Name: derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening
Uploaded: 2021-01-16T15:00:00
Duration: 14 min 4 s
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Diese Forschung wurde an der MX1-Beamline am Australian Synchrotron, einem Teil von ANSTO, durchgeführt. Die Autoren möchten die Mitglieder der Laboratorien Shearwin und Bruning für die Diskussionen über diese Arbeit würdigen. Die Autoren möchten auch Dr. Santosh Panjikar und Dr. Linda Whyatt-Shearwin würdigen, die zu der ursprünglichen Arbeit beigetragen haben, die dieses Protokoll als Pioniere war.
Folgende Finanzierung wird anerkannt: Australian Research Council (Grant No. DP150103009 und DP160101450 an Keith E. Shearwin); University of Adelaide (Australian Government Research Training Program Stipendium an Jia Quyen Truong und Stephanie Nguyen).

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Strukturbestimmung eines neuartigen Proteins in Ermangelung eines geeigneten Homologiemodells für den molekularen Ersatz erfordert eine experimentelle Phasing. Diese Methoden erfordern die Einbindung schwerer Atome in den Proteinkristall, was der Strukturbestimmungspipeline eine zusätzliche Komplexität verleiht und zahlreiche Hindernisse mit sich bringen kann, die angegangen werden müssen. Schwere Atome können durch etikettierte Expression mit Selenomethionin und Selenocystein direkt in das Protein eingearbeitet werden. Da diese Methode kostspielig, mühsam ist und zu niedrigeren Proteinerträgen führen kann, wird markiertes Protein oft ausgedrückt, nachdem Kristallisationsbedingungen gefunden und mit nicht gekennzeichnetem Protein optimiert wurden. Alternativ können Kristalle durch Einweichen in eine Lösung mit schweren Atomen22,63,64absaugt werden. Diese Methode verwendet häufig hochwertige Kristalle und wird daher durchgeführt, nachdem bereits eine robuste Kristallisationsmethode entwickelt wurde. Die erfolgreiche Beschaffung eines derivatisierten Kristalls mit dieser Methode erfordert eine weitere Optimierung der Einweichverfahren und das Screening verschiedener Phasing-Verbindungen, wodurch einem bereits mühsamen Prozess mehr Zeit eingezäutt wird.
Die Kokristallisation des Proteins mit dem schweren Atom kann im Screening-Stadium durchgeführt werden, wodurch der Prozess effizient gestrafft und Kristallmanipulationsschritte reduziert werden, die Schäden verursachen können. Es gibt jedoch immer noch das mögliche Szenario, nur wenige anfängliche Kristallisationstreffer zu erhalten, und das Problem der Wahl einer kompatiblen schweren Atomverbindung. Viele derzeit verfügbare Phasing-Compounds sind inkompatibel mit Niederschlagsmitteln, Puffern und Additiven, die häufig unter Kristallisationsbedingungen zu finden sind. Sie können in Sulfat- und Phosphatpuffern unlöslich sein, zu Citrat und Acetat chelaten, ungünstig mit HEPES- und Tris-Puffern reagieren oder sich durch DTT und β-Mercaptoethanol21sequestrieren lassen. Da die Phasing-Verbindung I3C nicht unter diesen Inkompatibilitäten leidet, ist es eine robuste Phasing-Verbindung, die für viele verschiedene Bedingungen zugänglich sein könnte.
In dieser Studie wird eine schlanke Methode zur Herstellung von derivatisierten Kristallen vorgestellt, die für die SAD-Phasing durch gleichzeitige Kokristallisation der I3C-Phasing-Verbindung und rMMS bereit sind. Die Kombination beider Techniken erhöht die Anzahl der Kristallisationstreffer, wobei viele der Bedingungen eine verbesserte Morphologie und Beugungseigenschaften aufweisen. In orf11 NTD- und HEWL-Testfällen wurden neue Bedingungen im I3C-rMMS-Bildschirm identifiziert, die fehlten, als I3C nicht vorhanden war. Potenziell kann I3C günstig an das Protein binden, was die Bildung und Stabilisierung von Kristallkontakten erleichtert27. Dies wiederum kann Kristallisation induzieren und möglicherweise die Beugungseigenschaften verbessern. I3C ist nicht nur eine Verbindung, die mit spärlichen Matrix-Bildschirmen kompatibel ist, sondern ist aufgrund seiner intrinsischen Eigenschaften auch eine attraktive Phasing-Verbindung. Die funktionellen Gruppen, die sich mit Jod auf dem aromatischen Ringgerüst abwechseln, ermöglichen eine spezifische Bindung an Proteine. Dies führt zu einer höheren Belegung und reduziert möglicherweise das Hintergrundsignal23. Darüber hinaus ist die Anordnung anomaler Streuer in einem gleichseitigen Dreieck im Unterbau offensichtlich und kann verwendet werden, um die Bindung von I3C schnell zu validieren (Abbildung 4B und 4C). Schließlich kann es ein anomales Signal mit abstimmbarer Synchrotronstrahlung sowie Chrom- und Kupfer-rotierenden Anoden-Röntgenquellen erzeugen. Somit kann es auf viele verschiedene Workflows angewendet werden. Da I3C weit verbreitet und kostengünstig zu erwerben ist, ist dieser Ansatz für die meisten laboratorien für Strukturbiologie in Reichweite.
