Name: derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening
Uploaded: 2021-01-16T15:00:00
Duration: 14 min 4 s
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Cette recherche a été entreprise sur la ligne de faisceau MX1 du Synchrotron australien, qui fait partie de l’ANSTO. Les auteurs aimeraient remercier les membres des laboratoires Shearwin et Bruning pour leurs discussions sur ces travaux. Les auteurs aimeraient également remercier le Dr Santosh Panjikar et la Dre Linda Whyatt-Shearwin qui ont contribué aux travaux originaux qui ont été à l’origine de ce protocole.
Le financement suivant est reconnu : Australian Research Council (subvention Nos. DP150103009 et DP160101450 à Keith E. Shearwin); Bourse d’études de l’Université d’Adélaïde (Australian Government Research Training Program à Jia Quyen Truong et Stephanie Nguyen).

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La détermination de structure d’une protéine nouvelle en l’absence d’un modèle approprié d’homologie pour le remplacement moléculaire exige l’élimination progressive expérimentale. Ces méthodes nécessitent l’incorporation d’atomes lourds dans le cristal protéique, ce qui ajoute un niveau de complexité au pipeline de détermination de la structure et peut introduire de nombreux obstacles qui doivent être abordés. Les atomes lourds peuvent être incorporés directement dans la protéine par l’expression étiquetée utilisant la sélénomethionine et la selénocystéine. Comme cette méthode est coûteuse, laborieuse et peut entraîner des rendements protéiques inférieurs, les protéines étiquetées sont souvent exprimées après que des conditions de cristallisation ont été trouvées et optimisées avec des protéines non étiquetées. Alternativement, les cristaux peuvent être dérivés en trempant dans une solution contenant des atomes lourds22,63,64. Cette méthode utilise souvent des cristaux de haute qualité et est donc effectuée après qu’une méthode de cristallisation robuste a déjà été développée. L’obtention réussie d’un cristal dérivatisé à l’aide de cette méthode nécessite une optimisation plus continue des procédures de trempage et le criblage de différents composés de phasage, ajoutant ainsi plus de temps à un processus déjà laborieux.
La co-cristallisation de la protéine avec l’atome lourd peut être effectuée au stade de criblage, rationalisant ainsi efficacement le processus et réduisant les étapes de manipulation du cristal qui peuvent causer des dommages. Cependant, il existe toujours le scénario potentiel d’obtenir peu de coups de cristallisation initiale et le problème de choisir un composé atome lourd compatible. De nombreux composés de phasage actuellement disponibles sont incompatibles avec les précipités, les tampons et les additifs couramment trouvés dans les conditions de cristallisation. Ils peuvent être insolubles dans les tampons de sulfate et de phosphate, chélate au citrate et à l’acétate, réagir défavorablement avec des tampons HEPES et Tris ou être séquestrés par la TNT et le β-mercaptoéthanol21. Comme le composé de phasage I3C ne souffre pas de ces incompatibilités, c’est un composé robuste de phasing qui pourrait être aimable à beaucoup de conditions différentes.
Dans cette étude, une méthode simplifiée de production de cristaux dérivatisés prêts pour le TSO progressivement par co-cristallisation simultanée du composé de phasage I3C et du RMMS est présentée. La combinaison des deux techniques augmente le nombre de coups de cristallisation, avec beaucoup de conditions ayant amélioré la morphologie et les caractéristiques de diffraction. Dans les cas d’essai orf11 NTD et HEWL, de nouvelles conditions dans l’écran I3C-rMMS ont été identifiées qui étaient absentes quand I3C n’était pas présent. Potentiellement, I3C peut se lier favorablement à la protéine, facilitant la formation et la stabilisation des contacts en cristal27. À son tour, cela peut induire la cristallisation et peut-être améliorer les caractéristiques de diffraction. En plus d’être un composé compatible avec des écrans matriciels clairsemés, I3C est également un composé attrayant de phasing en raison de ses propriétés intrinsèques. Les groupes fonctionnels qui alternent avec l’iode sur l’échafaudage aromatique permettent une liaison spécifique aux protéines. Cela conduit à une plus grande occupation et réduit potentiellement le signal d’arrière-plan23. De plus, l’agencement de disperseurs anormaux dans un triangle équilatéral est évident dans la sous-structure et peut être utilisé pour valider rapidement la liaison de l’I3C(figure 4B et 4C). Enfin, il peut produire un signal anormal avec le rayonnement synchrotron tunable ainsi que le chrome et le cuivre tournant anode X-ray sources. Ainsi, il peut être appliqué à de nombreux workflows différents. Comme i3C est largement disponible et peu coûteux à acheter, cette approche est à portée de main pour la plupart des laboratoires de biologie structurelle.
