Name: derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening
Uploaded: 2021-01-16T15:00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

מחקר זה נערך על קו הקרן MX1 ב Synchrotron האוסטרלי, חלק ANSTO. המחברים רוצים להכיר חברים במעבדות שירווין וברונינג לדיונים על עבודה זו. המחברים רוצים גם להכיר ד"ר סנטוש Panjikar וד"ר לינדה Whyatt-Shearwin שתרמו לעבודה המקורית שהייתה חלוצה פרוטוקול זה.
המימון הבא מוכר: מועצת המחקר האוסטרלית (להעניק Nos. DP150103009 ו- DP160101450 לקית' א. שירווין); אוניברסיטת אדלייד (תוכנית ההכשרה הממשלתית האוסטרלית למחקר מלגה ג'יה קויין טרונג וסטפני נגוין).

לסופרים אין מה לחשוף.

קביעת מבנה של חלבון חדשני בהיעדר מודל הומולוגיה מתאים להחלפה מולקולרית דורשת ניסויים. שיטות אלה דורשות התאגדות של אטומים כבדים לתוך גביש החלבון אשר מוסיף רמה של מורכבות לצינור קביעת מבנה יכול להציג מכשולים רבים שיש לטפל. אטומים כבדים יכולים להיות משולבים ישירות לתוך החלבון באמצעות ביטוי מתויג באמצעות סלנומטיונין וסלנוצישטאין. מכיוון ששיטה זו יקרה, מייגעת עלולה לגרום לתפוקות חלבון נמוכות יותר, חלבון מתויג מתבטא לעתים קרובות לאחר שנמצאו תנאי התגבשות ואופטימיזציה עם חלבון ללא תווית. לחלופין, ניתן להפיק קריסטלים על-ידי השריה בתמיסה המכילהאטומים כבדים 22,63,64. שיטה זו משתמשת לעתים קרובות גבישים באיכות גבוהה ולכן מבוצעת לאחר שיטת התגבשות חזקה כבר פותחה. בהצלחה להשיג גביש נגזר באמצעות שיטה זו דורש אופטימיזציה נוספת של הליכי השריה והקרנה של תרכובות phasing שונות, ולכן הוספת זמן נוסף לתהליך מייגע כבר.
התגבשות משותפת של החלבון עם האטום הכבד יכולה להתבצע בשלב ההקרנה, ובכך לייעל ביעילות את התהליך ולהפחית את צעדי המניפולציה הגבישית שיכולים לגרום נזק. עם זאת, עדיין קיים התרחיש הפוטנציאלי של השגת כמה להיטי התגבשות ראשוניים ואת הבעיה של בחירת תרכובת אטום כבד תואם. תרכובות phasing רבות הזמינות כיום אינן תואמות עם מקדים, מאגרים ותוספים נמצאים בדרך כלל בתנאי התגבשות. הם עשויים להיות מסיסים במאגרי גופרית ופוספט, chelate כדי ציטראט ואצטט, להגיב שלילי עם HEPES וטריס מאגרים או להיות מבודד על ידי DTT ו β-mercaptoethanol21. כמו תרכובת phasing I3C אינו סובל מאי-תואמות אלה, זה תרכובת phasing חזקה שיכול להיות מותנה לתנאים רבים ושונים.
במחקר זה, שיטה יעילה של ייצור גבישים נגזרים מוכן phasing SAD באמצעות התגבשות בו-זמנית של תרכובת phasing I3C ו rMMS מוצג. השילוב של שתי הטכניקות מגדיל את מספר להיטי ההתגבשות, כאשר רבים מהתנאים שיפרו את מאפייני המורפולוגיה וההתפכה. הן במקרי בדיקה של Orf11 NTD והן במקרי בדיקת HEWL, זוהו תנאים חדשים במסך I3C-rMMS שנעדרו כאשר I3C לא היה נוכח. פוטנציאל, I3C עשוי להיקשר לטובה לחלבון, להקל על היווצרות וייצוב של מגעים גביש27. בתורו, זה עלול לגרום התגבשות ואולי לשפר את מאפייני ההתגבשות. מלבד היותו מתחם תואם מסכי מטריצה דלילה, I3C הוא גם מתחם phasing אטרקטיבי בשל המאפיינים הפנימיים שלה. הקבוצות הפונקציונליות המחליפיות עם יוד על פיגום הטבעת הארומטי מאפשרות כריכה ספציפית לחלבונים. זה מוביל לתפוסה גדולה יותר ועלול להפחית את אות הרקע23. יתר על כן, הסידור של מפזרים חריגים במשולש שווה צלעות ברור בתת-מבנה וניתן להשתמש בו כדי לאמת במהירות איגוד של I3C (איור 4B ו- 4C). לבסוף, הוא יכול לייצר אות חריג עם קרינת סינכרוטרון tunable, כמו גם כרום ונחושת מסתובב מקורות רנטגן אנודה. לכן, ניתן להחיל אותו על זרימות עבודה רבות ושונות. כמו I3C זמין נרחב ולא יקר לרכישה, גישה זו היא בהישג יד עבור רוב מעבדות ביולוגיה מבנית.