Es gibt mehrere experimentelle Überlegungen, die bei der Verwendung der I3C-rMMS-Methode berücksichtigt werden müssen. Diese Methode kann nicht angewendet werden, wenn das ursprüngliche kristalline Material des Proteins nicht gewonnen werden kann. In schwierigen Fällen kann kristallines Material aus einem homologen Protein auch zur Erzeugung von Saatgutverwendet werden. Dieser Cross-Seeding-Ansatz für rMMS hat einige vielversprechende Ergebnisse gezeigt7. Die Optimierung der Kristallzahl durch Verdünnung des Saatgutbestands ist ein entscheidender Schritt, der nicht übersehen werden sollte, um die Chance zu maximieren, hochwertige große Kristalle zu produzieren und geeignete Beugungsdaten zu erhalten. Wenn in der asymmetrischen Einheit nur wenige I3C-Standorte identifiziert werden, sollten die für die Kristallisation förderlichen Bedingungen mit einer erhöhten Konzentration von I3C weiter optimiert werden. Dies kann die Belegung von I3C erhöhen, um das anomale Signal zu maximieren und die Kristallableitung zu unterstützen.
Es kann Fälle geben, in denen diese Technik möglicherweise nicht die optimale Methode zur Ableitung von Proteinkristallen ist. Da die Größe eines Protein- oder Proteinkomplexes zunimmt, bietet die begrenzte Anzahl von I3C-Standorten auf der Proteinoberfläche möglicherweise nicht genügend Phasing Power, um die Struktur zu lösen. In diesen Szenarien, in denen die Proteingröße im Verdacht steht, die Phasing-Zeit zu behindern, kann die Selenomethionin-Kennzeichnung des Proteins ein praktikablerer Ansatz für die Phasing des Proteins sein. Wenn das Protein eine ausreichende Anzahl von Methioninrückständen im Protein aufweist (empfohlen mit mindestens einem Methionin pro 100 Rückstände65) und eine hocheffiziente Selenomethionin-Inkorporation in ein Protein erreicht werden kann (z. B. in bakteriellen Expressionssystemen66), werden mehrere Selenatome mit hoher Belegung in den Kristallen vorhanden sein, um die Struktur zu phasen.
Darüber hinaus können einige Proteine von Natur aus ungeeignet für die Ableitung mit I3C sein. I3C-Bindungsstellen an Proteinen sind von der Proteinstruktur abhängig. Es kann Proteine geben, die natürlich nur wenige exponierte Pflaster haben, die mit der I3C-Bindung kompatibel sind. Daher ist es nicht unvorhersehbar, dass es Schwierigkeiten bei der Kokristallisation einiger Zielproteine mit I3C geben kann.

Im Bereich der Strukturbiologie gilt die Röntgenkristallographie als die Goldstandardtechnik zur Bestimmung der atomaren Auflösungsstrukturen von Makromolekülen. Es wurde ausgiebig genutzt, um die molekulare Basis von Krankheiten zu verstehen, rationale Arzneimitteldesign-Projekte zu leiten und den katalytischen Mechanismus der Enzyme1,2aufzuklären. Obwohl Strukturelle Daten eine Fülle von Wissen liefern, kann der Prozess der Proteinexpression und -reinigung, Kristallisation und Strukturbestimmung äußerst mühsam sein. Häufig treten mehrere Engpässe auf, die den Fortschritt dieser Projekte behindern, und dies muss angegangen werden, um die Pipeline zur Bestimmung der Kristallstruktur effizient zu rationalisieren.
Nach rekombinanter Expression und Reinigung müssen vorgegebene Bedingungen identifiziert werden, die der Kristallisation förderlich sind, was oft ein mühsamer und zeitaufwändiger Aspekt der Röntgenkristallographie ist. Kommerzielle spärliche Matrix-Bildschirme, die bekannte und veröffentlichte Bedingungen konsolidieren, wurden entwickelt, um diesen Engpass zu lindern3,4. Es ist jedoch üblich, trotz der Verwendung von hochreinen und konzentrierten Proteinproben nur wenige Treffer aus diesen Anfangsbildschirmen zu generieren. Die Beobachtung klarer Tropfen deutet darauf hin, dass das Protein möglicherweise nicht die Übersättigungswerte erreicht, die erforderlich sind, um einen Kristall zu nukleieren. Um die Kristallkernbildung und das Wachstum zu fördern, können Samen aus bereits vorhandenen Kristallen zu den Bedingungen hinzugefügt werden, was eine erhöhte Probenahme des Kristallisationsraums ermöglicht. Ireton und Stoddard führten erstmals das Mikrosaat-Matrix-Screening-Verfahren5ein. Minderwertige Kristalle wurden zerkleinert, um einen Samenbestand herzustellen, und dann systematisch zu Kristallisationsbedingungen hinzugefügt, die verschiedene Salze enthalten, um neue Kristalle in Beugungsqualität zu erzeugen, die sich sonst nicht gebildet hätten. Diese Technik wurde weiter verbessert durch D'Arcy et al., die zufälliges Mikrosaatmatrix-Screening (rMMS) entwickelten, bei dem Samen in einen Ersatzmatrixkristallisationssieb 6,7eingeführt wurden. Dies verbesserte die Qualität der Kristalle und erhöhte die Anzahl der Kristallisationstreffer im Durchschnitt um den Faktor 7.
