثقيلة في الكريستال لإنتاج بلورة مشتقة.يتم جمع بيانات الحيود بالأشعة السينية من الكريستال المشتق ويجب حلها حسابيا لإنتاج بنية بلورية بالأشعة السينية. إن التبلور والاستنباط هما عمليتان شاقتان. ولمعالجة هذه الاختناقات، قمنا بوضع إجراء فرز أمثل يحقق كلا الهدفين في آن واحد.يستخدم هذا البروتوكول تقنية تم تطويرها سابقًا وتعرف باسم فحص مصفوفة المجهر العشوائية. يتم سحق البلورات أو الترسبات البلورية حتى في الركازات التي يمكن استخدامها لبدء نمو البلورات في ظروف مستقلة تماما. في الوقت نفسه، ونحن نقدم جزيء مراحل تسمى I3C في حالة التبلور.هذا الجزيء يوفر إشارة شاذة كبيرة والتي تسمح لحل الهيكل من خلال طول موجة واحد الشاذة مناقشة مراحل. للمستخدمين غير مألوفة مع التحجيم التجريبي للهياكل الكريستال نقدم خط أنابيب البرمجيات سهلة الاستخدام لأتمتة جزئيا حل هيكل تكييفه لاستخدام إشارة شاذة من I3C. الخطوة الأولى هي إنشاء مخزون I3C.قياس من أصل 120 ملليغرام من I3C في أنبوب microcentrifuge. إضافة 200 ميكرولترات من اثنين من هيدروكسيد الليثيوم المولر إلى أنبوب microcentrifuge. يمكن استخدام تسخين الأنبوب من 40 إلى 60 درجة ودوامة للتشجيع على حل.يجب أن يكون مخزون المول الواحد من محلول Lithium I3C بنيًا. يمكن استخدام طريقتين لإدخال I3C إلى مخزون البروتين. يمكن إضافة الليثيوم I3C مباشرة إلى مخزون البروتين.3.75 ميكرولترات إلى 30 ميكرولترات من I3C يمكن أن تضاف إلى 150 ميكرولترات من البروتين لإعطاء تركيز بين خمسة و 14 ملليمولار. بعض البروتينات يمكن أن تترسب عند ملامسة تركيزات عالية من I3C. في هذه الحالات، يمكن إضافة الليثيوم I3C إلى عازلة تخفيف البروتين الذي هو العازلة مطابقة عينة البروتين لتركيز النهائي بين 10 إلى 80 ملليمولار.إضافة 150 ميكرولترات من العازلة تخفيف البروتين إلى 150 ميكرولترات من عينة البروتين. يتم إجراء مسبار زجاجي لسحق البلورات من ماصة باستور الزجاجية. مع موقد بونسن على اللهب الأزرق، تسخين ماصة باستور نحو الوسط.باستخدام زوج من الملاقط، سحب نهايات ماصة باستور إلى قطر رقيقة أقل من 0.3 ملليمتر. عقد هذا الجزء في الشعلة لفصل ماصة في هذه المرحلة وجولة نهاية ماصة لإنهاء مسبار الزجاج. هذا مثال على كيف يجب أن تبدو الماصات الزجاجية.قد يتم أيضا طلب السحق الكريستال من البائعين طرف ثالث كبديل لجعل الخاصة بك يتم إنشاء مخزون بزرعة صغيرة عن طريق سحق بلورات البروتين أو الترسبات البلورية. ضع خمسة أنابيب 1.5 مل ميكروسنتريفوغ على الجليد. تحت المجهر الخفيف، حدد أفضل بلورات مورفولوجيا أو الترسبات البلورية التي يمكن التضحية بها.ل96 تبلور جيدا الصواني فتح البئر عن طريق قطع الشريط البلاستيك الختم. بالنسبة إلى الصواني المنسدلة، يمكن إزالة زلة الغطاء باستخدام الملاقط والمقلوبة على سطح مستو. نقل 70 ميكرولترات من محلول الخزان إلى واحدة من أنابيب microcentrifuge والبرد على الجليد.إلى الأنابيب المتبقية، ونقل 90 ميكرولترات من محلول الخزان إليها والعودة إلى الجليد إلى البرد. إذا كان حجم الخزان غير كافية هو خزان التبلور الحالي يمكن أن يتم عن طريق خلط الكواشف المناسبة ويمكن استخدامها بدلا من ذلك. تهيج البلورات في قطرة التبلور باستخدام مسبار الزجاج سحق تماما عنه.يمكن رصد التقدم تحت المجهر حتى لا تكون البلورات أو المواد البلورية مرئية. نقل كل من السائل من قطرة إلى أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على 70 ميكرولترات من محلول الخزان. مزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.نقل اثنين إلى ثلاثة ميكروليتر من الخليط مرة أخرى إلى البئر وشطف البئر عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. نقل الخليط مرة أخرى إلى أنبوب microcentrifuge. وينبغي تكرار هذه الخطوة شطف مرة أخرى.