Name: derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening
Uploaded: 2021-01-16T15:00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Dit onderzoek werd uitgevoerd op de MX1 beamline op het Australische Synchrotron, onderdeel van ANSTO. De auteurs willen de leden van de laboratoria Shearwin en Bruning erkennen voor discussies over dit werk. De auteurs willen ook dr. Santosh Panjikar en Dr. Linda Whyatt-Shearwin erkennen die tot het originele werk hebben bijgedragen dat dit protocol pionierde.
De volgende financiering wordt erkend: Australian Research Council (grant Nos. DP150103009 en DP160101450 aan Keith E. Shearwin); Universiteit van Adelaide (Australian Government Research Training Program stipendium beurs voor Jia Quyen Truong en Stephanie Nguyen).

1. Experimentele planning en overwegingen
<ol><li>Gebruik reeds bestaande kristallen van het eiwit van belang, bij voorkeur gegenereerd door dampdiffusie kristallisatie. Voor een algemeen protocol van damp diffusie kristallisatie, zie Benvenuti en Mangani34. Andere methoden van kristallisatie, zoals microbatch onder olie en vrije interface diffusie zal het oogsten van de kristallen voorafgaand aan het breken om microzaden te genereren.</li>
	<li>Gebruik bij de bereiding van een zaadvoorraad kristallen van de hoogste kwaliteit die kunnen worden opgeofferd. Het kristal van de hoogste kwaliteit kan visueel worden beoordeeld op basis van morfologie of het beste diffracting kristal kan worden geselecteerd, als dergelijke gegevens beschikbaar zijn. Het is zeer waarschijnlijk dat nog betere kwaliteit kristallen worden verkregen na optimalisatie door zaaien. In het geval dat er geen kristallen beschikbaar zijn, kan kristallijn neerslag zoals spherulites en naalden worden gebruikt.</li>
	<li>Identificeer zoutkristallen. Zoutkristallen kunnen groeien in kristallisatieschermen en kunnen eruit zien als eiwitkristallen. Het gebruik van zoutkristallen in rMMS zal geen voordeel bieden en kostbare monsters verspillen, dus het is belangrijk om zoutalwaartesen te elimineren.<ol>
<li>Zoutkristallen zijn luid wanneer ze worden verpletterd. Kristallen moeten worden verpletterd om een zaadvoorraad te genereren, dus deze strategie is bijzonder relevant. Als een hoorbaar scheurgeluid wordt gehoord bij het verpletteren van de kristallen, is het kristal waarschijnlijk zout.</li>
		<li>Als het eiwit tryptofaan en tyrosineresiduen bevat, gebruikt u ultraviolette fluorescentiemicroscopie om eiwitkristallen te identificeren die onder deze lichtomstandigheden fluoresceren.</li>
		<li>Gebruik Izit kleurstof (methyleen blauw) om eiwitkristallen te vlekken om ze te onderscheiden van zoutkristallen die relatief onbevlekt blijven. Echter, deze procedure is meer destructief en wordt alleen aanbevolen als men kristallen te sparen van replica's van dezelfde daling. OPMERKING: Hoewel de bovengenoemde tests veelbelovende resultaten kunnen opleveren, kunnen zoutkristallen nog steeds worden verward met eiwitkristallen. In dit geval kunnen diffractie-experimenten worden gebruikt om definitief onderscheid te maken tussen een eiwit- en zoutkristal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bereiding van lithium I3C-voorraad
<ol><li>Meet 120 mg I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid) in een 1,5 mL microcentrifuge buis.</li>
	<li>Los I3C op in 200 μL van 2 M lithiumhydroxide. De oplossing kan voorzichtig worden verwarmd met behulp van een warmteblok bij 40-60 °C om ontbinding te stimuleren. De resulterende lithium I3C-oplossing moet bruin zijn en een concentratie van 1 M hebben. LET OP: Lithiumhydroxide is corrosief. Veiligheidsbrillen, handschoenen en een labjas moeten worden gedragen.</li>
	<li>Meet de pH van de oplossing. Voeg indien nodig kleine hoeveelheden zoutzuur van 1 M of 2 M lithiumhydroxide toe om de pH aan te passen aan tussen 7 en 8. Voeg milliQ water toe om het uiteindelijke oplossingsvolume op 400 μL te maken. De concentratie van de I3C-voorraadoplossing is 0,5 M. LET OP: Stap 2.3 is optioneel. De pH van de oplossing moet tussen pH 7-8 liggen voordat een pH-aanpassing wordt toegepast. Deze stap moet worden uitgevoerd als het eiwit van belang sterk wordt beïnvloed door de pH. Het protocol kan hier worden onderbroken. Lithium I3C kan ten minste twee weken in het donker op 4 °C wordenbewaard.</li>
</ol>3. Toevoeging van I3C aan de eiwitvoorraad
<ol><li>Methode 1<ol>
<li>Voeg bouillon lithium I3C toe aan een 150 μL aliquot van het doeleiwit. De uiteindelijke concentratie moet tussen 5-40 mM lithium I3C liggen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Methode 2 (zachtere methode)<ol>
<li>Bereid een eiwitverdunningsbuffer die overeenkomt met de buffer van het doeleiwit. Voeg aan deze verdunningsbuffer de voorraad lithium I3C toe om een concentratie lithium I3C tussen 10-80 mM te geven.</li>
		<li>Verdun het eiwit 1:1 met eiwitverdunningsbuffer om een uiteindelijke concentratie van lithium I3C tussen 5-40 mM te geven. OPMERKING: Sommige eiwitten zullen neerslaan bij het in contact komen met hoge concentraties lithium I3C in methode 1, terwijl andere eiwitten het kunnen verdragen. Methode 2 vermindert de kans op neerslag. Deze methode halveert echter de eiwitconcentratie. Voor eiwitten die geen vastgesteld kristallisatieprotocol hebben, wordt over het algemeen een eiwitconcentratie van 10 mg/mL aanbevolen voor de eerste kristallisatiescreening. Een initiële kiesverhouding van I3C tot eiwit van 8 wordt aanbevolen. Eiwitconcentratie en molaire verhouding van I3C tot eiwit kunnen worden geoptimaliseerd na het eerste scherm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Het maken van een zaadvoorraad
<ol><li>Maak een afgeronde sonde voor het verpletteren van kristallen.<ol>
<li>Met een Bunsen brander op de blauwe vlam, verwarm een Pasteur pipet naar het midden. Trek met een pincet aan het uiteinde van de Pasteur-pipet om deze in een dunne diameter van minder dan 0,3 mm te trekken.</li>
		<li>Zodra de buik dun genoeg is, houd dat segment in de vlam om de pipet te scheiden op dit punt en rond het einde van de pipet om de glassonde af te maken. OPMERKING: Afgeronde sonde kristalbrekers worden verkocht door externe leveranciers. Deze zijn een alternatief voor het maken van afgeronde sondes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats vijf microcentrifugebuizen van 1,5 mL op ijs.</li>
	<li>Onder een lichtmicroscoop, onderzoek de kristallisatie lade voor een geschikte voorwaarde om microkristallen te genereren. Idealiter worden goede morfologie grote kristallen geselecteerd. Deze techniek werkt echter ook met slechte morfologiekristallen, naalden, platen, microkristallen en sferulieten.</li>
	<li>Open de kristallisatie lade goed. Voor 96 goed kristallisatie trays verzegeld met plastic, gebruik een scalpel om de plastic afdichting van de put te snijden. Voor hangende drop trays verzegeld met vet, kan de coverslip worden verwijderd met een pincet en omgekeerd op een gelijkmatig oppervlak.</li>