Nachdem Kristalle erfolgreich hergestellt und ein Röntgenbeugungsmuster erhalten ist, tritt ein weiterer Engpass in Form der Lösung des "Phasenproblems" auf. Während des Datenerfassungsprozesses wird die Intensität der Beugung (proportional zum Quadrat der Amplitude) aufgezeichnet, aber die Phaseninformationen gehen verloren, was zu dem Phasenproblem führt, das die sofortige Strukturbestimmungstoppt 8. Wenn das Zielprotein eine hohe Sequenzidentität zu einem Protein mit einer zuvor festgelegten Struktur teilt, kann der molekulare Ersatz verwendet werden, um die Phaseninformationen9,10,11,12zu schätzen. Obwohl diese Methode schnell und kostengünstig ist, sind Modellstrukturen möglicherweise nicht verfügbar oder ungeeignet. Der Erfolg der homologischen modellbasierten molekularen Ersatzmethode sinkt deutlich, da die Sequenzidentität unter 35%13fällt. In Ermangelung eines geeigneten Homologiemodells können ab initio Methoden wie ARCIMBOLDO14,15 und AMPLE16getestet werden. Diese Methoden verwenden rechnerisch vorhergesagte Modelle oder Fragmente als Ausgangspunktfürbeinen für den molekularen Ersatz. AMPLE, das vorhergesagte Ködermodelle als Ausgangspunkte verwendet, kämpft darum, Strukturen großer (>100 Rückstände) Proteine und Proteine zu lösen, die überwiegend β-Blätter enthalten. ARCIMBOLDO, das versucht, kleine Fragmente in eine größere Struktur zu passen, ist auf hochauflösende Daten (≤2) und durch die Fähigkeit von Algorithmen beschränkt, die Fragmente zu einer vollständigen Struktur zu erweitern.
Wenn molekulare Ersatzmethoden fehlschlägt, müssen direkte Methoden wie isomorpher Ersatz17,18 und anomale Streuung bei einer einzigen Wellenlänge (SAD19) oder mehreren Wellenlängen (MAD20) verwendet werden. Dies ist oft der Fall bei wirklich neuartigen Strukturen, bei denen der Kristall mit einem schweren Atom gebildet oder ableitungen muss. Dies kann durch Einweichen oder Kokristallisieren mit einer schweren Atomverbindung, chemische Modifikation (wie 5-Bromouracil-Inkorporation in RNA) oder markierte Proteinexpression (wie die Einbeziehung von Selenomethionin oder Selenocystein-Aminosäuren in die primäre Struktur) erreicht werden21,22. Dies erschwert den Kristallisationsprozess zusätzlich und erfordert zusätzliches Screening und Optimierung.
Eine neue Klasse von Phasing-Verbindungen, einschließlich I3C (5-Amino-2,4,6-Triiodoisophthalsäure) und B3C (5-Amino-2,4,6-Tribromoisophthalsäure), bieten spannende Vorteile gegenüber bereits bestehenden Phasing-Verbindungen23,24,25. Sowohl I3C als auch B3C verfügen über ein aromatisches Ringgerüst mit einer abwechselnden Anordnung von anomalen Streuungen, die für direkte Phasing-Methoden und Amino- oder Carboxylat-Funktionsgruppen erforderlich sind, die speziell mit dem Protein interagieren und eine Bindungs-Standortspezifität bieten. Die anschließende gleichseitige dreieckige Anordnung von Schwermetallgruppen ermöglicht eine vereinfachte Validierung des phasing-Unterbaus. Zum Zeitpunkt des Schreibens gibt es 26 I3C-gebundene Strukturen in der Protein Data Bank (PDB), von denen 20 mit SAD phasing26gelöst wurden.