وينبغي أن تبقى أنبوب microcentrifuge الباردة من هذه النقطة إلى الأمام لتجنب ذوبان الذرات الدقيقة. دوامة الأنبوب في السرعة القصوى في أربع درجات لمدة ثلاث دقائق تقشعر لها الأبدان الأنبوب على الجليد بانتظام لمنع ارتفاع درجة الحرارة. جعل واحد من كل 10 المخففات التسلسلية من مخزون البذور عن طريق نقل تسلسلي 10 ميكرولترات بين حلول الخزان المبردة.بين التخفيفات مخزون البذور، ينبغي أن يكون دوامة الأنبوب. وينبغي تخزين مخزونات البذور التي لن تستخدم على الفور، في ثلاجة ناقص 80 درجة فائقة البرودة. ويمكن إعداد 96 مصفوفة مصفوفة عشوائية جيدا الشاشة باستخدام السائل الاستغناء عن الروبوت.وضع مخزون البذور، حل مخزون البروتين تكملها I3C وشاشة التبلور في الروبوت. باستخدام الروبوت نقل 75 ميكروليتر من شاشة التبلور إلى علبة 96 جيدا. إضافة ميكرولتر واحد إلى قطرة التبلور و 74 ميكرولترات إلى الخزان.نقل ميكرولتر واحد من البروتين المكمل مع I3C إلى قطرة التبلور. نقل 0.1 ميكرولترات من مخزون البذور إلى انخفاض التبلور. ختم لوحة باستخدام ختم الشريط.يمكن إعداد شاشات الإسقاط المعلقة في 24 صواني تبلور قطرة معلقة. الشحوم حواف الآبار قطرة معلقة. نقل 500 ميكرولترات من محلول التبلور إلى الخزان.بالقرب من مركز شريحة غطاء زجاجي وضع قطرة ميكرولتر واحدة من حل التبلور. إلى هذا الانخفاض، إضافة ميكرولتر واحد من البروتين المكمل مع الليثيوم I3C و 0.1 ميكرولترات من مخزون البذور. عكس الشريحة الغطاء وختم التبلور جيدا عن طريق دفع الشريحة الغطاء في الشحوم.يتم احتضان قطرة معلقة وختم الصواني قطرة في درجة حرارة ثابتة للسماح للبلورات لتشكيل. وينبغي أن يتم تفتيشها بانتظام تحت المجهر لنمو البلورات. بعد الحصول على بيانات الحيود ودمجها وتحجيمها كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرافق ، يمكن استخدام خط أنابيب تحديد بنية الكريستال الآلي التلقائي للريكشو لحل مشكلة المرحلة ونموذج البروتين.في الصفحة المقصودة Auto-Rickshaw، انقر على زر المتابعة. أدخل البريد الإلكتروني المؤسسي الخاص بك في نموذج ويب Auto-Rickshaw وانقر فوق متابعة تشغيل Auto-Rickshaw. للبروتينات دون قالب homology موتو تشغيل بروتوكول SAD من السيارات ريكشو في الوضع المتقدم.أدخل المعلمات المطلوبة. حدد البروتين كنوع الجزيء. أدخل الطول الموجي لجمع البيانات في angstroms.مثل ذلك مثل أنا كعنصر تحتية للإشارة إلى استخدام ذرات اليود. حدد نوع الهيكل الفرعي I3C للإشارة إلى أن I3C كان جزيء المراحل. حدد sub_direct كأسلوب تحديد البنية الفرعية.حدد ثلاثة كرقم من الهياكل الفرعية المتوقعة لكل مونومر. أدخل واحدًا كقطع حجز للبحث عن البنية الفرعية. وهذا يسمح للسيارات - ريكشو لتحديد تلقائيا قطع القرار مناسبة.أدخل عدد المخلفات في مونومر واحد، مجموعة الفضاء لمجموعة البيانات وعدد الجزيئات في وحدة غير متماثلة استناداً إلى معامل ماثيوز. حدد مستوى النشر المناسب لبيانات الأشعة السينية التي تناسب احتياجاتك. إدخال البيانات الشاذة كملف مجموعة فارغة.إدخال تسلسل البروتين الخاص بك كملف SEQ أو PIR أو TXT. أدخل عنوان البريد الإلكتروني المؤسسي الخاص بك. يتم تسليم النتائج إليك عبر رابط ويب يتم إرساله إلى عنوان البريد الإلكتروني المقدم.إذا فشل Auto-Rickshaw في حل البنية باستخدام البنية الفرعية المحددة للتحقق من البنية الفرعية يمكن أن يساعد في حل البنية وإصلاحها. قم بتنزيل قائمة مواقع الذرات الثقيلة من صفحة نتائج Auto-Rickshaw. وهو ارتباط تشعبي يسمى مواقع الذرة الثقيلة.هذا سيتم تحميل ملف نصي مع مواقع ذرة الثقيلة. تغيير ملحق الملف من txt إلى pdb. افتح ملف pdb في Coot.بدوره على التماثل لرؤية جميع الذرات الثقيلة من وحدات غير المتماثلة المجاورة. قياس المسافات بين الذرات الثقيلة، بما في ذلك عبر وحدات غير متناظرة. I3C سوف تظهر على أنها مثلث متساوي الأضلاع مع طول الجانب من ستة angstroms.