	<li>Breng 70 μL reservoiroplossing over naar een microcentrifugebuis en koel deze op ijs. Voeg aan de andere microcentrifugebuizen 90 μL reservoiroplossing toe en keer terug naar ijs om te koelen. OPMERKING: Als het reservoir niet genoeg volume heeft of niet bestaat (in het geval van microbatch onder olie), creëer dan kristallisatiereservoir door de juiste reagentia te mengen.</li>
	<li>Roer het kristal in de druppel met behulp van de kristallen sonde om het grondig te verpletteren. Het kristal moet volledig worden vermalen, die onder de microscoop kan worden gecontroleerd.</li>
	<li>Verwijder alle vloeistof uit de druppel en breng deze met de reservoiroplossing over naar de microcentrifugebuis. Meng en neem vervolgens 2 μL mengsel uit de microcentrifuge buis en voeg het terug naar de put. Spoel de put met de oplossing en breng deze over naar de microcentrifugebuis. Herhaal deze spoelstap nog eens. Vanaf dit punt, houd de microcentrifuge buis koud om te voorkomen dat het smelten van de microzaden in het mengsel.</li>
	<li>Draai de buis met een maximumsnelheid van 4 °C gedurende 3 minuten, stop regelmatig om de buis op ijs te koelen om oververhitting te voorkomen. OPMERKING: Sommige microseedingprotocollen voegen een polytetrafluorethyleenzaadkraal toe aan de microcentrifugebuis om kristalverplettering7,36te helpen . We hebben gebruik gemaakt van de techniek zonder het gebruik van een zaad kraal met succes, maar zie geen problemen met het gebruik van een zaad kraal te verpletteren kristallen.</li>
	<li>Maak een 1 op 10 seriële verdunning van de zaadvoorraad door achtereenvolgens 10 μL over te brengen tussen de gekoelde reservoiroplossingen.</li>
	<li>Bewaar zaadvoorraden die niet onmiddellijk bij -80 °C worden gebruikt.</li>
</ol>5. Een rMMS-scherm instellen
<ol><li>Het opzetten van een 96 goed screening plaat met behulp van een vloeibare doseerrobot. Bij afwezigheid van een robot kan ook een meerkanaals pipet worden gebruikt.<ol>
<li>Breng 75 μL van een diepe put blok naar een 96 goed kristallisatie lade. Voeg 1 μL toe aan de kristallisatieval en 74 μL aan het reservoir.</li>
		<li>Breng 1 μL eiwit aangevuld met lithium I3C, gemaakt in stap 2, over naar de kristallisatieval.</li>
		<li>Breng 0,1 μL zaadvoorraad over naar de kristallisatieval.</li>
		<li>Verzegel de plaat met duidelijke afdichtingstape en ontcubeer de plaat bij een constante temperatuur om kristalgroei mogelijk te maken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het instellen van een hangende drop screens<ol>
<li>Vet de randen van de hangende drop putten (opknoping druppel kristallisatie trays kan worden gevonden in 24 en 48 put formaten).</li>
		<li>Breng 500 μL kristallisatieoplossing over in reservoir.</li>
		<li>In de buurt van het midden van een glazen deksel dia, plaats een 1 μL druppel eiwit aangevuld met lithium I3C, gemaakt in stap 2.</li>
		<li>Voeg 1 μL van de kristallisatieoplossing toe aan de druppel.</li>
		<li>Breng 0,1 μL zaadvoorraad over naar de kristallisatieval.</li>
		<li>Keer de afdekplaat om en sluit de kristallisatie goed af door de afdekkingschuif in het vet te duwen.</li>
		<li>Broed de plaat bij een constante temperatuur om kristalgroei mogelijk te maken. OPMERKING: Met nieuwe en ongeteste zaadvoorraden wordt aanbevolen om de meest geconcentreerde zaadvoorraad te gebruiken om de kans op kristallisatiehits te maximaliseren. Latere omstandigheden kunnen worden ingesteld met een verminderde zaadconcentratie om het aantal kristallen te optimaliseren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inspecteer kristallen trays onder een microscoop regelmatig op kristalgroei. Als kristallen van voldoende kwaliteit zijn, kunnen ze worden geoogst voor het verzamelen van gegevens. Kristallen kunnen ook worden gebruikt om nieuwe zaadvoorraden en nieuwe rMMS-schermen te genereren om iteratieve optimalisatie mogelijk te maken.</li>
</ol>6. Gegevensverzameling
<ol><li>Oogst kristallen met cryoloops, cryoprotect de kristallen en flash koel ze af in vloeibare stikstof. Voor meer informatie over flash koeling kristallen, verwijzen naar Teng37 en Garman en Mitchell38.<ol>
<li>Tijdens de cryoprotectiefase, als het kristal door een nieuwe waterige oplossing wordt doorgegeven, kan I3C van het kristal worden verloren als gevolg van het leeching in de cryoprotectieoplossing. Gebruik lithium I3C in de cryoprotectieoplossing bij een concentratie die overeenkomt met de kristallisatietoestand om dit te beperken.</li>
		<li>Kristallen geteeld met behulp van dit protocol zijn met succes cryoprotected met behulp van Parabar 10312 olie gebaseerd cryoprotectant (Hampton Research). LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken terwijl kristallen worden opgeslagen in vloeibare stikstof. LET OP: Vloeibare stikstof kan koude brandwonden veroorzaken. Vloeibare stikstof kan ook verstikking veroorzaken als deze in afgesloten ruimten wordt gebruikt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monteer het kristal op de röntgenbron goniometer en verzamel diffractiegegevens met behulp van het protocol dat specifiek is voor de röntgenbron.</li>
	<li>Deze techniek is gebaseerd op afwijkend signaal van jodiumatomen in I3C. Selecteer dus de energie van de röntgenfoto om dit signaal te maximaliseren.<ol>
<li>Stel synchrotron Röntgenbronnen met tunable energieën zo laag mogelijk in. Voor veel macromoleculaire kristallografiebundellijnen is de laagste configureerbare energie 8000 tot 8500 eV.</li>
		<li>Roterende anode Röntgenbronnen kunnen niet worden afgestemd. Veelgebruikte anodebronnen met koper hebben de Kα-rand op 8046 eV, wat een goed afwijkend signaal voor jodium biedt (f" = 6,9 e). Anode-bronnen met chroom hebben een Kα-rand op 5415 eV, die een groot afwijkend signaal voor jodium biedt (f" = 12,6 e).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stralingsschade is een aanzienlijk probleem tijdens het verzamelen van gegevens, omdat het het afwijkende signaal39zal degraderen. Selecteer de belichtingstijd en demping van de straal om de beste diffractie te bereiken terwijl de stralingsdosis wordt geminimaliseerd. OPMERKING: In een soortgelijke faseringsverbinding met de jodiumatomen die zijn vervangen door broomatomen, is aangetoond dat stralingsschade de radiolyse van de koolstofbromierbinding en een vermindering van de bezetting van de broomatomen24veroorzaakt.<ol>
