Name: derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening
Uploaded: 2021-01-16T15:00:00
Duration: 14 min 4 s
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这项研究是在澳大利亚同步加速器的MX1光束线上进行的，该光束是 ANSTO 的一部分。作者要感谢希温和布鲁宁实验室的成员，以讨论这项工作。作者还要感谢桑托什·潘吉卡尔博士和琳达·瓦亚特-希尔温博士，他们为开创这一协议的原创工作做出了贡献。
确认以下资金：澳大利亚研究理事会（赠款第1项）。DP150103009 和 DP160101450 到 Keith E. Shearwin）;阿德莱德大学（澳大利亚政府研究培训计划津贴奖学金给贾奎恩·冯和斯蒂芬妮·吴）。

1. 实验规划和考虑
<ol><li>使用预先存在的蛋白质的晶体，最好通过蒸汽扩散结晶产生。有关蒸汽扩散结晶的通用协议，请参见本韦努蒂和曼加尼34。其他结晶方法，如油下的微球和自由界面扩散，将需要在破碎前收获晶体以生成微种子。</li>
	<li>在准备种子库存时，使用可以牺牲的最高质量晶体。最高质量的晶体可以根据形态进行视觉判断，或者如果有这种数据，可以选择最好的衍射晶体。通过种子设定进行优化后，极有可能获得质量更好的晶体。在没有晶体的情况下，可以使用晶体沉淀物，如球状物和针头。</li>
	<li>识别盐晶体。盐晶体可以在结晶屏幕中生长，看起来像蛋白质晶体。在rMMS中使用盐晶体没有好处，会浪费宝贵的样品，因此消除盐误报非常重要。<ol>
<li>盐晶体被压碎时会大声喧哗。晶体必须粉碎产生种子库存，所以这个策略是特别相关的。如果粉碎晶体时听到可听见的裂纹声音，则晶体很可能是盐。</li>
		<li>如果蛋白质含有色氨酸和酪氨酸残留物，请使用紫外荧光显微镜识别在这些光照条件下荧光的蛋白质晶体。</li>
		<li>使用 Izit 染料（甲基蓝）将蛋白质晶体染色，使其与相对未染色的盐晶体区分开来。但是，此过程更具破坏性，仅建议在有晶体从相同掉落的复制中备用时。 注：虽然上述测试可能给出有希望的结果，但盐晶体仍可能被误认为是蛋白质晶体。在这种情况下，衍射实验可以用来明确辨别蛋白质和盐晶体。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 准备锂 I3C 库存
<ol><li>将120毫克的 I3C（5-氨基-2，4，6-三叶磷酸）检测成1.5 mL微离心管。</li>
	<li>在 200 μL 的 2 M 氢氧化锂中溶解 I3C。溶液可以在40-60°C下用热块轻轻加热，以鼓励溶解。由此产生的锂 I3C 溶液应为棕色，浓度为 1 M。 注意：氢氧化锂具有腐蚀性。应佩戴安全眼镜、手套和实验室外套。</li>
	<li>测量溶液的 pH 值。如有必要，加入少量1 M 盐酸或 2 M 氢氧化锂，将 pH 调节至 7 至 8 之间。加入毫Q水，使最终溶液体积达到400μL。I3C 库存溶液的浓度为 0.5 M。 注：步骤 2.3 是可选的。溶液的pH应在任何pH调整之前在pH 7-8之间。如果感兴趣的蛋白质受到pH的严重影响，应执行此步骤。可以在这里暂停协议。锂 I3C 可在黑暗中保持在 4 °C 至少两周35。</li>
</ol>3. 将 I3C 添加到蛋白质库存中
<ol><li>方法 1<ol>
<li>将库存锂 I3C 添加到目标蛋白的 150 μL 等分中。最终浓度应在5-40 mM锂 I3C 之间。</li>
	</ol>
</li>
	<li>方法 2（温和方法）<ol>
<li>准备与目标蛋白缓冲液匹配的蛋白质稀释缓冲液。在此稀释缓冲液中，添加库存锂 I3C，使锂 I3C 浓度在 10-80 mM 之间。</li>
		<li>用蛋白质稀释缓冲液稀释蛋白质1：1，使锂 I3C 的最终浓度在5-40 mM之间。 注：在方法1中，某些蛋白质在接触高浓度的锂 I3C 时会沉淀，而其他蛋白质可以耐受。方法2降低了降水的可能性。然而，这种方法使蛋白质浓度减半。对于没有既定结晶协议的蛋白质，通常建议蛋白质浓度为 10 mg/mL，用于初始结晶筛选。建议初始摩尔比为 I3C 与蛋白质 8。初始筛选后，可优化 I3C 与蛋白质的蛋白质浓度和摩尔比。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 制作种子库存
<ol><li>制作一个圆形探头，用于粉碎晶体。<ol>
<li>在蓝色火焰上安装一个邦森燃烧器，将巴斯德移液器加热到中间。使用钳子，将巴斯德移液器的末端拉出来，将其拉出小于 0.3 mm 的薄直径。</li>
		<li>一旦中段足够薄，请按住火焰中的该段，以此时分离移液器，并围绕移液器末端完成玻璃探头。 注：圆形探头晶体破碎机由第三方供应商销售。这些是制造圆角探测器的替代方法。</li>
	</ol>
</li>
	<li>将五根1.5 mL微离心管放在冰上。</li>