קיימים מספר שיקולים ניסיוניים שיש לטפל בהם בעת שימוש בשיטת I3C-rMMS. אין אפשרות להחיל שיטה זו אם לא ניתן להשיג חומר גבישי ראשוני של החלבון. במקרים קשים, חומר גבישי מחלבון הומולוגי יכול לשמש גם כדי ליצור מלאי זרעים. גישה זו צולבת זרעים rMMS הראה כמה תוצאות מבטיחות7. אופטימיזציה של מספר גביש באמצעות דילול של מלאי הזרעים היא צעד מכריע, אשר אין להתעלם, כדי למקסם את הסיכוי לייצר גבישים גדולים באיכות גבוהה ורכישת נתוני iffraction מתאימים. אם יש מעט אתרי I3C שזוהו ביחידה האסימטרית, יש למטב את התנאים התגבשות עוד יותר עם ריכוז מוגבר של I3C. זה עשוי להגדיל את התפוסה של I3C כדי למקסם את האות החריג ולסייע גביש נגזר.
יכולים להיות מקרים שבהם טכניקה זו לא יכולה להיות השיטה האופטימלית כדי להפיק גבישי חלבון. ככל שגודלו של חלבון או קומפלקס חלבון גדל, המספר המוגבל של אתרי I3C על פני השטח של החלבון לא יכול לספק מספיק כוח phasing כדי לפתור את המבנה. בתרחישים אלה שבהם גודל החלבון חשוד להיות phasing, תיוג סלנומתיון של החלבון עשוי להיות גישה בת קיימא יותר כדי phasing החלבון. אם החלבון יש מספר מספיק של שאריות מתיונין בחלבון (מומלץ שיש לפחות מתיונין אחד לכל 100שאריות 65) ויעילותגבוהה התאגדות סלנומתיונין לתוך חלבון ניתן להשיג (כגון במערכות ביטויחיידקים 66), אטומי סלניום תפוסה גבוהה מרובים יהיו נוכחים גבישים לשלב את המבנה.
בנוסף, חלבונים מסוימים עשויים מטבעם להיות לא מתאימים לדריבעה עם I3C. אתרי איגוד I3C על חלבונים תלויים במבנה החלבון. ייתכנו חלבונים שבאופן טבעי יש כמה תיקונים חשופים תואמים לאיגוד I3C. לכן, זה לא בלתי צפוי כי ייתכנו קשיים בהתגבשות חלק חלבוני היעד עם I3C.

בתחום הביולוגיה המבנית, קריסטלוגרפיה רנטגן נחשבת טכניקה סטנדרטית זהב כדי לקבוע את המבנים ברזולוציה אטומית של מקרומולקולות. זה כבר נוצל בהרחבה כדי להבין את הבסיס המולקולרי של מחלות, מדריך פרויקטים עיצוב תרופה רציונלית ולהאריך את המנגנון הקטליטישל אנזימים 1,2. למרות שנתונים מבניים מספקים שפע של ידע, תהליך ביטוי וטיהור חלבונים, התגבשות וקביעת מבנה יכול להיות מייגע ביותר. מספר צווארי בקבוק נתקלים בדרך כלל כי לעכב את ההתקדמות של פרויקטים אלה וזה חייב להיות ממוען ביעילות לייעל ביעילות את צינור קביעת מבנה גביש.