Il y a plusieurs considérations expérimentales qui doivent être abordées lors de l’utilisation de la méthode I3C-rMMS. Cette méthode ne peut pas être appliquée si le matériau cristallin initial de la protéine ne peut pas être obtenu. Dans les cas difficiles, des matériaux cristallins provenant d’une protéine homologue peuvent également être utilisés pour générer des stocks de semences. Cette approche d’ensemencement croisé à rMMS a montré quelques résultatsprometteurs 7. L’optimisation du nombre de cristaux par dilution du stock de semences est une étape cruciale, qu’il ne faut pas négliger, afin de maximiser les chances de produire de gros cristaux de haute qualité et d’acquérir des données de diffraction appropriées. S’il y a peu de sites I3C identifiés dans l’unité asymétrique, les conditions propices à la cristallisation devraient être encore optimisées avec une concentration accrue d’I3C. Cela peut augmenter l’occupation de l’I3C afin de maximiser le signal anormal et faciliter la dérivation des cristaux.
Il peut y avoir des cas où cette technique peut ne pas être la méthode optimale pour dérivatiser les cristaux de protéines. À mesure que la taille d’une protéine ou d’un complexe protéique augmente, le nombre limité de sites I3C à la surface des protéines peut ne pas fournir suffisamment de puissance d’élimination progressive pour résoudre la structure. Dans ces scénarios où l’on soupçonne que la taille des protéines entrave l’élimination progressive, l’étiquetage de la protéine par la sélénomethionine peut être une approche plus viable pour éliminer progressivement la protéine. Si la protéine a un nombre suffisant de résidus de méthionine dans la protéine (recommandé d’avoir au moins une méthionine pour 100 résidus65) et l’incorporation de sélénomethionine à haut rendement dans une protéine peut être atteint (comme dans les systèmes d’expressionbactérienne 66), plusieurs atomes de sélénium à occupation élevée seront présents dans les cristaux pour phaser la structure.
En outre, certaines protéines peuvent intrinsèquement ne pas être adaptées à la dérivation avec I3C. Les sites de liaison I3C sur les protéines dépendent de la structure protéique. Il peut exister des protéines qui ont naturellement peu de patchs exposés compatibles avec la liaison I3C. Par conséquent, il n’est pas imprévisible qu’il puisse y avoir des difficultés à co-cristalliser certaines protéines cibles avec l’I3C.

Dans le domaine de la biologie structurale, la cristallographie aux rayons X est considérée comme la technique de l’étalon-or pour déterminer les structures de résolution atomique des macromolécules. Il a été largement utilisé pour comprendre la base moléculaire des maladies, guider des projets rationnels de conception de médicaments et élucider le mécanisme catalytique des enzymes1,2. Bien que les données structurelles fournissent une richesse de connaissances, le processus d’expression et de purification des protéines, de cristallisation et de détermination de la structure peut être extrêmement laborieux. Plusieurs goulets d’étranglement sont couramment rencontrés qui entravent l’avancement de ces projets et il faut s’y attaquer pour rationaliser efficacement le pipeline de détermination de la structure cristalline.