Dieses Protokoll verbessert die Wirksamkeit der Strukturbestimmungspipeline, indem die Methoden der Schwermetall-Derivatisierung und des rMMS-Screenings kombiniert werden, um gleichzeitig die Anzahl der Kristallisationstreffer zu erhöhen und den Kristallderivatisierungsprozess zu vereinfachen. Wir haben gezeigt, dass diese Methode extrem effektiv mit Hühnerei-Weiß-Lysozym und einer Domäne eines neuartigen Lysinproteins aus Bakteriophagen P6827ist. Die Strukturlösung mit der hochautomatisierten Auto-Rickshaw-Strukturbestimmungspipeline wird speziell auf die Phasing-Verbindung I3C zugeschnitten beschrieben. Es gibt andere automatisierte Pipelines, die verwendet werden können, wie AutoSol28, ELVES29 und CRANK230. Nicht vollautomatisierte Pakete wie SHELXC/D/E können auch31,32,33verwendet werden. Diese Methode ist besonders vorteilhaft für Forscher, die Proteine ohne homologe Modelle im PDB untersuchen, indem sie die Anzahl der Screening- und Optimierungsschritte signifikant reduziert. Voraussetzung für diese Methode sind Proteinkristalle oder ein kristalliner Niederschlag des Zielproteins, das aus früheren Kristallisationsversuchen gewonnen wurde.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL disposable luer lock syringes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>T3SS10LAT</td>
			<td>Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used for hanging drop crystal tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-506</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22178</td>
			<td>Commonly referred to as I3C in the article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-297</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18X18-2</td>
			<td>Coverslips for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning vacuum grease</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-510</td>
			<td>Used for sealing hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette 0.1 &#956;L-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 2 &#956;L-20 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1153247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 20 &#956;L-200 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1152006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>HIR92601.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Approximately 95% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IndexHT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope illuminator</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>FT192/230</td>
			<td>Light source to illuminate crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/ION HT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Liquid Dispenser</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel with scalpel blade no. 15</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>LV-SMSCPO15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope&#160;</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>EMZ-5TR</td>
			<td>Microscope for visualising crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>RAVM1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening

Die Proteinstrukturaufklärung mittels Röntgenkristallographie erfordert sowohl hochwertige diffrierende Kristalle als auch eine rechnerische Lösung des Beugungsphasenproblems. Neuartige Strukturen, denen ein geeignetes Homologiemodell fehlt, werden oft mit schweren Atomen ableitungsiert, um experimentelle Phaseninformationen zu liefern. Das vorgestellte Protokoll erzeugt effizient derivatisierte Proteinkristalle, indem zufälliges Mikrosaating-Matrix-Screening mit Derivatisierung mit einem schweren Atommolekül I3C (5-Amino-2,4,6-Triiodoisophthalsäure) kombiniert wird. Durch die Einbindung von I3C in das Kristallgitter kann das Problem der Beugungsphase effizient mit einer einzigen Wellenlängen-Anomaldispersion (SAD) gelöst werden. Die gleichseitige Dreiecksanordnung von Jodatomen in I3C ermöglicht eine schnelle Validierung einer korrekten anomalen Unterkonstruktion. Dieses Protokoll wird für Strukturbiologen nützlich sein, die makromolekulare Strukturen mit kristallographischen Techniken lösen, die an experimentellem Phasing interessiert sind.

Die Integration von I3C in rMMS kann neue Bedingungen generieren, die das derivatisierte Kristallwachstum unterstützen Die Wirksamkeit des gleichzeitigen rMMS-Screenings und der I3C-Derivatisierung wurde in zwei Proteinen nachgewiesen, in Dem Eiweißlysozym (HEWL, als lyophilisiertes Pulver gewonnen) und der vermeintlichen Orf11-Lysin-N-Terminal-Domäne (Orf11 NTD) aus Bakteriophagen P68. Jedes Protein wurde gegen PEG/ION HT unter vier verschiedenen Bedingungen gescreent, darunter: ungesättigt, gesät, mit I3C ungesät und mit I3C gesät (Abbildung 1). Bei beiden Proteinen erhöht die einzige Zugabe von I3C nicht die Anzahl der Bedingungen, die der Kristallisation förderlich sind. Im Fall von Orf11 NTD wurde nur eine geeignete Bedingung mit und ohne I3C identifiziert (Abbildung 1B). Als I3C den HEWL-Bildschirmen hinzugefügt wurde, wurde die Anzahl der Treffer von 31 auf 26 reduziert, was die zusätzlichen Komplexitäten der Kristallisation bei der Einführung von Phasing-Compounds hervorhebt (Abbildung 1A). In Übereinstimmung mit anderen Studien erhöhte das Hinzufügen von Saatgut zu kommerziellen spärlichen Matrix-Bildschirmen, um einen rMMS-Bildschirm zu erzeugen, die Anzahl der möglichen Kristallisationsbedingungen für beide Proteine signifikant, was zu einer 2,1- und 6-fachen Erhöhung für HEWL und Orf11 NTD bzw.6,61 (Abbildung 1) führte. Am wichtigsten ist, dass die gleichzeitige Zugabe von I3C und Saatgut die Anzahl der Treffer im Vergleich zu einem nicht gesäten Bildschirm erhöhte, was eine 2,3- bzw. 7-fache Erhöhung für HEWL bzw. Orf11 NTD zeigt. Viele der Kristalle von rMMS in Gegenwart von I3C zeigen eine ausgezeichnete Kristallmorphologie (Abbildung 2).