	<li>在光学显微镜下，检查结晶盘中是否适合产生微晶。理想情况下，选择良好的形态大晶体。然而，这种技术也适用于不良的形态晶体、针、板、微晶体和球状石。</li>
	<li>打开结晶盘。对于用塑料密封的 96 个井结晶托盘，使用手术刀切割密封井的塑料。对于用润滑脂密封的悬挂滴盘，可以使用钳子拆下盖玻片，并倒置到均匀的表面上。</li>
	<li>将 70 μL 储液液转移到微离心管中，并在冰上冷却。在其他微离心管上，加入90μL的储液罐溶液，并返回冰中冷却。 注：如果储油罐没有足够的体积或不存在（在油下的微料的情况下），则通过混合适当的试剂创建结晶储层。</li>
	<li>使用晶体探针将掉落中的晶体搅拌，彻底粉碎。晶体需要完全粉碎，可以在显微镜下监测。</li>
	<li>从落液中去除所有液体，然后用储液罐溶液将其转移到微离心管中。混合后从微离心管中混合并随后将2μL的混合物加入井中。用溶液冲洗井，然后转移到微离心管。再次重复此冲洗步骤。从这一点开始，保持微离心管的冷却，以避免熔化混合物中的微种子。</li>
	<li>以4°C的最高速度旋转管3分钟，定期停止在冰上冷却管子，防止过热。 注：一些微种子协议在微离心管中加入聚四氟乙烯种子珠，以帮助晶体破碎7，36。我们采用了这种技术，没有使用种子珠的成功，但看到没有问题，利用种子珠粉碎晶体。</li>
	<li>在冷却储液罐溶液之间按顺序传输 10 μL，对种子库存进行 10/1 的连续稀释。</li>
	<li>储存不会立即在 -80 °C 使用的种子库。</li>
</ol>5. 设置 rMMS 屏幕
<ol><li>使用液体点胶机器人设置 96 井筛板。在没有机器人的情况下，也可以使用多通道移液器。<ol>
<li>将 75 μL 从深井块转移到 96 井结晶盘。将 1 μL 添加到结晶滴中，在储液罐中加入 74 μL。</li>
		<li>将步骤2中补充的1 μL蛋白质与锂 I3C 一起转移到结晶滴中。</li>
		<li>将 0.1 μL 的种子库存转移到结晶下降。</li>
		<li>用清晰的密封胶带密封板，并在恒定温度下孵育板，使晶体生长。</li>
	</ol>
</li>
	<li>设置悬挂放置屏幕<ol>
<li>润滑悬垂滴井的边缘（悬挂滴结晶盘有 24 种和 48 种井格式）。</li>
		<li>将 500 μL 结晶溶液转移到储液罐中。</li>
		<li>在玻璃盖滑梯中心附近，放置一滴 1 μL 的蛋白质，辅以步骤 2 中的锂 I3C。</li>
		<li>将 1 μL 的结晶溶液添加到滴中。</li>
		<li>将 0.1 μL 的种子库存转移到结晶下降。</li>
		<li>将盖滑滑入润滑脂，反转盖滑轨并密封结晶井。</li>
		<li>在恒定温度下孵育板，使晶体生长。 注：使用新的和未经测试的种子库存，建议使用最集中的种子库存，以最大限度地提高获得结晶命中的机会。随后的条件可以设置与减少种子浓度，以优化晶体的数量。</li>
	</ol>
</li>
	<li>定期在显微镜下检查晶体托盘，以寻找晶体生长。如果晶体质量足够，可以采集用于数据收集。晶体还可用于生成新的种子库存和新的 rMMS 屏幕，以便进行迭代优化。</li>
</ol>6. 数据收集
<ol><li>使用低温循环收集晶体，保护晶体，并在液氮中闪冷晶体。有关闪光冷却晶体的其他信息，请参阅腾37和加曼和米切尔38。<ol>
<li>在低温保护阶段，如果晶体通过新的水溶液，I3C可能会因为进入低温保护溶液而从晶体中丢失。在低温保护溶液中以符合结晶条件的浓度使用锂 I3C，以减轻这种影响。</li>
		<li>使用该协议生长的晶体已成功使用 Parabar 10312 油基低温保护剂（汉普顿研究）进行低温保护。 注：当晶体储存在液氮中时，协议可以在这里暂停。 注意：液氮可导致冷灼伤。如果使用封闭空间，液氮也会导致窒息。</li>
	</ol>
</li>
	<li>将晶体安装在 X 射线源测角仪上，并使用特定于 X 射线源的协议收集衍射数据。</li>
	<li>该技术依赖于来自 I3C 中碘原子的异常信号。因此，选择X射线的能量以最大化此信号。<ol>
<li>将同步加速器 X 射线源设置为尽可能低的可调能量。对于许多大分子晶体学光束线，最低可配置能量为 8000 至 8500 eV。</li>
		<li>无法调整旋转的阳极 X 射线源。常用的铜阳极源在 8046 eV 时具有 K+ 边缘，这为碘（f" = 6.9 e）提供了良好的异常信号。具有铬的阳极源在 5415 eV 时具有 K+ 边缘，这为碘（f" = 12.6 e）提供了较大的异常信号。</li>
	</ol>
</li>
	<li>辐射损伤是数据收集过程中的一个严重问题，因为它会降低异常信号39。选择光束的曝光时间和衰减，以达到最佳衍射，同时最大限度地减少辐射剂量。 注：在用溴原子取代碘原子的类似相位化合物中，辐射损伤已证明会导致碳溴键的放射性解射，并减少溴原子的占有率24。<ol>