Après l’expression et la purification recombinantes, les conditions préliminaires propices à la cristallisation doivent être identifiées, ce qui est souvent un aspect ardu et long de la cristallographie aux rayons X. Des écrans matriciels clairsemés commerciaux qui consolident les conditions connues et publiées ont été développés pour atténuer ce goulotd’étranglement 3,4. Cependant, il est courant de générer peu de succès à partir de ces écrans initiaux en dépit de l’utilisation d’échantillons de protéines très pures et concentrées. L’observation de gouttes claires indique que la protéine peut ne pas atteindre les niveaux de sursaturation nécessaires pour nucléer un cristal. Pour encourager la nucléation et la croissance des cristaux, les graines produites à partir de cristaux préexistants peuvent être ajoutées aux conditions, ce qui permet un échantillonnage accru de l’espace de cristallisation. Ireton et Stoddard ont introduit pour la première fois la méthode de criblage de matrice microsécadavres 5. Des cristaux de mauvaise qualité ont été broyés pour faire un stock de graines, puis ajoutés systématiquement aux conditions de cristallisation contenant différents sels pour générer de nouveaux cristaux de qualité diffraction qui ne se seraient pas formés autrement. Cette technique a été encore améliorée par D’Arcy et coll. qui ont développé le criblage aléatoire de matrice de microseed (rMMS) dans lequel les graines ont été introduites dans un écran de cristallisation dematrice de rechange 6,7. Cela a amélioré la qualité des cristaux et augmenté le nombre de coups de cristallisation en moyenne d’un facteur de 7.
Une fois que les cristaux sont produits avec succès et un modèle de diffraction de rayon X est obtenu, un autre goulot d’étranglement sous la forme de résoudre le « problème de phase » est rencontré. Au cours du processus d’acquisition des données, l’intensité de la diffraction (proportionnelle au carré de l’amplitude) est enregistrée, mais l’information de phase est perdue, ce qui donne lieu au problème de phase qui arrête la détermination immédiate de la structure8. Si la protéine cible partage l’identité de séquence élevée à une protéine avec une structure précédemment déterminée, le remplacement moléculaire peut être employé pour estimer l’information de phase9,10,11,12. Bien que cette méthode soit rapide et peu coûteuse, les structures du modèle peuvent ne pas être disponibles ou appropriées. Le succès de la méthode de remplacement moléculaire basée sur le modèle d’homologie diminue considérablement à mesure que l’identité de la séquence tombe en dessous de 35% 13. En l’absence d’un modèle d’homologie approprié, des méthodes ab initio, telles que ARCIMBOLDO14,15 et AMPLE16, peuvent être testées. Ces méthodes utilisent des modèles ou des fragments prédits par calcul comme points de départ pour le remplacement moléculaire. AMPLE, qui utilise les modèles de leurre prévus comme points de départ, lutte pour résoudre les structures de grandes protéines (>100 résidus) et de protéines contenant principalement β feuilles. ARCIMBOLDO, qui tente d’insérer de petits fragments pour s’étendre dans une structure plus grande, est limité aux données haute résolution (≤2 Å) et par la capacité des algorithmes à étendre les fragments dans une structure complète.
Si les méthodes de remplacement moléculaire échouent, des méthodes directes telles que le remplacement isomorphe17,18 et la diffusion anormale à une seule longueur d’onde (SAD19) ou à plusieurs longueurs d’onde (MAD20) doivent être utilisées. C’est souvent le cas pour des structures vraiment nouvelles, où le cristal doit être formé ou dérivé avec un atome lourd. Ceci peut être réalisé en trempant ou en co-cristallisant avec un composé atome lourd, la modification chimique (telle que l’incorporation de 5-bromouracil dans l’ARN) ou l’expression étiquetée de protéine (telle que incorporer la sélénomethionine ou les acides aminés de selénocystéine dans la structure primaire)21,22. Cela complique encore le processus de cristallisation et nécessite un dépistage et une optimisation supplémentaires.
Une nouvelle classe de composés phasing, y compris I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acide) et B3C (5-amino-2,4,6-tribromoisophthalic acide), offrent des avantages passionnants par rapport aux composés préexistants23,24,25. I3C et B3C disposent d’un échafaudage aromatique avec un arrangement alternatif de dispersions anormales nécessaires pour les méthodes d’élimination progressive directe et les groupes fonctionnels aminés ou carboxylate qui interagissent spécifiquement avec la protéine et fournissent la spécificité du site contraignant. L’agencement triangulaire équilatéral subséquent des groupes de métaux lourds permet une validation simplifiée de la sous-structure d’élimination progressive. Au moment d’écrire ces lignes, il y avait 26 structures liées à l’I3C dans la Banque de données protéiques (PDB), dont 20 ont été résolues à l’aide de l’élimination progressive du TAS26.