Seeding ermöglicht eine sorgfältige Kontrolle der Kristallzahl in I3C rMMS-Bildschirmen In Mikrosaatierungsexperimenten kann die Anzahl der Samen, die in eine Kristallisationsstudie eingeführt werden, durch Verdünnung des Samenbestands gesteuert werden, was eine präzise Kontrolle der Keimbildung im Tropfen7,36ermöglicht. Dies ermöglicht oft die Bildung größerer Kristalle, da der Wettbewerb von Proteinmolekülen an Keimbildungsstätten eingeschränkt ist. Dieser Vorteil erstreckt sich auch auf die I3C-rMMS-Methode und wurde sowohl in HEWL als auch in Orf11 NTD erfolgreich nachgewiesen. Die Nachbildung eines Kristallisationszustandes, der vom I3C-rMMS-Bildschirm mit einem verdünnten Saatgutbestand identifiziert wurde, ergab weniger, aber größere Kristalle(Abbildung 3).
SAD Phasing kann verwendet werden, um die Strukturen aus Kristallen aus rMMS I3C Bildschirm abgeleitet zu lösen Kristalle, die mit dem in Abbildung 3 dargestellten verdünnten Saatgut angebaut wurden, wurden verwendet, um die Struktur der Proteine mithilfe von SAD-Phasing mit Beugungsdaten aus einem einzigen Kristall zu lösen ( Abbildung4). Daten wurden über die australische Synchrotron MX1 Beamline62gesammelt. Detaillierte Details zur Datenerfassung und Strukturlösung werden an anderer Stelle beschrieben27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig01.jpg"> Abbildung 1: rMMS wurde verwendet, um neue Bedingungen für das Kristallwachstum in Gegenwart von I3C für zwei Testproteine zu erzeugen. 96 Well-Dampf-Diffusionskristallisationssiebe wurden mit kommerziellen spärlichen Matrix-Sieben durchgeführt. (A) Hen Eiweiß-Lysozym wurde mit dem Index HT-Bildschirm getestet. Die Schalen wurden mit HEWL-Kristallen aus 0,2 M Ammoniumtartrat-Dibasis-pH 7,0, 20 % (w/v) Polyethylenglykol 3350 gesät. (B) Orf11 NTD aus Bakteriophagen P68 wurde mit dem PEG/ION-Bildschirm getestet. Orf11 NTD-Trays wurden aus Kristallen aus dem Zustand G12 aus dem nicht ausgesäten Sieb gesät, blau dargestellt. Bedingungen, die das Kristallwachstum unterstützen, sind rot dargestellt. rMMS-Saat in Gegenwart und Abwesenheit von I3C gab sowohl deutlich mehr Kristalltreffer als ungesättigte Schalen. Figur angepasst von Truong et al.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig02.jpg"> Abbildung 2 : Repräsentative Bilder von Kristallen, die aus den Dampfdiffusionsversuchen in Abbildung 1 a) und b) herangewachsen sind. Figur angepasst von Truong et al.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig03.jpg"> Abbildung 3: Die Verdünnung des Saatgutbestands ist ein effektiver Weg, um die Keimbildung in einem Kristallisationszustand zu reduzieren, der mit der I3C-rMMS-Methode gefunden wurde, um die Anzahl der Kristalle zu kontrollieren, die sich bilden. Die Reduzierung der Keimbildung innerhalb eines Tropfens führt oft dazu, dass Kristalle zu größeren Dimensionen wachsen. Figur angepasst von Truong et al.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig04.jpg"> Abbildung 4- Orf11 NTD (PDB ID 6O43) und HEWL (PDB ID 6PBB) wurden mit der I3C-rMMS-Methode kristallisiert und mit Auto-Rickshaw SAD-Phasing gelöst. (A) Bandstrukturen von HEWL und Orf11 NTD durch experimentelles Phasing gelöst. (B) I3C Molekül gebunden an HEWL und Orf11 NTD. (C) Anomale Jodatome in I3C sind in einem gleichseitigen Dreieck von 6 ° angeordnet. So weist das Vorhandensein dieses Dreiecks in der phasing Unterstruktur darauf hin, dass sich ein I3C-Molekül in dieser Position befindet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61984fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Erzeugung von Proteinkristallen dar, die mit I3C (5-Amino-2,4,6-Triiodoisophthalsäure) mit Mikrosaatierung zur Erzeugung neuer Kristallisationsbedingungen in spärlichen Matrix-Bildschirmen deaktiviert werden. Die Schalen können mit Flüssigkeitsdosierrobotern oder von Hand aufgestellt werden.