<li>Gebruik omgekeerde bundel SAD dataverzameling als een verzameling strategie. De gegevens worden verzameld in wiggen, met tegengestelde wiggen die na elkaar worden verzameld. Hierdoor kunnen Friedel-paren worden verzameld met een gelijkwaardige dosis, wat resulteert in een verbeterde meting van afwijkend signaal dat minder wordt beïnvloed door stralingsschade. Zo kan een acht wigstrategie om 360° te verzamelen zou het verzamelen van de gegevens in de orde van wig 1 (0°-45°), wig 2 (180°-225°), wig 3 (46°-90°), wig 4 (225°), wig 4 (225°), wig 3 (46°-90°), wig 4 (225°), wig 4 (225°), wig 4 (225°), wig 3 -270°), wig 5 (90°-135°), wig 6 (270°-315°), wig 7 (135°-180°) en wig 8 (315°-360°). OPMERKING: Continue rotatie is een alternatieve verzamelingsstrategie voor die van het verzamelen van inverse bundelgegevens. Voor een recente vergelijking van de collectie strategieën, zie Garcie-Bonte & Katona40.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Oplossing voor gegevensverwerking en -structuur
<ol><li>Voer gegevensreductie uit op de diffractiegegevens met XDS41, met als doel het afwijkende signaal te maximaliseren. Gegevensreductie-invoerparameters zijn specifiek voor de gegevensset en vereisen mogelijk een aantal trial and error. Hier zijn enkele aanbevelingen om te beginnen.<ol>
<li>Stel FRIEDEL'S LAW=FALSE IN. Voer CORRECT twee keer uit, zet STRICT_ABSORPTION_CORRECT = WAAR en STRICT_ABSORPTION_CORRECT = FALSE. De ene run kan een hoger afwijkend signaal hebben dan de andere. Vergelijk de afwijkende signalen tussen de runs met behulp van de 'Anomal Corr' en 'SigAno' disciplines in de output. Dit geeft een indicator van de kwaliteit van de gegevens.</li>
		<li>Voer SHELXC op de XDS_ASCII. HKL bestand voor een meer nauwkeurige indicatie van afwijkend signaal. De 'Ranom'-discipline geeft een indicatie van het afwijkende signaal bij verschillende resoluties.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer POINTLESS42 en AIMLESS43 uit om de gegevens te schalen. Stel in AIMLESS de parameter ANOMALOUS ON in. Als de GUI wordt gebruikt, selecteert u de optie Afzonderlijke afwijkende paren voor afstoting en samenvoegen van statistieken. Het testen van verschillende resolutie cutoffs kan nodig zijn om afwijkend signaal te maximaliseren.</li>
	<li>Los de eiwitstructuur op met behulp van Auto-Riksja geautomatiseerde kristalstructuur bepalingspijplijn44. Auto-Riksja zal proberen om het faseprobleem op te lossen en de kristalstructuur van het eiwit automatisch op te bouwen met eiwitmodellering en verfijningssoftware.<ol>
<li>Voer voor eiwitten zonder homologiemodelsjabloon het SAD-protocol van Auto-Riksja in de geavanceerde modus uit. Voer de vereiste parameters in.<ol>
<li>Selecteer PROTEIN als molecuultype.</li>
			<li>Voer de golflengte van het verzamelen van gegevens in angstroms (Å) in.</li>
			<li>Selecteer "I" als substructuurelement om aan te geven dat jodiumatomen zijn gebruikt.</li>
			<li>Selecteer "i3c" als substructuurtype om aan te geven dat I3C het faseringsmolecuul was.</li>
			<li>Selecteer 'sub_direct' als substructuurbepalingsmethode. Deze methode maakt gebruik van SHELXD32 om te zoeken naar de onderbouw.</li>
			<li>Selecteer "3" als het aantal verwachte onderbouw per monomeer.</li>
			<li>Voer '1' in als de afknapper van onderbouwzoeken. Hierdoor kan Auto-Riksja automatisch een geschikte resolutie cutoff bepalen.</li>
			<li>Voer het aantal residuen in één monomeer, de ruimtegroep van de gegevensset en het aantal moleculen in de asymmetrische eenheid op basis van de Matthews-coëfficiënt in.</li>
			<li>Selecteer het juiste verspreidingsniveau van röntgengegevens dat aan de behoeften voldoet. Als u "AutoRickshaw-ontwikkelaars" selecteert, kunnen auto-riksja-ontwikkelaars de run oplossen als zich problemen voordoen.</li>
			<li>Voer de afwijkende gegevens in als een mtz-bestand.</li>
			<li>Voer de eiwitsequentie in als een seq-, pir- of txt-bestand. Een seq-bestand kan worden gegenereerd in een teksteditor (zoals Notepad++9 op Windows of nano in Linux). Maak een nieuw bestand, voer de primaire volgorde van het eiwit als een lange lijn of gescheiden door lijneinden. Sla het bestand op met de .seq-bestandsextensie.</li>
			<li>Voer een institutioneel e-mailadres in.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>De resultaten worden geleverd via een weblink die naar het opgegeven e-mailadres wordt verzonden. OPMERKING: AutoRickshaw is een geautomatiseerde pijplijn die verschillende kristallografie softwarepakketten aanroept om een röntgenkristalstructuur op te lossen32,33,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58. Als de Auto-Riksja-run de structuur niet oplost, kunnen andere Auto-Riksja-instellingen worden getest. De structuurbepalingsmethode kan worden gewijzigd in "sub_phassade" om Phaser59 te gebruiken in plaats van SHELXD32. Het aantal verwachte onderbouw per monomeer kan ook worden verhoogd of verminderd.</li>
	<li>Tijdens de experimentele fasering van de kristalstructuur zal Auto-Riksja proberen zware atomen in de eenheidscel te plaatsen, waardoor een onderbouw ontstaat. De gelijkzijdige driehoeksopstelling van jodiumatomen in I3C biedt een efficiënte manier om de onderbouw te valideren. Als stap 6.3 mislukt, kan het valideren van de substructuur helpen bij het oplossen van problemen met de structuuroplossing.<ol>
<li>Download de lijst met zware atoomsites van de pagina Auto-Riksja-resultaten. Het is een hyperlink genaamd "zware atoomsites". Dit zal een tekstbestand met de zware atoomplaatsen downloaden.</li>
		<li>Wijzig de bestandsextensie van het bestand van .txt naar .pdb.</li>
		<li>Open het PDB-bestand in Coot60. Schakel symmetrie in om andere zware atomen van naburige asymmetrische eenheden te zien.</li>
		<li>Meet de afstanden tussen de zware atomen, ook over asymmetrische eenheden. I3C zal verschijnen als een gelijkzijdige driehoek met een zijlengte van 6 angstroms. De aanwezigheid van een driehoek met deze afmetingen geeft aan dat de plaatsingen van die zware atomen correct zijn.</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Structuurbepaling van een nieuw eiwit bij afwezigheid van een geschikt homologiemodel voor moleculaire vervanging vereist experimentele fasering. Deze methoden vereisen opname van zware atomen in het eiwitkristal, wat een niveau van complexiteit toevoegt aan de structuurbepalingspijpleiding en tal van obstakels kan introduceren die moeten worden aangepakt. Zware atomen kunnen direct in het eiwit worden opgenomen door middel van gelabelde expressie met behulp van selenomethionine en selenocysteine. Omdat deze methode duur, omslachtig is en kan resulteren in een lagere eiwitopbrengst, wordt geëtiketteerd eiwit vaak uitgedrukt nadat kristallisatieomstandigheden zijn gevonden en geoptimaliseerd met niet-gelabeld eiwit. Als alternatief kunnen kristallen worden afgeleid door te weken in een oplossing die zwareatomen 22,63,64. Deze methode maakt vaak gebruik van kristallen van hoge kwaliteit en wordt daarom uitgevoerd nadat er al een robuuste kristallisatiemethode is ontwikkeld. Het succesvol verkrijgen van een afgeleid kristal met behulp van deze methode vereist verdere optimalisatie van weken procedures en screening van verschillende fasering verbindingen, dus het toevoegen van meer tijd aan een reeds moeizaam proces.