Ce protocole améliore l’efficacité du pipeline de détermination de la structure en combinant les méthodes de dérivation des métaux lourds et de criblage rMMS afin d’augmenter simultanément le nombre de coups de cristallisation et de simplifier le processus de dérivation des cristaux. Nous avons démontré que cette méthode était extrêmement efficace avec le lysozyme de blanc d’oeuf de poule et un domaine d’une protéine nouvelle de lysine du bactériophage P6827. La solution de structure utilisant le pipeline hautement automatisé de détermination de structure d’auto-pousse-pousse est décrite, spécifiquement adaptée pour le composé de phasing d’I3C. Il existe d’autres pipelines automatisés qui peuvent être utilisés tels que AutoSol28, ELVES29 et CRANK230. Les paquets non entièrement automatisés tels que SHELXC/D/E peuvent également êtreutilisés 31,32,33. Cette méthode est particulièrement bénéfique pour les chercheurs qui étudient les protéines dépourvues de modèles homologues dans la PDB, en réduisant considérablement le nombre d’étapes de dépistage et d’optimisation. Une condition préalable à cette méthode est les cristaux protéiques ou un précipité cristallin de la protéine cible, obtenu à partir d’essais de cristallisation antérieurs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL disposable luer lock syringes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>T3SS10LAT</td>
			<td>Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used for hanging drop crystal tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-506</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22178</td>
			<td>Commonly referred to as I3C in the article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-297</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18X18-2</td>
			<td>Coverslips for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning vacuum grease</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-510</td>
			<td>Used for sealing hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette 0.1 &#956;L-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 2 &#956;L-20 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1153247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 20 &#956;L-200 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1152006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>HIR92601.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Approximately 95% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IndexHT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope illuminator</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>FT192/230</td>
			<td>Light source to illuminate crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/ION HT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Liquid Dispenser</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel with scalpel blade no. 15</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>LV-SMSCPO15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope&#160;</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>EMZ-5TR</td>
			<td>Microscope for visualising crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>RAVM1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening

L’élucidation de la structure protéique à l’aide de la cristallographie aux rayons X nécessite à la fois des cristaux de diffractation de haute qualité et une solution computationnelle du problème de phase de diffraction. Les nouvelles structures qui n’ont pas de modèle d’homologie approprié sont souvent dérivées d’atomes lourds pour fournir des informations expérimentales sur la phase. Le protocole présenté génère efficacement des cristaux de protéines dérivatisés en combinant le criblage aléatoire de matrice de microsédage avec la dérivation avec une molécule d’atome lourde I3C (acide 5-amiino-2,4,6-triiodoisophthalic). En incorporant l’I3C dans le treillis de cristal, le problème de phase de diffraction peut être résolu efficacement à l’aide de la dispersion anormale à longueur d’onde unique (TAS). L’arrangement trilatéral de triangle des atomes d’iode dans I3C permet la validation rapide d’une sous-structure anormale correcte. Ce protocole sera utile aux biologistes structurels qui résolvent les structures macromoléculaires à l’aide de techniques cristallisées qui s’intéressent à l’élimination progressive expérimentale.

L’intégration de l’I3C dans le SMMR peut générer de nouvelles conditions soutenant la croissance du cristal dérivatif L’efficacité du criblage simultané de rMMS et de la dérivation d’I3C a été démontrée dans deux protéines, le lysozyme blanc d’oeuf de poule (HEWL, obtenu comme poudre lyophilisée) et le domaine putatif de N-terminal d’Orf11 (Orf11 NTD) du bactériophage P68. Chaque protéine a été examinée contre PEG/ION HT dans quatre conditions différentes, y compris : non ensemencée, ensemencée, non ensemencée avec I3C et ensemencée avec I3C (figure 1). Pour les deux protéines, le seul ajout d’I3C n’a pas augmenté le nombre de conditions propices à la cristallisation. Dans le cas d’Orf11 NTD, une seule condition appropriée a été identifiée avec et sans I3C (Figure 1B). Lorsque l’I3C a été ajouté aux écrans HEWL, le nombre de visites a été réduit de 31 à 26, mettant en évidence les complexités supplémentaires de la cristallisation lors de l’introduction de composés de phasing (Figure 1A). Conformément à d’autres études, l’ajout de semences aux écrans matriciels clairsemés commerciaux pour générer un écran rMMS a considérablement augmenté le nombre de conditions de cristallisation possibles pour les deux protéines, ce qui a entraîné une augmentation de 2,1 et 6 fois pour hewl et orf11 NTD,respectivement 6,61 ( figure1). Plus important encore, l’ajout simultané d’I3C et de graines a augmenté le nombre de visites par rapport à un écran non ensemencé, démontrant une augmentation de 2,3 et 7 fois pour HEWL et Orf11 NTD, respectivement. Beaucoup de cristaux de rMMS en présence d’I3C montrent une excellente morphologie cristalline (Figure 2).