<li>使用反向光束SSSSSSS数据收集作为收集策略。数据以楔块收集，彼此之间收集相反的楔形。这允许以等量剂量收集 Friedel 对，从而改进了对受辐射损伤影响较小异常信号的测量。例如， 收集 360° 的八楔形策略涉及按楔形 1 （0°-45°）、楔形 2 （180°-225°）、楔形 3 （46°-90°）、楔形 4 （225°）的顺序收集数据 270°）、楔形5（90°-135°）、楔形6（270°-315°）、楔块7（135°-180°）和楔块8（315°-360°）。 注：连续旋转是反向光束数据收集的替代收集策略。有关收集策略的最近比较，请参阅 Garcie-Bonte & Katona40。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 数据处理和结构解决方案
<ol><li>使用XS41对衍射数据执行数据缩减，以最大化异常信号。数据缩减输入参数特定于数据集，可能需要一些试验和错误。下面是一些建议开始。<ol>
<li>设置弗里德尔的法律-错误。执行更正两次，STRICT_ABSORPTION_CORRECT = true 和 STRICT_ABSORPTION_CORRECT = False。一次运行可以具有比另一个更高的异常信号。比较输出中使用"肛门 Corr"和"SigAno"学科的运行之间的异常信号。这提供了数据质量指示器。</li>
		<li>在 1100 万次运行 XDS_ASCII shelxc。HKL 文件，用于更准确地指示异常信号。"Ranom"纪律将给出不同分辨率的异常信号的指示。</li>
	</ol></li>
	<li>运行无意义的 42 和无目的43 来扩展数据。在无目的中，设置参数 ANOMALOUS。如果使用 GUI，请选择"分离 异常对"选项，以进行异常拒绝和合并统计信息。可能需要测试不同的分辨率截止，以最大化异常信号。</li>
	<li>使用自动里克肖自动晶体结构测定管道44解决蛋白质结构。Auto-Rickshaw将尝试通过蛋白质建模和优化软件，尝试解决相位问题，并自动构建蛋白质的晶体结构。<ol>
<li>对于没有同源模型模板的蛋白质，在高级模式下运行自动里克肖的S一S SAD协议。输入所需的参数。<ol>
<li>选择蛋白质作为分子类型。</li>
			<li>输入以焦虑 （+） 表示的数据收集波长。</li>
			<li>选择"I"作为子结构元素，以指示使用了碘原子。</li>
			<li>选择"i3c"作为子结构类型，以指示 I3C 是相位分子。</li>
			<li>选择"sub_direct"作为子结构确定方法。此方法使用 SHELXD32 来搜索子结构。</li>
			<li>选择"3"作为每个单体的预期下部结构数。</li>
			<li>输入"1"作为子结构搜索的分辨率截止。这允许自动里克肖自动确定合适的分辨率截止。</li>
			<li>输入单个单体中的残渣数、数据集的空间组以及基于 Matthews 系数的不对称单元中的分子数。</li>
			<li>选择适合需要的X射线数据的适当传播级别。选择"自动里克肖开发人员"将允许自动里克肖开发人员在出现问题时对运行进行故障排除。</li>
			<li>将异常数据输入为 mtz 文件。</li>
			<li>输入蛋白质序列作为 seq、pir 或 txt 文件。可以在文本编辑器中生成 seq 文件（例如 Windows 上的 Notepad+9 或 Linux 中的 nano）。创建一个新文件，将蛋白质的主要序列输入为一条长线或用换行符分隔。使用 .seq 文件扩展名保存文件。</li>
			<li>输入机构电子邮件地址。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>结果通过发送到提供的电子邮件地址的 Web 链接传递。 注：AutoRickshaw是一个自动化管道，调用各种晶体软件包来解决X射线晶体结构32，33，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58。如果自动里克肖运行无法解决结构，可以测试其他自动里克肖设置。结构确定方法可以更改为"sub_phassade"，以使用相位器59而不是S后XD 32。每个单体的预期下部结构数也可以增加或减少。</li>
	<li>在晶体结构的实验阶段，自动里克肖将尝试在单元细胞中放置重原子，从而形成一个子结构。I3C中碘原子的等边三角形排列为验证下部结构提供了一种有效的方法。如果步骤 6.3 失败，验证子结构有助于对结构解决方案进行故障排除。<ol>
<li>从自动里克肖结果页面下载重原子网站列表。这是一个超链接，称为"重原子站点"。这将下载一个文本文件与重原子网站。</li>
		<li>将文件的文件扩展名从.txt更改为.pdb。</li>
		<li>打开库特60中的 PDB 文件。打开对称性，查看来自相邻非对称单位的其他重原子。</li>
		<li>测量重原子之间的距离，包括非对称单位之间的距离。I3C 将显示为等边三角形，侧长为 6 个焦虑。具有这些尺寸的三角形的存在表示这些重原子的位置是正确的。</li>
	</ol></li>
</ol>

作者没有什么可透露的。