Co-kristallisatie van het eiwit met het zware atoom kan worden uitgevoerd in de screeningfase, waardoor het proces efficiënt wordt gestroomlijnd en kristalmanipulatiestappen worden verminderd die schade kunnen veroorzaken. Echter, er bestaat nog steeds het potentiële scenario van het verkrijgen van enkele initiële kristallisatie hits en het probleem van het kiezen van een compatibele zware atoomverbinding. Veel momenteel beschikbare fasering verbindingen zijn onverenigbaar met precipitanten, buffers en additieven vaak gevonden in kristallisatie voorwaarden. Ze kunnen onoplosbaar zijn in sulfaat- en fosfaatbuffers, chelaat om te citeren en acetaat, ongunstig reageren met HEPES- en Tris-buffers of worden afgezonderd door DTT en β-mercaptoethanol21. Aangezien de I3C fasering verbinding geen last heeft van deze onverenigbaarheden, het is een robuuste fasering verbinding die vatbaar zou kunnen zijn voor veel verschillende voorwaarden.
In deze studie wordt een gestroomlijnde methode voor het produceren van afgeleide kristallen gepresenteerd die klaar zijn voor SAD-fasering door gelijktijdige co-kristallisatie van de I3C faseringsverbinding en rMMS. De combinatie van beide technieken verhoogt het aantal kristallisatiehits, waarbij veel van de omstandigheden de morfologie- en diffractiekenmerken hebben verbeterd. In zowel Orf11 NTD als HEWL-testcases werden nieuwe omstandigheden in het I3C-rMMS-scherm geïdentificeerd die afwezig waren toen I3C niet aanwezig was. Mogelijk kan I3C zich gunstig binden aan het eiwit, waardoor de vorming en stabilisatie van kristalcontacten27wordt vergemakkelijkt. Dit kan op zijn beurt leiden tot kristallisatie en mogelijk verbeteren van diffractiekenmerken. Naast het feit dat een verbinding compatibel met schaarse matrix schermen, I3C is ook een aantrekkelijke fasering verbinding vanwege de intrinsieke eigenschappen. De functionele groepen die afwisselen met jodium op de aromatische ring steiger maken specifieke binding aan eiwitten. Dit leidt tot een grotere bezetting en vermindert mogelijk achtergrondsignaal23. Bovendien is de opstelling van afwijkende strooiwagens in een gelijkzijdige driehoek duidelijk in de onderbouw en kan deze worden gebruikt om de binding van I3C(figuur 4B en 4C)snel te valideren. Ten slotte kan het een afwijkend signaal produceren met tunable synchrotronstraling, evenals chroom- en koperroterende anode röntgenbronnen. Het kan dus worden toegepast op veel verschillende workflows. Aangezien I3C op grote schaal beschikbaar en goedkoop te kopen is, is deze aanpak binnen handbereik voor de meeste structurele biologielaboratoria.
Er zijn verschillende experimentele overwegingen die moeten worden aangepakt bij het gebruik van de I3C-rMMS-methode. Deze methode kan niet worden toegepast als het eerste kristallijne materiaal van het eiwit niet kan worden verkregen. In moeilijke gevallen kan kristallijn materiaal uit een homolog eiwit ook worden gebruikt om zaadvoorraad te genereren. Deze cross-seeding benadering van rMMS heeft aangetoond dat een aantal veelbelovende resultaten7. Het optimaliseren van kristalaantal door verdunning van de zaadvoorraad is een cruciale stap, die niet over het hoofd mag worden gezien, om de kans op het produceren van grote kristallen van hoge kwaliteit te maximaliseren en geschikte diffractiegegevens te verkrijgen. Als er weinig I3C-sites zijn geïdentificeerd in de asymmetrische eenheid, moeten de omstandigheden die bevorderlijk zijn voor kristallisatie verder worden geoptimaliseerd met een verhoogde concentratie van I3C. Dit kan de bezetting van I3C verhogen om het afwijkende signaal te maximaliseren en kristalderivatisatie te helpen.
Er kunnen gevallen zijn waarin deze techniek mogelijk niet de optimale methode is om eiwitkristallen te derivatiseren. Naarmate de grootte van een eiwit- of eiwitcomplex toeneemt, kan het beperkte aantal I3C-sites op het eiwitoppervlak onvoldoende faseringskracht bieden om de structuur op te lossen. In deze scenario's waarvan wordt vermoed dat de eiwitgrootte de fasering belemmert, kan de selenomethionine-etikettering van het eiwit een meer haalbare benadering zijn voor het faseren van het eiwit. Als het eiwit voldoende methionineresiduen in het eiwit heeft (aanbevolen met ten minste één methionine per 100 residuen65)en een hoge efficiëntie selenomethionine-integratie in een eiwit kan worden bereikt (zoals in bacteriële expressiesystemen66),zullen in de kristallen meerdere hoge bezettingsatomen aanwezig zijn om de structuur te faseren.
Bovendien kunnen sommige eiwitten inherent ongeschikt zijn voor derivatisatie met I3C. I3C bindingsplaatsen op eiwitten zijn afhankelijk van de eiwitstructuur. Er kunnen eiwitten bestaan die van nature weinig blootgestelde patches hebben die compatibel zijn met I3C-binding. Het is dus niet te voorzien dat er problemen kunnen zijn bij het co-kristalliseren van sommige doeleiwitten met I3C.