L’ensemencement permet un contrôle attentif du nombre de cristaux dans les écrans RMMS I3C Dans les expériences de microsédage, le nombre de graines introduites dans un essai de cristallisation peut être contrôlé par dilution du stock de graines, ce qui permet un contrôle précis de la nucléation dansla chute 7,36. Cela permet souvent la forme de cristaux plus gros puisqu’il y a une concurrence réduite des molécules protéiques sur les sites de nucléation. Cet avantage s’étend également à la méthode I3C-rMMS et a été démontré avec succès dans HEWL et Orf11 NTD. La reconstitution d’une condition de cristallisation identifiée à partir de l’écran I3C-rMMS avec un stock de graines diluées a donné moins de cristaux, mais plus gros (figure 3).
L’élimination progressive sad peut être utilisée pour résoudre les structures à partir de cristaux dérivés de l’écran RMMS I3C Les cristaux cultivés à l’aide du stock de graines diluées indiqué à la figure 3 ont été utilisés pour résoudre la structure des protéines à l’aide de l’élimination progressive du TAS à l’aide de données de diffraction à partir d’un seul cristal (figure 4). Les données ont été recueillies sur la ligne de faisceau Synchrotron MX1australienne 62. Des détails détaillés de la collecte de données et de la solution de structure sontdécrits ailleurs 27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig01.jpg"> Figure 1 - RMMS a été utilisé pour générer de nouvelles conditions de croissance du cristal en présence d’I3C pour deux protéines d’essai. 96 écrans de cristallisation de diffusion de vapeur de puits ont été effectués à l’aide d’écrans matriciels clairsemés commerciaux. (A) Lysozyme blanc d’œuf de poule a été testé avec l’écran Index HT. Les plateaux ont été ensemencés avec des cristaux HEWL cultivés en 0,2 M ammonium tartrate dibasic pH 7,0, 20% (w/v) polyéthylène glycol 3350. (B) Orf11 NTD du bactériophage P68 a été testé avec l’écran PEG/ION. Les plateaux Orf11 NTD ont été ensemencés à partir de cristaux de l’état G12 de l’écran non ensemencé, montré en bleu. Les conditions soutenant la croissance du cristal sont indiquées en rouge. l’ensemencement rMMS en présence et en l’absence d’I3C a donné beaucoup plus de coups de cristal que les plateaux non ensemencés. Figure adaptée de Truong et coll.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig01large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig02.jpg"> Figure 2 - Images représentatives de cristaux cultivés à partir des essais de diffusion de vapeur montrés à la figure 1 (a) et (b). Figure adaptée de Truong et coll.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig02large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig03.jpg"> Figure 3 - La dilution du stock de graines est un moyen efficace de réduire la nucléation dans un état de cristallisation trouvé en utilisant la méthode I3C-rMMS, pour contrôler le nombre de cristaux qui se forment. La réduction de la nucléation à l’intérieur d’une goutte entraîne souvent la croissance des cristaux vers de plus grandes dimensions. Figure adaptée de Truong et coll.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig03large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig04.jpg"> Figure 4 - Orf11 NTD (PDB ID 6O43) et HEWL (PDB ID 6PBB) ont été cristallisés à l’aide de la méthode I3C-rMMS et résolus à l’aide de l’auto-pousse-pousse SAD phasing. (A) Structures de ruban de HEWL et Orf11 NTD résolu par l’élimination progressive expérimentale. (B) Molécule I3C liée à HEWL et Orf11 NTD. (C) Des atomes d’iode anormaux en I3C sont disposés dans un triangle équilatéral de 6 Å. Ainsi, la présence de ce triangle dans la sous-structure progressive indique qu’il y a une molécule I3C dans cette position. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61984fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Cet article présente une méthode pour générer des cristaux protéiques dérivés de l’I3C (acide 5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic) utilisant le microsédage pour générer de nouvelles conditions de cristallisation dans des écrans matriciels clairsemés. Les plateaux peuvent être mis en place à l’aide de robots de distribution liquide ou à la main.