在缺乏合适的分子替代同源模型的情况下，新蛋白质的结构测定需要实验阶段。这些方法要求将重原子加入蛋白质晶体，这增加了结构确定管道的复杂性，并可能引入许多必须解决的障碍。重原子可以通过贴标签的表达直接加入到蛋白质中，使用塞洛内托奥氨酸和塞列诺半胱氨酸。由于这种方法成本高昂，费力，并可能导致蛋白质产量降低，标记蛋白往往在结晶条件被发现后表达，并优化与未标记的蛋白质。或者，晶体可以通过浸泡在含有重原子22、63、64的溶液中来衍生。这种方法通常使用高质量的晶体，因此在开发出坚固的结晶方法后进行。使用这种方法成功获得衍生晶体需要进一步优化浸泡过程和筛选不同的相位化合物，从而为本已费力的过程增加更多时间。
蛋白质与重原子的共结晶可以在筛选阶段进行，从而有效地简化过程，减少可能导致损害的晶体操作步骤。然而，仍然存在获得很少初始结晶命中的潜在情况和选择兼容重原子化合物的问题。目前许多可用的相位化合物与结晶条件下常见的沉淀剂、缓冲剂和添加剂不相容。它们可能不溶于硫酸盐和磷酸盐缓冲液，切酸盐为柠檬酸盐和醋酸盐，与 HEPES 和 Tris 缓冲液发生不利反应，或被 DTT 和 β-二甲苯二甲醇21封存。由于 I3C 相位化合物不受到这些不兼容的影响，因此它是一种可承受许多不同条件的坚固相位化合物。
本研究提出了一种简化的方法，通过同时共结晶 I3C 相相化合物和 rMMS，生产为SAT阶段准备的衍生晶体。两种技术的结合增加了结晶命中的数量，许多条件具有改进的形态和衍射特性。在 Orf11 NTD 和 HEWL 测试用例中，识别了 I3C-rMMS 屏幕中不存在的 I3C-rMMS 新条件。I3C可能与蛋白质结合，促进晶体接触物的形成和稳定。反过来，这可能诱发结晶，并可能改善衍射特性。I3C 除了是一种与稀疏矩阵屏幕兼容的化合物外，由于其内在特性，也是一种极具吸引力的相位化合物。在芳香环支架上与碘交替的功能组允许与蛋白质进行特定的结合。这导致更大的占用率，并可能减少背景信号23。此外，在等边三角形中异常散射器的排列在子结构中是显而易见的，可用于快速验证 I3C 的绑定（图 4B 和 4C）。最后，它会产生一个异常信号与可调同步辐射，以及铬和铜旋转阳极X射线源。因此，它可以应用于许多不同的工作流。由于 I3C 广泛可用且购买成本低廉，因此大多数结构生物学实验室都能够采用这种方法。
使用 I3C-rMMS 方法时，必须解决几个实验性注意事项。如果无法获得蛋白质的初始晶体材料，则无法应用此方法。在困难的情况下，来自同源蛋白的晶体材料也可用于生成种子。这种对rMMS的交叉播种方法已经显示出一些有希望的结果7。通过稀释种子库存来优化晶体数量是一个不容忽视的关键步骤，它应最大限度地增加生产高质量大晶体和获得适当衍射数据的机会。如果在非对称单元中识别的 I3C 站点很少，则应通过增加 I3C 浓度进一步优化有利于结晶的条件。这可能增加 I3C 的占用率，以最大化异常信号和辅助晶体衍生。
在有些情况下，这种技术可能不是推导蛋白质晶体的最佳方法。随着蛋白质或蛋白质复合体大小的增加，蛋白质表面的 I3C 位点数量有限可能无法提供足够的相位能力来解决结构问题。在这些蛋白质大小被怀疑阻碍相位的情况下，蛋白质的三元氨酸标签可能是一种更可行的方法来分阶段使用蛋白质。如果蛋白质中含有足够数量的蛋氨酸残留物（建议每100个残留物至少有一个蛋氨酸65），并且可以实现将高效塞洛非西翁氨酸并入蛋白质（如在细菌表达系统66中），晶体中将存在多个高占用性钚原子，以相位结构。
此外，一些蛋白质可能本质上不适合与 I3C 的衍生。I3C结合点对蛋白质取决于蛋白质结构。可能存在与 I3C 结合相容的蛋白质， 自然很少暴露的补丁。因此，与 I3C 共同结晶某些目标蛋白并非不可想象。

在结构生物学领域，X射线晶体学是确定大分子原子分辨率结构的黄金标准技术。广泛运用了解疾病的分子基础，指导合理的药物设计项目，阐明酶1、2的催化机理。虽然结构数据提供了丰富的知识，但蛋白质表达和纯化、结晶和结构测定的过程可能非常费力。通常遇到几个瓶颈，阻碍这些项目的进展，必须解决这些瓶颈，以便有效地简化晶体结构确定管道。
在重组表达和纯化之后，必须确定有利于结晶的初步条件，这通常是X射线晶体学的一个艰苦而耗时的方面。商业稀疏矩阵屏幕，整合已知和已发布的条件已经开发，以缓解这一瓶颈3，4。然而，如果使用高度纯净和浓缩的蛋白质样本，但这些初始屏幕的点击率很少。观察透明滴表明蛋白质可能没有达到晶体成核所需的过饱和水平。为了鼓励晶体成核和生长，从预先存在的晶体生产的种子可以添加到条件，这允许增加采样的结晶空间。伊雷顿和斯托达德首先介绍了微种子基质筛选方法5。质量差的晶体被粉碎，使种子库存，然后系统地添加到含有不同盐的结晶条件，以产生新的衍射质量晶体，否则不会形成。D'Arcy等人开发了随机微种子基质筛选（rMMS），将种子引入备用基质结晶屏6、7。这提高了晶体的质量，使结晶次数平均增加了7倍。