وجود مثلث مع هذه الأبعاد يشير إلى مواضع تلك الذرات الثقيلة صحيحة. إذا كان تشغيل Auto-Rickshaw غير صحيح، يمكن اختبار إعدادات Auto-Rickshaw الأخرى كما تمت مناقشتها في البروتوكول المكتوب. تم اختبار طريقة I3C RMMS على اثنين من البروتينات، بيض البيض الدحن lysozyme باستخدام شاشة في HT من هامبتون للبحوث ومجال بروتين أورف11 ليسين من bacteriophage P68.تم إعداد شاشات كاملة لكل بروتين الموافق لشاشة التحكم بدون I3C أو microseed ، الشاشة مع microseed المضافة ، الشاشة مع I3C ، وأخيرا الشاشة مع I3C و microseed. إضافة I3C إلى شاشة الكريستال لا يبدو لزيادة عدد الزيارات التبلور. مع بيض البيض lysozyme، انخفض عدد الشروط من 31 إلى 26.مع المجال Orf11 تم العثور على حالة إصابة واحدة في شاشة التحكم. إضافة I3C إلى الشاشة أعطى أيضا ضربة واحدة في نفس الظروف. إضافة microseed إلى البئر أدى إلى زيادة كبيرة في عدد حالات الإصابة مما أدى إلى زيادة 2.1 وستة أضعاف لبيضة البيض lysozyme وorf11 المجال على التوالي.هذه النتيجة متسقة مع دراسات أخرى اختبار RMMS. الأهم من ذلك ، إضافة I3C و microseed إلى الشاشة أيضا زيادة عدد حالات الاصابة بالنسبة لشاشة التحكم مما يدل على زيادة 2.3 وسبعة أضعاف بيض بيض البيض lysozyme والمجال Orf11 على التوالي. وهذا يدل على أن طريقة I3C RMMS يمكن أن تنتج بكفاءة ظروف جديدة للبلورات المشتقة.ويمكن حصاد بلورات من هذه الظروف واستخدامها في حل هيكل الكريستال. يمكن حل كل من هيكل بيضة البيض lysozyme Orf11 البيض النطاق مع SAD مراحل على خط أنابيب السيارات ريكشو، وذلك باستخدام إشارة شاذة من I3C مما يدل على اشتقاق ناجحة من قبل شاشة I3C RMMS. لقد قدمنا بروتوكول بسيط وفعال لإنتاج بلورات عالية الجودة مشتقة مع جزيء I3C مراحل.فإنه يقلل من عدد من الشاشات وخطوات التعامل مع البلورية، وبالتالي هو ذات أهمية خاصة لعلماء الأحياء الهيكلية دراسة البروتينات الجديدة. ونحن نوصي بشدة تحسين حجم الكريستال من خلال اختبار مختلف الأسهم البذور dilutions التي تم إجراؤها أثناء إعداد البذور الأسهم. ويتم الانتهاء من هذه الخطوة بعد شاشات الأولية قد تم القيام به.I3C متاح على نطاق واسع وانها غير مكلفة لشراء وهكذا نعتقد أن هذه الطريقة هي في متناول معظم مختبرات البيولوجيا الهيكلية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

الجريزوفولفوغرافيا من بلورات البروتين و<em&gt; في سيليولو</em&gt; الانعراج

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

تنامي البلورات البروتينية مع أبعاد متميزة باستخدام الآلي تبلور مقرونا في الموقع الحيوي تشتت الضوء

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

تقييم تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

فحص مثبطات كيناز في ميكروصفائف البروتين البشري المجمعة ذاتيا

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

الفحص الحركي للنشاط النواسي باستخدام مجسات الحمض النووي

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

إنشاء أنظمه تحديد البروتين المستحثة كيميائيا للغاية بواسطة الاختيار المتدرج لمكتبه الأجسام المضادة أحاديه المجال التوافقية

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

الفحص الاستراتيجي وتوصيف مجمع إشارات البروتين البصرية GPCR-mini-G للتبلور الناجح

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

تحسين نمو بلورات الإندوثيابسين لتجارب علم البلورات التسلسلي

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

التعبير البكتيري وتنقية ميتالوبروتيناز المصفوفة البشرية -3 باستخدام كروماتوغرافيا التقارب

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...