Dérivation des cristaux protéiques avec I3C à l’aide du criblage aléatoire de matrice microséeed

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Il s’agit d’un protocole de cristallisation conçu pour optimiser la croissance d’un cristal protéique tout en dérivant simultanément la protéine avec une molécule progressive pour déterminer la structure d’une protéine par cristallographie aux rayons X. Pour déterminer la structure cristalline des rayons X d’une protéine complètement nouvelle, les conditions de cristallisation sont optimisées pour produire des cristaux de qualité. Dans le cas d’une protéine complètement nouvelle, des atomes lourds doivent être introduits dans le cristal pour produire un cristal dérivatisé.Les données de diffraction des rayons X sont recueillies à partir du cristal dérivatisé et doivent être résolues par calcul pour produire une structure cristalline à rayons X. La cristallisation et la dérivation sont deux processus laborieux. Pour remédier à ces goulets d’étranglement, nous avons mis au point une procédure de dépistage optimisée qui atteint simultanément ces deux objectifs.Ce protocole utilise une technique précédemment développée connue sous le nom de criblage aléatoire de matrice de microsérage. Les cristaux ou le précipité cristallin sont broyés en microsé-oeds qui peuvent être utilisés pour commencer la croissance du cristal dans des conditions complètement indépendantes. Dans le même temps, nous introduisons une molécule progressive appelée I3C dans l’état de cristallisation.Cette molécule fournit un grand signal anormal qui permet à la structure d’être résolue par une seule longueur d’onde anormaux discussion progressive. Pour les utilisateurs peu familiers avec le dimensionnement expérimental des structures cristallines, nous présentons un pipeline logiciel convivial pour automatiser partiellement la solution de structure en l’adaptant pour utiliser le signal anormal d’I3C. La première étape consiste à créer un stock I3C.Mesurez 120 milligrammes d’I3C dans un tube de microcentrifugeuse. Ajouter 200 microlitres de deux hydroxyde de lithium molaire au tube de microcentrifugeuse. Le chauffage du tube à 40 à 60 degrés et le vortex peuvent être utilisés pour encourager la dissolution.Le seul stock molaire de solution lithium I3C doit être brun. Deux méthodes peuvent être utilisées pour introduire l’I3C dans le stock de protéines. Lithium I3C peut être ajouté directement au stock de protéines.3,75 microlitres à 30 microlitres d’I3C peuvent être ajoutés à 150 microlitres de protéines pour donner une concentration entre cinq et 14 millimolaires. Certaines protéines peuvent se précipiter au contact de fortes concentrations d’I3C. Dans ces cas, le lithium I3C peut être ajouté à un tampon de dilution des protéines qui est tampon correspondait à la protéine échantillon à une concentration finale entre 10 à 80 millimolar.Ajouter 150 microlitres du tampon de dilution des protéines à 150 microlitres d’échantillon de protéines. Une sonde en verre pour écraser les cristaux est faite à partir d’une pipette pasteur en verre. Avec un brûleur Bunsen sur la flamme bleue, chauffer la pipette Pasteur vers le milieu.À l’aide d’une pince à épiler, tirez les extrémités de la pipette Pasteur dans un diamètre mince de moins de 0,3 millimètre. Maintenez ce segment dans la flamme pour séparer la pipette à ce stade et autour de l’extrémité de la pipette pour terminer la sonde de verre. C’est un exemple de la façon dont la pipette en verre devrait ressembler.Les écrasements de cristal peuvent également être commandés auprès de fournisseurs tiers comme une alternative à la fabrication de votre propre stock de microseed A est généré par l’écrasement de cristaux de protéines ou de précipité cristallin. Placer cinq tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL sur la glace. Sous un microscope léger, sélectionnez les meilleurs cristaux de morphologie ou précipité cristallin qui peuvent être sacrifiés.Pour 96 plateaux de cristallisation bien ouvrir le puits en coupant le ruban d’étanchéité en plastique. Pour les bacs suspendus, le bordereau de couvercle peut être enlevé à l’aide d’une pince à épiler et inversé sur une surface plane. Transférer 70 microlitres de solution de