晶体成功产生并获得X射线衍射模式后，又遇到了解决"相位问题"的另一个瓶颈。在数据采集过程中，记录衍射强度（与振幅的平方成正比），但相位信息丢失，导致阶段问题，停止立即的结构确定8。如果目标蛋白与具有先前确定结构的蛋白质共享高序列标识，分子替代可用于估计相位信息9、10、11、12。虽然此方法快速且价格低廉，但模型结构可能不可用或不合适。当序列识别低于35%13时，基于同源模型的分子替换方法的成功显著下降。在没有合适的同源模型的情况下，可以测试AB initi方法，如ARCIMBOLDO14、15和MM16。这些方法使用计算预测模型或片段作为分子替换的起点。AMPLE 以预测诱饵模型为起点，努力解决以纸张为主的大（>100 残留物）蛋白质和蛋白质的结构β以表。ARCIMBOLDO 试图将小片段安装到更大的结构中，它仅限于高分辨率数据（≤2 3）和算法将片段扩展到完整结构的能力。
如果分子替换方法失败，则必须使用直接方法，如同构替换17、18和单波长（SAD19）或多个波长（MAD20）的异常散射。对于真正新颖的结构来说，情况往往如此，在这种结构中，晶体必须形成或用重原子进行衍生。这可以通过浸泡或与重原子化合物、化学修饰（如RNA中加入5-Bromouracil）或标记蛋白表达（如将分离异氨酸或塞洛细胞泰因氨基酸纳入初级结构）实现）21，22。这进一步使结晶过程复杂化，并需要额外的筛选和优化。
一类新型相位化合物，包括 I3C（5-氨基-2，4，6-三叶磷酸）和B3C（5-氨基-2，4，6-三叶磷酸），提供令人兴奋的优势，比预先存在的相位化合物23，24，25。I3C 和 B3C 均采用芳香环支架，具有直接相位方法所需的异常散射和氨基酸或碳酸盐功能组所需的异常散射的交替排列，这些功能群与蛋白质特别相互作用并提供结合位点特异性。重金属组随后的等边三角排列可以简化相相子结构的验证。在编写本文时，蛋白质数据库（PDB）有26个与C3C绑定的结构，其中20个使用SS一阶段26得到解决。
该协议通过结合重金属衍生和rMMS筛选方法，同时增加结晶命中次数，简化晶体衍生工艺，提高了结构测定管道的功效。我们证明这种方法是非常有效的母鸡蛋清利索酶和一个新的利辛蛋白领域从噬菌体P6827。介绍了使用高度自动化的自动里克肖结构确定管道的结构解决方案，专为 I3C 相位化合物量身定制。有其他自动化管道，可以使用，如AutoSol28，ELVES29和克兰克230。非全自动包装，如SELXC/D/E也可用于31，32，33。这种方法通过显著减少筛选和优化步骤的数量，对研究PDB中缺乏同源模型的蛋白质的研究人员特别有益。这种方法的先决条件是蛋白质晶体或目标蛋白质的结晶沉淀物，从以前的结晶试验中获得。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL disposable luer lock syringes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>T3SS10LAT</td>
			<td>Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used for hanging drop crystal tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-506</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22178</td>
			<td>Commonly referred to as I3C in the article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-297</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18X18-2</td>
			<td>Coverslips for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning vacuum grease</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-510</td>
			<td>Used for sealing hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette 0.1 &#956;L-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 2 &#956;L-20 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1153247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 20 &#956;L-200 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1152006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>HIR92601.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Approximately 95% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IndexHT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope illuminator</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>FT192/230</td>