Op het gebied van structurele biologie wordt röntgenkristallografie beschouwd als de gouden standaardtechniek om de atomaire resolutiestructuren van macromoleculen te bepalen. Het is op grote schaal gebruikt om de moleculaire basis van ziekten te begrijpen, rationele projecten voor het ontwerpen van geneesmiddelen te begeleiden en het katalytische mechanisme van enzymen1,2te verduidelijken . Hoewel structurele gegevens een schat aan kennis bieden, kan het proces van eiwitexpressie en -zuivering, kristallisatie en structuurbepaling uiterst omslachtig zijn. Er worden vaak verschillende knelpunten opgetreden die de voortgang van deze projecten belemmeren en dit moet worden aangepakt om de pijpleiding voor de bepaling van de kristalstructuur efficiënt te stroomlijnen.
Na recombinant expressie en zuivering moeten voorlopige omstandigheden worden geïdentificeerd die bevorderlijk zijn voor kristallisatie, wat vaak een moeizaam en tijdrovend aspect van röntgenkristallografie is. Commerciële schaarse matrixschermen die bekende en gepubliceerde voorwaarden consolideren zijn ontwikkeld om dit knelpunt te verlichten3,4. Echter, het is gebruikelijk om weinig hits te genereren van deze eerste schermen, ondanks het gebruik van zeer zuivere en geconcentreerde eiwit monsters. Het observeren van heldere druppels geeft aan dat het eiwit mogelijk niet de niveaus van oververzadiging bereikt die nodig zijn om een kristal te kernen. Om kristalkern en groei aan te moedigen, kunnen zaden die zijn geproduceerd uit reeds bestaande kristallen aan de omstandigheden worden toegevoegd en dit maakt een verhoogde bemonstering van de kristallisatieruimte mogelijk. Ireton en Stoddard introduceerden voor het eerst de microseed matrix screening methode5. Kristallen van slechte kwaliteit werden verpletterd om een zaadvoorraad te maken en vervolgens systematisch toegevoegd aan kristallisatieomstandigheden die verschillende zouten bevatten om nieuwe diffractiekwaliteitkristallen te genereren die anders niet zouden zijn gevormd. Deze techniek werd verder verbeterd door D'Arcy et al. die willekeurige microseed matrix screening (rMMS) ontwikkeld waarin zaden werden geïntroduceerd in een reserve matrix kristallisatie scherm6,7. Dit verbeterde de kwaliteit van kristallen en verhoogde het aantal kristallisatie hits gemiddeld met een factor 7.
Nadat kristallen met succes zijn geproduceerd en een röntgendiffractiepatroon is verkregen, ontstaat een ander knelpunt in de vorm van het oplossen van het 'faseprobleem'. Tijdens het proces van gegevensverwerving wordt de intensiteit van de diffractie (evenredig aan het kwadraat van de amplitude) geregistreerd, maar de fase-informatie gaat verloren, waardoor het faseprobleem ontstaat dat onmiddellijke structuurbepalingstopt 8. Als het doeleiwit een hoge sequentie-identiteit deelt met een eiwit met een eerder bepaalde structuur , kan moleculaire vervanging worden gebruikt om de fase-informatie9,10,11,12te schatten . Hoewel deze methode snel en goedkoop is, zijn modelstructuren mogelijk niet beschikbaar of geschikt. Het succes van de op het malogiemodel gebaseerde moleculaire vervangingsmethode daalt aanzienlijk naarmate de sequentie-identiteit onder de 35%13daalt. Bij gebrek aan een geschikt homologiemodel kunnen ab initio-methoden, zoals ARCIMBOLDO14,15 en AMPLE16,worden getest. Deze methoden gebruiken computationeel voorspelde modellen of fragmenten als uitgangspunt voor moleculaire vervanging. AMPLE, dat voorspelde lokmodellen als uitgangspunt gebruikt, worstelt om structuren van grote (>100 residuen) eiwitten en eiwitten die voornamelijk β-vellen bevatten op te lossen. ARCIMBOLDO, dat probeert om kleine fragmenten te passen om zich in een grotere structuur uit te breiden, is beperkt tot gegevens met een hoge resolutie (≤2 Å) en door het vermogen van algoritmen om de fragmenten in een volledige structuur uit te breiden.
Als moleculaire vervangingsmethoden uitvallen, moeten directe methoden zoals isomorfe vervanging17,18 en afwijkende verstrooiing op een enkele golflengte (SAD19)of meerdere golflengten (MAD20)worden gebruikt. Dit is vaak het geval voor echt nieuwe structuren, waar het kristal moet worden gevormd of afgeleid met een zwaar atoom. Dit kan worden bereikt door het weken of co-kristalliseren met een zware atoomverbinding, chemische modificatie (zoals 5-bromouracil integratie in RNA) of geëtiketteerde eiwitexpressie (zoals het opnemen van selenomethionine of selenocysteine aminozuren in de primaire structuur)21,22. Dit bemoeilijkt het kristallisatieproces verder en vereist extra screening en optimalisatie.
Een nieuwe klasse van fasering verbindingen, waaronder I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid) en B3C (5-amino-2,4,6-tribromoisophthalic acid), bieden spannende voordelen ten opzichte van reeds bestaande fasering verbindingen23,24,25. Zowel I3C als B3C zijn voorzien van een aromatische ringsteiger met een afwisselende opstelling van afwijkende verstrooiing die nodig is voor directe faseringsmethoden en amino- of carboxylaatfunctionele groepen die specifiek met het eiwit communiceren en bindende sitespecificiteit bieden. De daaropvolgende gelijkzijdige driehoeksregeling van zware metalengroepen maakt vereenvoudigde validatie van de faseringsonderbouw mogelijk. Op het moment van schrijven zijn er 26 I3C-gebonden structuren in de Protein Data Bank (PDB), waarvan er 20 werden opgelost met behulp van SADfasering 26.