Ableitung von Proteinkristallen mit I3C mit Random Microseed Matrix Screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Dies ist ein Kristallisationsprotokoll, das entwickelt wurde, um das Wachstum eines Proteinkristalls zu optimieren und gleichzeitig das Protein mit einem Phasing-Molekül zu leiten, um die Struktur eines Proteins durch Röntgenkristallographie zu bestimmen. Um die Röntgenkristallstruktur eines völlig neuartigen Proteins zu bestimmen, werden die Kristallisationsbedingungen optimiert, um Hochwertigekristalle zu erzeugen. Bei einem völlig neuartigen Protein müssen schwere Atome in den Kristall eingeführt werden, um einen derivatisierten Kristall zu erzeugen.Röntgenbeugungsdaten werden aus dem derivatisierten Kristall gesammelt und müssen rechnerisch gelöst werden, um eine Röntgenkristallstruktur zu erzeugen. Kristallisation und Ableitung sind beides mühsame Prozesse. Um diese Engpässe zu beheben, haben wir ein optimiertes Screening-Verfahren entwickelt, das beide Ziele gleichzeitig erreicht.Dieses Protokoll verwendet eine zuvor entwickelte Technik, die als zufälliges Mikrosaat-Matrix-Screening bekannt ist. Kristalle oder kristalliner Niederschlag werden zu Mikrosaaten zerkleinert, die verwendet werden können, um das Kristallwachstum unter völlig unabhängigen Bedingungen zu beginnen. Gleichzeitig führen wir ein Phasing-Molekül namens I3C in den Kristallisationszustand ein.Dieses Molekül liefert ein großes anomales Signal, das es ermöglicht, die Struktur durch eine einzige Wellenlänge anomale Diskussion Phasing gelöst werden. Für Anwender, die mit der experimentellen Dimensionierung von Kristallstrukturen nicht vertraut sind, stellen wir eine benutzerfreundliche Software-Pipeline vor, um die Strukturlösung teilweise zu automatisieren, die sie an das anomale Signal von I3C anpasst. Der erste Schritt besteht darin, eine I3C-Aktie zu erstellen.Messen Sie 120 Milligramm I3C in ein Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie dem Mikrozentrifugenrohr 200 Mikroliter zwei molares Lithiumhydroxid hinzu. Das Erhitzen des Rohres bei 40 bis 60 Grad und Wirbel können verwendet werden, um die Auflösung zu fördern.Der einzige Molvorrat an Lithium I3C Lösung sollte braun sein. Zwei Methoden können verwendet werden, um I3C in den Proteinbestand einzuführen. Lithium I3C kann direkt in den Proteinbestand aufgenommen werden.3,75 Mikroliter bis 30 Mikroliter I3C können 150 Mikroliter Protein zugesetzt werden, um eine Konzentration zwischen fünf und 14 Millimolar zu ergeben. Einige Proteine können bei Kontakt mit hohen Konzentrationen von I3C ausfallen. In diesen Fällen kann Lithium I3C einem Proteinverdünnungspuffer zugesetzt werden, der puffert und das Probenprotein auf eine Endkonzentration zwischen 10 und 80 Millimolar abgestimmt hat.150 Mikroliter des Proteinverdünnungspuffers zu 150 Mikrolitern Proteinprobe hinzufügen. Eine Glassonde zum Zerkleinern von Kristallen besteht aus einer Glaspasteurpipette. Mit einem Bunsenbrenner auf der blauen Flamme die Pasteurpipette in die Mitte erhitzen.Mit einer Pinzette ziehen Sie die Enden der Pasteur Pipette in einen dünnen Durchmesser von weniger als 0,3 Millimetern. Halten Sie dieses Segment in der Flamme, um die Pipette an dieser Stelle zu trennen und um das Ende der Pipette zu runden, um die Glassonde zu beenden. Dies ist ein Beispiel dafür, wie die Glaspipette aussehen sollte.Kristall-Crushes können auch von Drittanbietern als Alternative zur Herstellung Ihres eigenen A-Mikrosaat-Bestands bestellt werden, der durch Zerkleinern von Proteinkristallen oder kristallinem Niederschlag erzeugt wird. Fünf 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre auf Eis legen. Wählen Sie unter einem Lichtmikroskop die besten Morphologiekristalle oder kristallinen Niederschlag aus, die geopfert werden können.Für 96 brunnenkristallisationsschalen öffnen sie den Brunnen durch Schneiden des Kunststoff-Dichtungsbandes. Zum Aufhängen von Fallschalen kann der Deckelschlupf mit einer Pinzette entfernt und auf eine flache Oberfläche gedreht werden. 70 Mikroliter Reservoirlösung auf eines der Mikrozentrifugenrohre übertragen und auf Eis kühlen.Auf die restlichen Röhren, übertragen 90 Mikroliter Reservoir-Lösung auf sie und kehren sie zu Eis zu kühlen. Bei ausreichendem Reservoirvolumen kann durch Mischen der entsprechenden Reagenzien ein Kristallisationsreservoir hergestellt und stattdessen verwendet werden. Die Kristalle im Kristallisationstropfen mit der Glassonde gründlich zerkleinern.Der Fortschritt kann unter dem Mikroskop überwacht werden, bis keine Kristalle oder kristallines Material sichtbar sind. Übertragen Sie die gesamte Flüssigkeit aus dem Tropfen in das Mikrozentrifugenrohr mit 70 Mikroliter Reservoirlösung. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten.Zwei bis drei Mikroliter Mischung zurück in den Brunnen geben und den Brunnen durch Pipettieren nach oben und unten abspülen. Übertragen Sie das Gemisch zurück in das Mikrozentrifugenrohr. Dieser Spülschritt sollte noch einmal wiederholt werden.Das Mikrozentrifugenrohr sollte von diesem Punkt an kalt gehalten werden, um ein Schmelzen der Mikrosaaten zu vermeiden. Wirbeln Sie die Röhre bei maximaler Geschwindigkeit bei vier Grad für etwa drei Minuten kühlen die Röhre auf Eis regelmäßig, um eine Überhitzung zu verhindern. eine von 10 seriellen Verdünnungen des Saatgutbestands durch sequenzielle Übertragung von 10 Mikrolitern zwischen den Kühlbehälterlösungen.Zwischen den Verdünnungen des Samenbestands sollte das Rohr gewirbelt werden. Saatgutvorräte, die nicht sofort verwendet werden, sollten in einem minus 80 Grad Ultra-Kühlschrank gelagert werden. Ein 96 gut zufälliger Mikrosaatmatrix-Bildschirm kann mit einem Flüssigkeitsdosierroboter eingerichtet werden.Legen Sie den Samenbestand, die Protein-Lagerlösung, ergänzt durch I3C und den Kristallisationssieb im Roboter. Mit dem Roboter übertragen Sie 75 Mikroliter vom Kristallisationssieb auf das 96-Well-Tray. Fügen Sie dem Kristallisationstropfen einen Mikroliter und dem Reservoir 74 Mikroliter hinzu.Übertragen Sie einen Mikroliter Protein, das mit I3C ergänzt wird, auf den Kristallisationstropfen. Übertragen Sie 0,1 Mikroliter Saatgut auf den Kristallisationsabfall. Versiegeln Sie die Platte mit Dichtband.Hängende Fallgitter können in 24 gut hängenden Tropfenkristallisationsschalen aufgestellt werden. Fetten Sie die Ränder der hängenden Fallbrunnen. Übertragen Sie 500 Mikroliter Kristallisationslösung in das Reservoir.In der Nähe der Mitte einer Glasabdeckung Schieben platzieren einen Ein-Mikroliter-Tropfen der Kristallisationslösung. Zu diesem Tropfen, fügen Sie einen Mikroliter Protein mit Lithium I3C und 0,1 Mikroliter Samenbestand ergänzt. Invertieren Sie den Deckelschlitten und versiegeln Sie die Kristallisation gut, indem Sie den Deckelschlitten in das Fett schieben.Hängende Tropfen- und Dichttropfenschalen werden bei konstanter Temperatur inkubiert, damit sich Kristalle bilden können. Sie sollten regelmäßig unter dem Mikroskop auf Kristallwachstum untersucht werden. Nachdem Beugungsdaten erhalten, integriert und skaliert wurden, wie im beigefügten schriftlichen Protokoll erläutert, kann die automatische Kristallstrukturbestimmungspipeline Auto-Rickshaw verwendet werden, um das Phasenproblem zu lösen und das Protein zu modellieren.Klicken Sie auf der Auto-Rickshaw-Zielseite auf die Schaltfläche "Weiterfahren". Geben Sie Ihre institutionelle E-Mail im Auto-Rickshaw-Webformular ein und klicken Sie auf Weiterfahren mit der Ausführung von Auto-Rickshaw. Für Proteine ohne Homologie moto Vorlage führen Sie das SAD-Protokoll von Auto-Rickshaw im erweiterten Modus.Geben Sie die erforderlichen Parameter ein. Wählen Sie Protein als Molekültyp aus. Geben Sie die Wellenlänge der Datensammlung in angstroms ein.So wie ich als Unterstrukturelement verwendet wurden Jodatome verwendet. Wählen Sie den Unterstrukturtyp I3C aus, um anzugeben, dass I3C das Phasing-Molekül war. Wählen Sie sub_direct als Unterstrukturbestimmungsmethode aus.Wählen Sie drei als Anzahl der erwarteten Unterstrukturen pro Monomer aus. Geben Sie eine als Reservierungsschnitt der Unterstruktursuche ein. Dadurch kann Auto-Rickshaw automatisch einen geeigneten Auflösungsschnitt bestimmen.Geben Sie die Anzahl der Rückstände in einem einzigen Monomer, die Raumgruppe des Datensatzes und die Anzahl der Moleküle in der asymmetrischen Einheit basierend auf dem Matthews-Koeffizienten ein. Wählen Sie die geeignete Verbreitungsstufe von Röntgendaten aus, die Ihren Anforderungen entspricht. Geben Sie die anomalen Daten als leere Set-Datei ein.Geben Sie Ihre Proteinsequenz als SEQ-, PIR- oder TXT-Datei ein. Geben Sie Ihre institutionelle E-Mail-Adresse ein. Die Ergebnisse werden Ihnen über einen Weblink an die angegebene E-Mail-Adresse übermittelt.Wenn Auto-Rickshaw die Struktur nicht mithilfe der festgelegten Unterstruktur löst, die die Unterstruktur validiert, könnte dies bei der Fehlerbehebung bei der Lösung der Lösung bei der Fehlerbehebung helfen. Laden Sie die Liste der schweren Atom-Sites von der Auto-Rickshaw-Ergebnisseite herunter. Es ist ein Hyperlink, der als schwere Atomstandorte bezeichnet wird.Dadurch wird eine Textdatei mit den schweren Atom-Sites heruntergeladen. Ändern Sie die Dateierweiterung der Datei von txt in pdb. Öffnen Sie die pdb-Datei in Coot.Aktivieren Sie die Symmetrie, um