			<td>Light source to illuminate crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/ION HT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Liquid Dispenser</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel with scalpel blade no. 15</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>LV-SMSCPO15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope&#160;</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>EMZ-5TR</td>
			<td>Microscope for visualising crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>RAVM1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening

使用X射线晶体学的蛋白质结构阐明既需要高质量的衍射晶体，也需要衍射相问题的计算解决方案。缺乏合适同源模型的新结构往往被重原子推导，以提供实验阶段信息。该方案通过将随机微种子基质筛选与衍生物结合重原子分子 I3C（5-氨基-2，4，6-三叶磷酸），有效地生成衍生蛋白晶体。通过将 I3C 融入晶体晶格，可以使用单波长异常分散 （SAD） 相位有效解决衍射相问题。I3C 中碘原子的等边三角形排列允许快速验证正确的异常子结构。该协议将有用的结构生物学家谁解决大分子结构使用晶体学为基础的技术，有兴趣在实验阶段。

将 I3C 融入 rMMS 可产生支持衍生晶体生长的新条件 同时 rMMS 筛查和 I3C 衍生的功效在两种蛋白质中得到证明，即母鸡蛋清乳酶（HEWL，作为冻干粉末获得）和来自噬菌体 P68 的假药 Orf11 lysin N-终端域 （Orf11 NTD）。每种蛋白质在四种不同的条件下对PEG/ION HT进行筛选，包括：非种子、种子、非种子与 I3C 和 I3C 播种（图1）。对于这两种蛋白质，唯一添加的 I3C 不会增加有利于结晶的条件的数量。在 Orf11 NTD 中，只有一个合适的条件被识别为 I3C 和没有I3C（图 1B）。将 I3C 添加到 HEWL 屏幕时，点击次数从 31 次减少到 26 次，凸显了在引入相位化合物时晶体化的复杂性（图 1A）。与其他研究一致，在商业稀疏基质屏幕中添加种子以生成 rMMS 屏幕显著增加两种蛋白质的可能结晶条件数量，导致 HEWL 和 Orf11 NTD 分别增加 2.1 倍和6 倍（图1）。最重要的是，同时添加 I3C 和种子会增加相对于非种子屏幕的点击次数，表明 HEWL 和 Orf11 NTD 的点击次数分别增加了 2.3 倍和 7 倍。在 I3C 存在的情况下，来自 rMMS 的许多晶体都表现出出色的晶体形态（图 2）。
播种允许仔细控制 I3C rMMS 屏幕中的晶体编号 在微种子实验中，进入结晶试验的种子数量可以通过稀释种子存量来控制，这允许在下降7，36中精确控制成核。这通常允许更大的晶体形成，因为蛋白质分子在成核点的竞争减少。这一优势还延伸到 I3C-rMMS 方法，并在 HEWL 和 Orf11 NTD 中均得到成功证明。用稀释的种子存量从 I3C-rMMS 屏幕中识别出的结晶条件的重新生成较少但较大的晶体（图 3）。
SAD 相位可用于解决从 rMMS I3C 屏幕派生的晶体结构 使用图3所示的稀释种子存量生长的晶体使用来自单个晶体的衍射数据使用 SAD 相位求解蛋白质的结构（图 4）。数据收集于澳大利亚同步加速器MX1光束线62。详细的数据收集和结构解决方案细节描述其他地方27。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig01.jpg"> 图1 - rMMS用于在存在两种测试蛋白的 I3C 的情况下为晶体生长生成新条件。使用商业稀疏基质网对96个井蒸汽扩散结晶屏进行了处理。（A） 用指数HT屏幕测试了母鸡蛋清的利酶。托盘的种子与 HEWL 晶体生长在 0.2 M 铵酸酯二基 pH 7.0， 20% （w/v） 聚乙二醇 3350.（B） 用PEG/ION屏幕测试了细菌P68中的 Orf11NTD。