Dit protocol verbetert de werkzaamheid van de structuurbepalingspijplijn door de methoden van derivatisatie van zware metalen en rMMS-screening te combineren om tegelijkertijd het aantal kristallisatietreffers te verhogen en het kristalafleidingproces te vereenvoudigen. We hebben aangetoond dat deze methode zeer effectief was met kippeneiwit lysozyme en een domein van een nieuw lysin eiwit uit bacteriofaag P6827. Structuur oplossing met behulp van de sterk geautomatiseerde Auto-Riksja structuur bepaling pijplijn wordt beschreven, specifiek afgestemd op de I3C fasering compound. Er bestaan andere geautomatiseerde pijpleidingen die kunnen worden gebruikt, zoals AutoSol28, ELVES29 en CRANK230. Niet-volledig geautomatiseerde pakketten zoals SHELXC/D/E kunnen ook worden gebruikt31,32,33. Deze methode is vooral gunstig voor onderzoekers die eiwitten bestuderen die geen homologe modellen in het VOB hebben, door het aantal screening- en optimalisatiestappen aanzienlijk te verminderen. Een voorwaarde voor deze methode is eiwitkristallen of een kristallijn neerslag van het doeleiwit, verkregen uit eerdere kristallisatieproeven.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL disposable luer lock syringes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>T3SS10LAT</td>
			<td>Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used for hanging drop crystal tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-506</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22178</td>
			<td>Commonly referred to as I3C in the article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-297</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18X18-2</td>
			<td>Coverslips for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning vacuum grease</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-510</td>
			<td>Used for sealing hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette 0.1 &#956;L-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 2 &#956;L-20 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1153247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 20 &#956;L-200 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1152006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>HIR92601.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Approximately 95% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IndexHT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope illuminator</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>FT192/230</td>
			<td>Light source to illuminate crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/ION HT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Liquid Dispenser</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel with scalpel blade no. 15</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>LV-SMSCPO15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope&#160;</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>EMZ-5TR</td>
			<td>Microscope for visualising crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>RAVM1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening

Eiwitstructuur opheldering met behulp van x-ray kristallografie vereist zowel hoge kwaliteit diffracting kristallen en computationele oplossing van de diffractie fase probleem. Nieuwe structuren die geen geschikt homologiemodel hebben, worden vaak afgeleid met zware atomen om experimentele fase-informatie te verstrekken. Het gepresenteerde protocol genereert efficiënt afgeleide eiwitkristallen door willekeurige microseeding matrix screening te combineren met afleiding met een zwaar atoommolecuul I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid). Door I3C in het kristalrooster op te nemen, kan het probleem van de diffractiefase efficiënt worden opgelost met behulp van enkele golflengteafwijking (SAD) fasering. De gelijkzijdige driehoeksopstelling van jodiumatomen in I3C zorgt voor een snelle validatie van een correcte afwijkende onderbouw. Dit protocol zal nuttig zijn voor structurele biologen die macromoleculaire structuren oplossen met behulp van op kristallografie gebaseerde technieken met interesse in experimentele fasering.

Integratie van I3C in rMMS kan nieuwe voorwaarden genereren ter ondersteuning van afgeleide kristalgroei De werkzaamheid van gelijktijdige rMMS-screening en I3C-derivatisatie werd aangetoond in twee eiwitten, kippeneiwit lysozyme (HEWL, verkregen als gelyofofiel poeder) en het vermeende Orf11 lysin N-terminal domein (Orf11 NTD) van bacteriophage P68. Elk eiwit werd gescreend tegen PEG/ION HT onder vier verschillende omstandigheden, waaronder: onverdeeld, gezaaid, onverdeeld met I3C en gezaaid met I3C (figuur 1). Voor beide eiwitten heeft de enige toevoeging van I3C het aantal voorwaarden dat bevorderlijk is voor kristallisatie niet verhoogd. In het geval van Orf11 NTD werd slechts één geschikte voorwaarde geïdentificeerd met en zonder I3C (figuur 1B). Toen I3C aan de HEWL-schermen werd toegevoegd, werd het aantal hits teruggebracht van 31 naar 26, waarbij de toegevoegde complexiteit van kristallisatie werd benadrukt bij de invoering van faseringsverbindingen (figuur 1A). In overeenstemming met andere studies, het toevoegen van zaad aan commerciële schaarse matrix schermen om een rMMS-scherm te genereren aanzienlijk toegenomen het aantal mogelijke kristallisatie voorwaarden voor beide eiwitten, wat resulteert in een 2,1 en 6 keer te verhogen voor HEWL en Orf11 NTD, respectievelijk6,61 (Figuur 1). Belangrijker nog, gelijktijdige toevoeging van I3C en zaad verhoogde het aantal hits ten opzichte van een ongeplaatst scherm, waaruit blijkt een 2,3 en 7 keer te verhogen voor HEWL en Orf11 NTD, respectievelijk. Veel van de kristallen van rMMS in aanwezigheid van I3C tonen een uitstekende kristalmorfologie(figuur 2).
Zaaien maakt een zorgvuldige controle van kristalnummer in I3C rMMS schermen In microseeding experimenten, het aantal zaden geïntroduceerd in een kristallisatie proef kan worden gecontroleerd door verdunning van de zaadvoorraad en dit zorgt voor een nauwkeurige controle van de nucleatie in de druppel7,36. Hierdoor kunnen vaak grotere kristallen ontstaan omdat er minder concurrentie is van eiwitmoleculen op nucleatieplaatsen. Dit voordeel strekt zich ook uit tot de I3C-rMMS methode en is met succes aangetoond in zowel HEWL als Orf11 NTD. Recreatie van een kristallisatietoestand die is geïdentificeerd op het I3C-rMMS-scherm met een verdunde zaadvoorraad leverde minder maar grotere kristallen op(figuur 3).
SAD phasing kan worden gebruikt om de structuren op te lossen van kristallen afkomstig van rMMS I3C scherm Kristallen die worden geteeld met behulp van de verdunde zaadvoorraad in figuur 3 werden gebruikt om de structuur van de eiwitten op te lossen met behulp van SAD-fasering met behulp van diffractiegegevens van één enkel kristal (figuur 4). Gegevens werden verzameld op de Australische Synchrotron MX1 beamline62. Gedetailleerde details over het verzamelen en structureren van gegevens worden elders beschreven27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig01.jpg"> Figuur 1 - rMMS werd gebruikt om nieuwe omstandigheden voor kristalgroei te genereren in aanwezigheid van I3C voor twee testeiwitten. 96 put damp diffusie kristallisatie schermen werden uitgevoerd met behulp van commerciële schaarse matrix schermen. (A) Hen eiwit lysozyme werd getest met de Index HT scherm. Trays werden gezaaid met HEWL kristallen geteeld in 0,2 M ammonium tartraat dibasic pH 7.0, 20% (w /v) polyethyleenglycol 3350. (B) Orf11 NTD van bacteriofaag P68 werd getest met het PEG/ION-scherm. Orf11 NTD trays werden gezaaid uit kristallen uit conditie G12 van het onverzegelde scherm, weergegeven in het blauw. Voorwaarden ter ondersteuning van kristalgroei worden weergegeven in het rood. rMMS zaaien in de aanwezigheid en afwezigheid van I3C beide gaf aanzienlijk meer kristallen hits dan onverzegelde trays. Figuur aangepast van Truong et al.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig02.jpg"> Figuur 2 - Representatieve afbeeldingen van kristallen die zijn gekweekt uit de verdampedfusieproeven in figuur 1, onder a) en b). Figuur aangepast van Truong et al.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig03.jpg"> Figuur 3 - Verdunning van de zaadvoorraad is een effectieve manier om nucleatie te verminderen in een kristallisatieconditie die wordt gevonden met behulp van de I3C-rMMS-methode, om het aantal kristallen dat zich vormen te controleren. Het verminderen van nucleatie binnen een daling resulteert vaak in kristallen groeien tot grotere afmetingen. Figuur aangepast van Truong et al.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig04.jpg"> Figuur 4 - Orf11 NTD (PDB ID 6O43) en HEWL (PDB ID 6PBB) werden gekristalliseerd met behulp van de I3C-rMMS methode en opgelost met behulp van Auto-Riksja SAD fasering. (A) Lintstructuren van HEWL en Orf11 NTD opgelost door middel van experimentele fasering. (B) I3C molecuul gebonden aan HEWL en Orf11 NTD. (C) Afwijkende jodiumatomen in I3C zijn gerangschikt in een gelijkzijdige driehoek van 6 Å. Zo geeft de aanwezigheid van deze driehoek in de faseringsonderbouw aan dat er een I3C-molecuul in die positie zit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61984fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Dit artikel presenteert een methode om eiwitkristallen te genereren die zijn afgeleid met I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisoftaalzuur) met behulp van microseeding om nieuwe kristallisatieomstandigheden in schaarse matrixschermen te genereren. De trays kunnen worden opgezet met behulp van vloeibare doseerrobots of met de hand.