alle schweren Atome benachbarter asymmetrischer Einheiten zu sehen. Messen Sie die Abstände zwischen den schweren Atomen, auch über asymmetrische Einheiten hinweg. I3C erscheint als gleichseitiges Dreieck mit einer Seitenlänge von sechs Angstroms.Das Vorhandensein eines Dreiecks mit diesen Dimensionen zeigt an, dass die Platzierungen dieser schweren Atome korrekt sind. Wenn die Auto-Rickshaw-Unterstruktur falsch ist, können andere Auto-Rickshaw-Einstellungen wie im geschriebenen Protokoll beschrieben getestet werden. Die I3C RMMS-Methode wurde an zwei Proteinen getestet, dem Hühnereiweiß-Lysozym mit dem in HT-Bildschirm von Hampton Research und der Domäne des Orf11-Lysinproteins aus Bakteriophagen P68.Für jedes Protein wurden vollständige Bildschirme eingerichtet, die dem Kontrollbildschirm ohne I3C oder Mikrosaat entsprechen, Bildschirm mit Mikrosaat hinzugefügt, Bildschirm mit I3C und schließlich der Bildschirm mit I3C und Microseed. Das Hinzufügen von I3C zu einem Kristallbildschirm scheint die Anzahl der Kristallisationstreffer nicht zu erhöhen. Bei Hühnereiweißlysozym sank die Zahl der Erkrankungen von 31 auf 26.Mit der Orf11-Domäne wurde eine einzige Trefferbedingung im Kontrollbildschirm gefunden. Das Hinzufügen von I3C auf dem Bildschirm gab auch einen einzigen Treffer unter den gleichen Bedingungen. Die Zugabe von Mikrosaat zu dem Brunnen führte zu einer signifikanten Zunahme der Trefferbedingungen, was zu einer 2,1- bzw. sechsfachen Erhöhung für Hühnerei-Weiß-Lysozym bzw. die Orf11-Domäne führte.Dieses Ergebnis stimmt mit anderen Studien überein, in der RMMS getestet werden. Am wichtigsten ist, dass das Hinzufügen von I3C und Mikrosaat zu einem Bildschirm auch die Anzahl der Trefferbedingungen relativ zum Kontrollbildschirm erhöhte, was eine 2,3- bzw. siebenfache Erhöhung für Hühnerei-Weiß-Lysozym bzw. die Orf11-Domäne zeigt. Dies zeigt, dass die I3C RMMS-Methode effizient neue Bedingungen für derivatisierte Kristalle erzeugen kann.Kristalle aus diesen Bedingungen könnten geerntet und verwendet werden, um die Kristallstruktur zu lösen. Sowohl die Struktur der Henne Eiweiß Lysozyme Orf11 Domain konnte mit SAD-Phasing auf der Auto-Rickshaw-Pipeline gelöst werden, mit dem anomalen Signal von I3C zeigt eine erfolgreiche Derivitisierung durch den I3C RMMS Bildschirm. Wir haben ein einfaches und effizientes Protokoll zur Herstellung hochwertiger Kristalle vorgelegt, die mit dem Phasing Molekül I3C abgeführt werden.Es minimiert die Anzahl der Siebe und kristallinen Handhabungsschritte und ist daher von besonderem Interesse für Strukturbiologen, die neuartige Proteine untersuchen. Wir empfehlen dringend, die Kristallgröße zu optimieren, indem verschiedene Verdünnungen des Saatgutbestands getestet werden, die während der Saatgutstoffaufbereitung hergestellt wurden. Und dieser Schritt ist abgeschlossen, nachdem die ersten Bildschirme abgeschlossen wurden.I3C ist weit verbreitet und es ist kostengünstig zu kaufen und daher glauben wir, dass diese Methode in reichweite für die meisten strukturellen Biologie Laboratorien ist.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Mikrokristallographie von Proteinkristallen und<em&gt; In Cellulo</em&gt; Beugung

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Forschung

Biochemie

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Wachsende Proteinkristallen mit unterschiedlichen Abmessungen mit automatisierten Kristallisation gepaart mit In Situ dynamische Lichtstreuung

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hohe Empfindlichkeit Messung der Transkription Faktor-DNA verbindlichen Affinitäten durch wettbewerbsfähige Titration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase-Inhibitor-Screening in selbstmontierten humanen Protein-Mikroarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetisches Screening der Nuklease-Aktivität mit Nukleinsäuresonden

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Erstellen hochspezifischer chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme durch schrittweise Phage-Auswahl einer kombinatorischen Single-Domain-Antikörperbibliothek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisches Screening und Charakterisierung des Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex für eine erfolgreiche Kristallisation

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimierung des Wachstums von Endothiapepsin-Kristallen für serielle Kristallographie-Experimente

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Bakterielle Expression und Aufreinigung der humanen Matrix-Metalloproteinase-3 mittels Affinitätschromatographie

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...