réservoir à l’un des tubes de microcentrifugeuse et réfrigérer sur la glace.Vers les tubes restants, transférez 90 microlitres de solution de réservoir et retournez à la glace pour refroidir. Si le volume insuffisant du réservoir est présent réservoir de cristallisation peut être faite en mélangeant les reagents appropriés et peut être utilisé à la place. Agiter les cristaux dans la chute de cristallisation à l’aide de la sonde de verre bien l’écraser.Les progrès peuvent être surveillés au microscope jusqu’à ce qu’aucun cristal ou matériau cristallin ne soit visible. Transférer tout le liquide de la goutte au tube de microcentrifugeuse contenant 70 microlitres de solution de réservoir. Mélanger en pipetant de haut en bas.Transférer deux à trois microlitres de mélange au puits et rincer le puits en faisant monter et descendre. Transférer le mélange dans le tube de microcentrifugeuse. Cette étape de rinçage doit être répétée une fois de plus.Le tube de microcentrifugeuse doit être maintenu au froid à partir de ce point vers l’avant pour éviter de faire fondre les microseeds. Vortex le tube à vitesse maximale à quatre degrés pendant environ trois minutes refroidissant le tube sur la glace régulièrement pour éviter la surchauffe. faire une dilutions périodiques sur 10 du stock de semences en transférant séquentiellement 10 microlitres entre les solutions de réservoir réfrigérées.Entre les dilutions du stock de graines, le tube doit être vortexé. Les stocks de semences qui ne seront pas immédiatement utilisés doivent être conservés dans un congélateur ultra froid de moins 80 degrés. Un écran matricielle à microseed bien aléatoire peut être installé à l’aide d’un robot de distribution liquide.Placez le stock de graines, la solution de stock de protéines complétée par l’I3C et l’écran de cristallisation dans le robot. À l’aide du robot, transférer 75 microlitres de l’écran de cristallisation vers le plateau de 96 puits. Ajouter un microlitre à la goutte de cristallisation et 74 microlitres au réservoir.Transférer un microlitre de protéines complété par l’I3C à la goutte de cristallisation. Transférer 0,1 microlitre de bouillon de graines à la goutte de cristallisation. Sceller la plaque à l’aide de ruban adhésif.Des écrans de chute suspendus peuvent être mis en place dans 24 bacs de cristallisation de chute bien suspendus. Graisser les bords des puits suspendus. Transférer 500 microlitres de solution de cristallisation vers le réservoir.Près du centre d’une glissière de couverture en verre placer une goutte d’un microlitre de solution de cristallisation. À cette goutte, ajouter un microlitre de protéines complétée par du lithium I3C et 0,1 microlitre de bouillon de graines. Inversez la glissière du couvercle et scellez bien la cristallisation en poussant la glissière du couvercle dans la graisse.Les bacs suspendus de chute et d’étanchéité sont incubés à une température constante pour permettre aux cristaux de se former. Ils doivent être inspectés régulièrement au microscope pour la croissance des cristaux. Une fois que les données de diffraction ont été obtenues, intégrées et mises à l’échelle comme expliqué dans le protocole écrit accompagné, le pipeline automatisé de détermination de la structure cristalline Auto-Rickshaw peut être utilisé pour résoudre le problème de phase et modéliser la protéine.À la page de destination Auto-Rickshaw, cliquez sur le bouton procéder. Entrez votre e-mail institutionnel dans le formulaire Web Auto-Rickshaw et cliquez sur procéder à l’exécution auto-pousse-pousse. Pour les protéines sans modèle de moto homologie exécuter le protocole SAD de Auto-Rickshaw en mode avancé.Entrez les paramètres requis. Sélectionnez la protéine comme type de molécule. Entrez la longueur d’onde de collecte de données dans angstroms.Donc, comme moi comme élément de sous-structure pour indiquer les atomes d’iode ont été utilisés. Sélectionnez le type de sous-structure I3C pour indiquer que l’I3C était la molécule qui s’est progressivement mise en œur. Sélectionnez sub_direct méthode de détermination de la sous-structure.Sélectionnez trois comme nombre de sous-structures prévues par monomère. Entrez-en un comme seuil de réservation de la recherche de sous-structure. Cela permet à