De afleiding van eiwitkristallen met I3C met behulp van Random Microseed Matrix Screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Dit is een kristallisatieprotocol dat is ontworpen om de groei van een eiwitkristal te optimaliseren en tegelijkertijd het eiwit te derivaten met een faseringsmolecuul om de structuur van een eiwit te bepalen door röntgenkristallografie. Om de röntgenkristalstructuur van een volledig nieuw eiwit te bepalen, worden kristallisatieomstandigheden geoptimaliseerd om kwaliteitskristallen te produceren. In het geval van een volledig nieuw eiwit moeten zware atomen in het kristal worden geïntroduceerd om een afgeleid kristal te produceren.Röntgendiffractiegegevens worden verzameld uit het afgeleide kristal en moeten computationeel worden opgelost om een röntgenkristalstructuur te produceren. Kristallisatie en derivitization zijn beide moeizame processen. Om deze knelpunten aan te pakken, hebben we een geoptimaliseerde screeningsprocedure ontwikkeld die beide doelstellingen tegelijkertijd bereikt.Dit protocol maakt gebruik van een eerder ontwikkelde techniek bekend als willekeurige microseed matrix screening. Kristallen of kristallijn neerslag wordt verpletterd tot microzaden die kunnen worden gebruikt om kristalgroei te starten in volledig onafhankelijke omstandigheden. Tegelijkertijd introduceren we een faseringsmolecuul genaamd I3C in de kristallisatietoestand.Dit molecuul zorgt voor een groot afwijkend signaal waarmee de structuur kan worden opgelost door een enkele golflengte afwijkende discussiefasering. Voor gebruikers die niet bekend zijn met experimentele grootte van kristalstructuren presenteren we een gebruiksvriendelijke softwarepijplijn om de structuuroplossing gedeeltelijk te automatiseren die het aan maat maakt om het afwijkende signaal van I3C te gebruiken. De eerste stap is het creëren van een I3C voorraad.Meet 120 milligram I3C in een microcentrifugebuis. Voeg 200 microliters van twee molaire lithiumhydroxide toe aan de microcentrifugebuis. Verwarming van de buis op 40 tot 60 graden en vortexen kan worden gebruikt om ontbinding aangemoedigd.De ene molaire voorraad lithium I3C-oplossing moet bruin zijn. Twee methoden kunnen worden gebruikt om I3C in de eiwitvoorraad te introduceren. Lithium I3C kan direct aan de eiwitvoorraad worden toegevoegd.3,75 microliter tot 30 microliter I3C kunnen worden toegevoegd aan 150 microliter eiwit om een concentratie tussen de vijf en 14 millimolar te geven. Sommige eiwitten kunnen neerslaan bij contact met hoge concentraties I3C. In deze gevallen kan lithium I3C worden toegevoegd aan een eiwitverdunningsbuffer die buffer is die overeenkomt met het monstereiwit met een uiteindelijke concentratie tussen 10 en 80 millimolar.Voeg 150 microliter van de eiwitverdunningsbuffer toe aan 150 microliter eiwitmonster. Een glazen sonde om kristallen te verpletteren is gemaakt van een glazen Pasteur pipet. Met een Bunsen brander op de blauwe vlam, verwarm de Pasteur pipet naar het midden.Met behulp van een pincet, trek de uiteinden van de Pasteur pipet uit in een dunne diameter van minder dan 0,3 millimeter. Houd dat segment in de vlam om de pipet te scheiden op dit punt en rond het einde van de pipet om de glassonde af te maken. Dit is een voorbeeld van hoe de glazen pipet eruit moet zien.Kristalverpletters kunnen ook worden besteld bij externe leveranciers als alternatief voor het maken van uw eigen A-microzaadvoorraad wordt gegenereerd door het verpletteren van eiwitkristallen of kristallijn neerslag. Plaats vijf microcentrifugebuizen van 1,5 mL op ijs. Selecteer onder een lichtmicroscoop de beste morfologiekristallen of kristallijn neerslag die kunnen worden opgeofferd.Voor 96 goed kristallisatie trays open de put door het snijden van de plastic afdichting tape. Voor hangende drop trays kan de afdekslip met een pincet worden verwijderd en op een vlakke ondergrond worden omgekeerd. Breng 70 microliter reservoiroplossing over naar een van de microcentrifugebuizen en ontspan op ijs.Breng er 90 microliter reservoiroplossing naar de overige buizen en keer terug naar ijs om te koelen. Als er onvoldoende reservoir volume aanwezig is kristallisatie reservoir kan worden gemaakt door het mengen van de juiste reagentia en kan in plaats daarvan worden gebruikt. Roer de kristallen in de kristallisatie druppel met behulp van de glassonde grondig verpletteren.De voortgang kan onder de microscoop worden gevolgd totdat er geen kristallen of kristallijn materiaal zichtbaar is. Breng alle vloeistof van de druppel naar de microcentrifugebuis met 70 microliter reservoiroplossing. Meng door pipetting op en neer.Breng twee tot drie microliter mengsel terug naar de put en spoel de put door pipet op en neer. Breng het mengsel terug naar de microcentrifuge buis. Deze spoelstap moet opnieuw worden herhaald.De microcentrifugebuis moet vanaf dit punt koud worden gehouden om te voorkomen dat de microzaden smelten. Vortex de buis op maximale snelheid op vier graden gedurende ongeveer drie minuten koelen van de buis op ijs regelmatig om oververhitting te voorkomen. maak één op de 10 seriële verdunningen van de zaadvoorraad door achtereenvolgens 10 microliter tussen de gekoelde reservoiroplossingen over te brengen.Tussen zaadbouillonverdunningen moet de buis worden vortexed. Zaadvoorraden die niet onmiddellijk worden gebruikt, moeten worden opgeslagen in een min 80 graden ultra koude vriezer. Een 96 goed willekeurige microseed matrix scherm kan worden ingesteld met behulp van een vloeibare doseerrobot.Plaats de zaadbouillon, eiwitvoorraadoplossing aangevuld met I3C en kristallisatiescherm in de robot. Met behulp van de robot overdracht 75 microliters van de kristallisatie scherm naar de 96 goed lade. Voeg een microliter toe aan de kristallisatieval en 74 microliter aan het reservoir.Breng één microliter eiwit dat met I3C aan de kristallisatiedaling wordt aangevuld. Breng 0,1 microliter zaadbouillon over naar de kristallisatiedaling. Sluit de plaat af met afdichtingstape.Opknoping drop screens kunnen worden ingesteld in 24 goed opknoping druppel kristallisatie trays. Vet de randen van de hangende dropputten in. Breng 500 microliter kristallisatieoplossing over naar het reservoir.In de buurt van het centrum van een glazen deksel dia plaats een een microliter druppel kristallisatie oplossing. Voeg aan deze druppel een microliter eiwit toe, aangevuld met lithium I3C en 0,1 microliter zaadbouillon. Keer de afdekplaat om en sluit de kristallisatie goed af door de afdekkingschuif in het vet te duwen.Hangende druppel- en afdichtingsdruppelbakken