Orf11 NTD 托盘由非种子屏幕 G12 条件的晶体播种，以蓝色显示。支持晶体生长的条件显示为红色。rMMS 种子在 I3C 的存在和不存在都给更多的水晶命中比非种子托盘。图改编自Truong等人27。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig02.jpg"> 图2 - 图1（a）和（b）所示的蒸汽扩散试验中生长的晶体的代表性图像。图改编自Truong等人27。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig03.jpg"> 图3 - 种子库存的稀释是使用 I3C-rMMS 方法在结晶条件下减少核化的有效方法，用于控制形成晶体的数量。减少一滴内的成核通常会导致晶体长到更大的尺寸。图改编自Truong等人27。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig04.jpg"> 图 4 - Orf11 NTD （PDB ID 6O43） 和 HEWL （PDB ID 6PBB） 使用 I3C-rMMS 方法结晶，并使用自动里克肖 SAD 阶段解决。（A） HEWL 和 Orf11 NTD 的带状结构通过实验阶段解决。（B） I3C分子结合到 HEWL 和 Orf11NTD.（C） I3C 中的异常碘原子排列在 6 + 的等边三角形中。因此，这个三角形在相位子结构中的存在表明该位置有一个 I3C 分子。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61984fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>

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Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

本文提出了一种利用微种子在稀疏基质晶波中产生与 I3C（5-氨基-2，4，6-三叶磷酸）衍生的蛋白质晶体的方法。托盘可以使用液体点胶机器人或手动设置。

使用随机微种子基质筛选与 I3C 的蛋白质晶体的衍生

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

这是一个结晶协议，旨在优化蛋白质晶体的生长，同时通过相位分子推导蛋白质，通过X射线晶体学确定蛋白质的结构。为了确定一种完全新颖的蛋白质的X射线晶体结构，优化了结晶条件，以产生高质量的晶体。在完全新颖的蛋白质的情况下，重原子需要被引入晶体中，以产生衍生晶体。X射线衍射数据是从衍生晶体中收集的，必须计算解决才能产生X射线晶体结构。结晶和推导都是费力的过程。为了解决这些瓶颈，我们设计了一个优化的筛选程序，同时实现这两个目标。该协议使用以前开发的技术称为随机微种子矩阵筛选。晶体或晶体沉淀物被粉碎成微种子，可用于在完全独立的条件下开始晶体生长。同时，我们在结晶条件下引入一种称为 I3C 的相位分子。该分子提供大异常信号，允许通过单波长异常讨论阶段解决结构。对于不熟悉晶体结构实验尺寸的用户，我们提出了一个用户友好的软件管道，用于部分自动化结构解决方案，以定制它，以使用来自 I3C 的异常信号。第一步是创建 I3C 股票。将120毫克的 I3C 测量到微离心管中。在微离心管中加入200微升两个氢氧化锂。将管子加热40至60度，涡旋可用于鼓励溶解。锂 I3C 溶液的摩尔库存应该是棕色的。可以使用两种方法将 I3C 引入蛋白质存量。锂 I3C 可以直接添加到蛋白质库存中。3.75 微升至 30 微升 I3C 可添加到 150 微升蛋白质中，使浓度介于 5 至 14 毫摩尔之间。某些蛋白质在接触高浓度的 I3C 时会沉淀。在这些情况下，锂 I3C 可以添加到蛋白质稀释缓冲液中，该缓冲液将样品蛋白与最终浓度匹配为 10 至 80 毫摩尔。在150微升蛋白质样品中加入150微升蛋白质稀释缓冲液。玻璃探头粉碎晶体是由玻璃巴斯德移液器。蓝色火焰上有一个邦森燃烧器，将巴斯德移液器加热到中间。使用一对钳子，将巴斯德移液器的末端拉出，其直径小于 0.3 毫米。此时，握住火焰中的该段以分离移液器，并围绕移液器的末端完成玻璃探头。这是玻璃移液器的外观示例。晶体粉碎也可以从第三方供应商订购，作为制造自己的微型种子库存的替代方案，通过粉碎蛋白质晶体或晶体沉淀物产生。将五根1.5 mL微离心管放在冰上。在光学显微镜下，选择可以牺牲的最佳形态晶体或晶体沉淀物。对于 96 个井结晶托盘，通过切割塑料密封胶带打开井。对于悬挂拖放盘，可以使用钳子拆下盖滑，并倒置到平坦的表面上。将 70 微升储液转移到其中一个微离心管中，并在冰上冷却。对于剩余的管子，将90微升的储层溶液转移到其中，然后返回冰面冷却。如果储液罐体积不足，可以通过混合适当的试剂进行结晶储液，并可代替使用。使用玻璃探针将结晶滴中的晶体彻底压碎。在显微镜下可以监测进度，直到看不到晶体或晶体材料。将所有液体从落液转移到含有 70 微升储液液的微离心管中。通过上下移液混合。将两到三微升的混合物移回井中，然后上下移液冲洗井。