Auto-Rickshaw de déterminer automatiquement une coupure de résolution appropriée.Entrez le nombre de résidus dans un seul monomère, le groupe spatial de l’ensemble de données et le nombre de molécules dans l’unité asymétrique en fonction du coefficient de Matthews. Sélectionnez le niveau de diffusion approprié des données radiographiques qui conviennent à vos besoins. Entrez les données anormales sous la forme d’un fichier vide.Entrez votre séquence protéique sous forme de fichier SEQ, PIR ou TXT. Entrez votre adresse e-mail institutionnelle. Les résultats vous sont livrés via un lien Web envoyé à l’adresse e-mail fournie.Si Auto-Rickshaw ne parvient pas à résoudre la structure à l’aide de sa sous-structure déterminée validant la sous-structure pourrait aider à résoudre la solution de structure de dépannage. Téléchargez la liste des sites d’atomes lourds à partir de la page de résultats Auto-Rickshaw. Il s’agit d’un hyperlien appelé sites d’atome lourd.Cela permettra de télécharger un fichier texte avec les sites d’atomes lourds. Modifiez l’extension de fichier du fichier de txt à pdb. Ouvrez le fichier pdb dans Coot.Activez la symétrie pour voir tous les atomes lourds des unités asymétriques voisines. Mesurer les distances entre les atomes lourds, y compris à travers les unités asymétriques. I3C apparaîtra comme un triangle équilatéral avec une longueur latérale de six angstroms.La présence d’un triangle avec ces dimensions indique que les emplacements de ces atomes lourds sont corrects. Si la sous-structure auto-pousse-pousse est incorrecte, d’autres paramètres auto-pousse-pousse peuvent être testés comme discuté dans le protocole écrit. La méthode I3C RMMS a été testée sur deux protéines, le lysozyme blanc d’œuf de poule utilisant l’écran HT de Hampton Research et le domaine de la protéine de lysine Orf11 du bactériophage P68.Des écrans pleins ont été mis en place pour chaque protéine correspondant à l’écran de contrôle sans I3C ou microséc, écran avec microseed ajouté, écran avec I3C, et enfin l’écran avec I3C et microseed. L’ajout d’I3C à un écran en cristal ne semble pas augmenter le nombre de coups de cristallisation. Avec le lysozyme blanc d’œuf de poule, le nombre de conditions est passé de 31 à 26.Avec le domaine Orf11, une seule condition de coup a été trouvée dans l’écran de contrôle. L’ajout d’I3C à l’écran a également donné un seul coup dans les mêmes conditions. L’ajout de microsémés au puits a entraîné une augmentation significative du nombre de conditions de frappe, ce qui a entraîné une augmentation de 2,1 et six fois pour le lysozyme de blanc d’œuf de poule et le domaine Orf11 respectivement.Ce résultat est compatible avec d’autres études testant RMMS. Plus important encore, l’ajout d’I3C et de microsémors à un écran a également augmenté le nombre de conditions de frappe par rapport à l’écran de contrôle démontrant une augmentation de 2,3 et sept fois pour le lysozyme blanc d’œuf de poule et le domaine Orf11 respectivement. Cela démontre que la méthode I3C RMMS peut produire efficacement de nouvelles conditions pour les cristaux dérivés.Les cristaux de ces conditions pourraient être récoltés et utilisés pour résoudre la structure cristalline. La structure du domaine orf11 du blanc d’œuf de poule pourrait être résolue avec l’élimination progressive du TAS sur le pipeline Auto-Rickshaw, en utilisant le signal anormal d’I3C démontrant une dérivation réussie par l’écran I3C RMMS. Nous avons présenté un protocole simple et efficace pour produire des cristaux de haute qualité dérivés de la molécule d’élimination progressive I3C.Il minimise le nombre d’écrans et les étapes de manipulation cristalline, et est donc d’un intérêt particulier pour les biologistes structurels qui étudient de nouvelles protéines. Nous recommandons fortement d’optimiser la taille des cristaux en testant différentes dilutions des stocks de semences qui ont été faites pendant la préparation des stocks de semences. Et cette étape est terminée après que les écrans initiaux ont été faits.I3C est largement disponible et il est peu coûteux à acheter et donc nous croyons que cette méthode est à la portée de la plupart des laboratoires de biologie structurelle.

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