worden bij een constante temperatuur geïncubeerd om kristallen te laten ontstaan. Ze moeten regelmatig worden geïnspecteerd onder een microscoop voor kristalgroei. Nadat diffractiegegevens zijn verkregen, geïntegreerd en geschaald zoals uitgelegd in het meegeleverde geschreven protocol, kan de automatische kristalstructuurbepalingspijpleiding automatisch kristalstructuur worden gebruikt om het faseprobleem op te lossen en het eiwit te modelleren.Klik op de bestemmingspagina Auto-Riksja op de knop Doorgaan. Voer uw institutionele e-mail in het auto-riksja-webformulier in en klik op Doorgaan met het uitvoeren van Auto-Riksja. Voor eiwitten zonder een homologie moto template draaien de SAD protocol van Auto-Riksja in geavanceerde modus.Voer de vereiste parameters in. Selecteer eiwit als molecuultype. Voer de golflengte van het verzamelen van gegevens in angstroms in.Dus zoals ik als substructuur element om aan te geven jodium atomen werden gebruikt. Selecteer I3C substructuur type om aan te geven I3C was de fasering molecuul. Selecteer sub_direct als de methode voor de bepaling van de onderstructuur.Selecteer er drie als het aantal verwachte substructuren per monomeer. Voer er een in als de reservering cutoff van substructure zoeken. Hierdoor kan Auto-Riksja automatisch een geschikte resolutie cutoff bepalen.Voer het aantal residuen in één monomeer, de ruimtegroep van de gegevensset en het aantal moleculen in de asymmetrische eenheid op basis van de Matthews-coëfficiënt in. Selecteer het juiste verspreidingsniveau van röntgengegevens dat bij uw behoeften past. Voer de afwijkende gegevens in als een leeg ingesteld bestand.Voer uw eiwitsequentie in als een SEQ-, PIR- of TXT-bestand. Voer uw institutionele e-mailadres in. De resultaten worden aan u geleverd via een weblink die naar het opgegeven e-mailadres wordt verzonden.Als Auto-Riksja er niet in slaagt om de structuur op te lossen met behulp van de bepaalde substructuur valideren van de substructuur kan helpen bij het oplossen van problemen structuur oplossing. Download de lijst met sites met zware atomen van de pagina Auto-Riksja-resultaten. Het is een hyperlink genaamd zware atoomsites.Dit zal een tekstbestand met de zware atoomplaatsen downloaden. Wijzig de bestandsextensie van het bestand van txt naar pdb. Open het pdb-bestand in Coot.Zet symmetrie in om alle zware atomen van naburige asymmetrische eenheden te zien. Meet de afstanden tussen de zware atomen, ook over asymmetrische eenheden. I3C zal verschijnen als een gelijkzijdige driehoek met een zijlengte van zes angstroms.De aanwezigheid van een driehoek met deze afmetingen geeft aan dat de plaatsingen van die zware atomen correct zijn. Als de auto-riksja run substructuur onjuist is, kunnen andere Auto-Riksja instellingen worden getest zoals besproken in het geschreven protocol. De I3C RMMS methode werd getest op twee eiwitten, kip eiwit lysozyme met behulp van de in HT scherm van Hampton Research en het domein van de Orf11 lysin eiwit uit bacteriofaag P68.Volledige schermen werden ingesteld voor elk eiwit dat overeenkomt met het controlescherm zonder I3C of microzaad, scherm met microzaad toegevoegd, scherm met I3C, en ten slotte het scherm met I3C en microzaad. Het toevoegen van I3C aan een kristalscherm lijkt het aantal kristallisatiehits niet te verhogen. Bij kippeneiwit lysozyme daalde het aantal voorwaarden van 31 naar 26.Bij het Orf11-domein werd één hitvoorwaarde gevonden in het controlescherm. Het toevoegen van I3C aan het scherm gaf ook een enkele hit in dezelfde omstandigheden. Het toevoegen van microzaad aan de put resulteerde in een aanzienlijke toename van het aantal hitomstandigheden, wat resulteerde in een toename van respectievelijk 2,1 en zesvoudige toename voor kippeneiwit lysozyme en het Orf11-domein.Dit resultaat komt overeen met andere studies testen RMMS. Belangrijker nog, het toevoegen van I3C en microzaad aan een scherm verhoogde ook het aantal hit voorwaarden ten opzichte van de controle scherm waaruit blijkt een 2,3 en zeven keer te verhogen voor kip eiwit lysozyme en de Orf11 domein respectievelijk. Dit toont aan dat de I3C RMMS-methode efficiënt nieuwe omstandigheden voor afgeleide kristallen kan produceren.Kristallen uit deze omstandigheden kunnen worden geoogst en gebruikt om de kristalstructuur op te lossen. Zowel de structuur van hen eiwit lysozyme Orf11 domein kan worden opgelost met SAD fasering op de Auto-Riksja pijpleiding, met behulp van de afwijkende signaal van I3C waaruit blijkt succesvolle derivitization door de I3C RMMS scherm. We hebben een eenvoudig en efficiënt protocol gepresenteerd om hoogwaardige kristallen te produceren die zijn afgeleid met het faseringsmolecuul I3C.Het minimaliseert het aantal schermen en kristallijne behandeling stappen, en dus is van bijzonder belang voor structurele biologen bestuderen van nieuwe eiwitten. Wij raden ten zeerste aan de kristalgrootte te optimaliseren door verschillende zaadverdunningen te testen die zijn gemaakt tijdens de bereiding van de zaadvoorraad. En deze stap is voltooid nadat de eerste schermen zijn gedaan.I3C is op grote schaal beschikbaar en het is goedkoop om te kopen en dus geloven we dat deze methode binnen het bereik van de meeste structurele biologie laboratoria.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microkristallografie van eiwitkristallen en<em&gt; In Cellulo</em&gt; Diffractie

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Groeiende eiwit kristallen met verschillende afmetingen, met behulp van geautomatiseerde kristallisatie in combinatie met In Situ Dynamische lichtverstrooiing

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase remmer screening in zelf-geassembleerde humane Eiwit Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetische screening van Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Het creëren van zeer specifieke chemisch geïnduceerde eiwit Dimerization systemen door stepwise Phage selectie van een Combinatoriale één-domein antilichamen bibliotheek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategische screening en karakterisering van de Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex voor succesvolle kristallisatie

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimaliseren van de groei van endothiapepsine kristallen voor seriële kristallografie experimenten

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Bacteriële expressie en zuivering van humane matrix metalloproteinase-3 met behulp van affiniteitschromatografie

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...