将混合物转移回微离心管。此冲洗步骤应再次重复。微离心管应保持冷，从这一点向前，以避免融化的微种子。以四度的最高速度旋转管子，约三分钟，定期在冰上冷却管子，以防止过热。在冷却储层溶液之间按顺序传输 10 微升，对种子库存进行 10 次连续稀释。种子库存稀释之间，管应涡流。不会立即使用的种子库存，应存放在零下80度的超冷冰柜中。可以使用液体点胶机器人设置 96 井随机微种子矩阵屏幕。将种子库、蛋白质储存溶液与 I3C 和结晶屏一起放在机器人中。使用机器人将 75 微升从结晶屏幕转移到 96 井盘。在结晶滴中加入一微升，在储液罐中加入 74 微升。将一微升蛋白质与 I3C 补充转移到结晶滴中。将0.1微升的种子存量转移到结晶下降。使用密封胶带密封板。悬挂滴网可设置在 24 个井挂滴结晶托盘中。润滑悬挂落井的边缘。将 500 微升结晶溶液转移到储液罐中。在玻璃盖幻灯片的中心附近放置一滴微升结晶溶液。在此下降，添加一微升蛋白质辅以锂 I3C 和 0.1 微升的种子库存。将盖滑滑入润滑脂，反转盖滑轨并密封结晶井。悬挂滴和密封滴盘在恒定温度下孵育，使晶体形成。应定期在显微镜下检查晶体生长情况。在获得衍射数据后，如随同的书面协议所述，可采用自动-里克肖自动晶体结构测定管道解决相位问题并建模蛋白质。在自动里克肖着陆页，单击"继续"按钮。在自动里克肖 Web 表单中输入您的机构电子邮件，然后单击继续运行自动里克肖。对于没有同源本模板的蛋白质，在高级模式下运行自动里克肖的S一S SAD协议。输入所需的参数。选择蛋白质作为分子类型。输入以焦虑的表示输入数据收集波长。所以像我作为子结构元素来表示碘原子被使用。选择 I3C 子结构类型以指示 I3C 是相位分子。选择sub_direct作为子结构确定方法。选择三个作为每个单体的预期子结构数。输入一个作为子结构搜索的预留截止。这允许自动里克肖自动确定合适的分辨率截止。输入基于马修斯系数的单体、数据集空间组中的残渣数和非对称单元中的分子数。选择适合您需求的 X 射线数据的适当传播级别。将异常数据输入为空集文件。输入您的蛋白质序列作为SEQ，PIR或TXT文件。输入您的机构电子邮件地址。结果通过发送到提供的电子邮件地址的 Web 链接发送给您。如果 Auto-Rickshaw 未能使用其确定的子结构验证子结构来解决结构问题，则有助于对结构解决方案进行故障排除。从自动里克肖结果页面下载重原子网站列表。它是一个称为重原子位的超链接。这将下载一个文本文件与重原子网站。将文件的文件扩展名从 txt 更改为 pdb。打开库特中的 pdb 文件。打开对称性以查看来自相邻非对称单位的所有重原子。测量重原子之间的距离，包括非对称单位之间的距离。I3C 将显示为等边三角形，侧长为 6 个焦虑。具有这些尺寸的三角形的存在表示这些重原子的位置是正确的。如果自动里克肖运行子结构不正确，可以测试其他自动里克肖设置，如书面协议中讨论。I3C RMMS 方法在两种蛋白质上进行了测试，即使用汉普顿研究的 HT 屏幕和来自噬菌体 P68 的 Orf11 lysin 蛋白质领域对母鸡蛋清lysozyme进行测试。为与控制屏幕对应的每个蛋白质设置了全屏，无需 I3C 或微种子，屏幕添加微种子，屏幕与 I3C，最后屏幕与 I3C 和微种子。将 I3C 添加到水晶屏幕似乎不会增加结晶命中次数。与母鸡蛋清的利索酶，条件从31个下降到26。使用 Orf11 域，在控制屏幕中发现单个命中条件。将 I3C 添加到屏幕也会在相同条件下进行一次点击。向井中添加微籽导致命中条件显著增加，导致母鸡蛋清酶和 Orf11 域分别增加了 2.1 倍和 6 倍。此结果与其他测试 RMMS 的研究一致。最重要的是，将 I3C 和微籽添加到屏幕也增加了与控制屏幕相比的命中条件数，分别显示母鸡蛋清酶和 Orf11 域的 2.3 倍和 7 倍。这表明，I3C RMMS方法可以有效地为衍生晶体产生新的条件。这些条件下的晶体可以收获并用于解决晶体结构问题。母鸡蛋清Lysozyme Orf11域的结构可以通过SS一级在自动里克肖管道上解决，使用来自C3C的异常信号，证明通过 I3C RMMS 屏幕成功派生。我们提出了一个简单而高效的协议，用于生产与相位分子 I3C 相化的高质量晶体。它最大限度地减少了屏幕数量和晶体处理步骤，因此对研究新型蛋白质的结构生物学家特别感兴趣。我们强烈建议通过测试种子库存制备期间进行的不同种子库存稀释来优化晶体尺寸。此步骤在初始屏幕完成后完成。I3C 是广泛可用的，它购买成本低廉，因此我们相信这种方法是大多数结构生物学实验室触手可及的。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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蛋白晶体的微结晶和<em&gt;在Cellulo</em&gt;衍射

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科研

生物化学

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