בעקבות ביטוי רקומביננטי וטיהור, יש לזהות תנאים ראשוניים התגבשות אשר לעתים קרובות היבט מפרך וגוזל זמן של גבישים רנטגן. מסכי מטריצה ודלילה מסחריים המאחדים תנאים ידועים ופורסמו פותחו כדי להקל על צוואר בקבוקזה 3,4. עם זאת, זה נפוץ לייצר כמה להיטים מהסכים הראשוניים האלה למרות שימוש בדגימות חלבון טהורות ומרוכזות מאוד. התבוננות בטיפות ברורות מצביעה על כך שהחלבון לא יכול להגיע לרמות של שינון העל הנדרש כדי לגרום גביש. כדי לעודד גרעין קריסטל וצמיחה, ניתן להוסיף זרעים מופקים מקריסטלים קיימים מראש לתנאים וזה מאפשר דגימה מוגברת של מרחב התגבשות. איירטון וסטודרד הציגו לראשונה את שיטת הסינון של מטריצתהמיקרו-זרעים 5. גבישים באיכות ירודה נמחצו כדי ליצור מלאי זרעים ולאחר מכן נוספו באופן שיטתי לתנאי התגבשות המכילים מלחים שונים כדי ליצור גבישים חדשים באיכות iffraction שלא היו נוצרים אחרת. טכניקה זו שופרה עוד יותר על ידי D'Arcy ואח', שפיתחה הקרנה אקראית של מטריצת microseed (rMMS) שבה זרעים הוכנסולמסך התגבשות מטריצה רזרבי 6,7. זה שיפר את איכות הגבישים והגביר את מספר להיטי ההתגבשות בממוצע על ידי גורם של 7.
לאחר יצירת גבישים בהצלחה ומתקבלת תבנית פעירת רנטגן, נתקלים צוואר בקבוק נוסף בצורה של פתרון 'בעיית פאזה'. במהלך תהליך רכישת הנתונים, עוצמת iffraction (פרופורציונלי לריבוע של משרעת) נרשם אבל מידע השלב הולך לאיבוד, מה שנועץ לבעיית השלבים העוצרת קביעת מבנה מיידית8. אם חלבון היעד חולק זהות רצף גבוה לחלבון עם מבנה שנקבע קודם לכן, ניתן להשתמש בתחליף מולקולרי כדי להעריך אתמידע שלב 9,10,11,12. למרות ששיטה זו מהירה וזולת, ייתכן שמבני המודל לא יהיו זמינים או מתאימים. ההצלחה של שיטת החלפת מולקולרית מבוססת מודל הומולוגיה יורדת באופן משמעותי כמו זהות רצף נופל מתחת 35%13. בהיעדר מודל הומולוגיה מתאים, ניתן לבדוק שיטות ab initio, כגון ARCIMBOLDO14,15 ו- AMPLE16. שיטות אלה משתמשות במודלים או שברים חזויים חישוביים כנקודות התחלה להחלפה מולקולרית. AMPLE, המשתמשת במודלים דמה חזוי כנקודות התחלה, נאבקת לפתור מבנים של חלבונים גדולים (>100 שאריות) וחלבונים המכילים בעיקר β שונים. ARCIMBOLDO, אשר מנסה להתאים שברים קטנים כדי להרחיב לתוך מבנה גדול יותר, מוגבל לנתונים ברזולוציה גבוהה (≤2 Å) ועל ידי היכולת של אלגוריתמים להרחיב את השברים למבנה מלא.
אם שיטות החלפה מולקולריות נכשלות, יש להשתמש בשיטות ישירותכגוןהחלפת איזומורפית17,18 ופיזור חריג באורך גל יחיד (SAD19)או באורכי גל מרובים (MAD20). זה לעתים קרובות המקרה עבור מבנים חדשניים באמת, שבו הגביש חייב להיווצר או נגזר עם אטום כבד. זה יכול להיות מושגת על ידי השריה או שיתוף התגבשות עם תרכובת אטום כבד, שינוי כימי (כגון 5-bromouracil התאגדות ב RNA) או ביטוי חלבון מתויג (כגון שילוב חומצות סלנומטיונין או selenocysteine אמינו לתוך המבנה הראשי)21,22. הדבר מסבך עוד יותר את תהליך ההתגבשות ודורש סינון ואופטימיזציה נוספים.
מחלקה חדשה של תרכובות phasing, כולל I3C (5-אמינו-2,4,6-triiodoisophthalic חומצה) ו B3C (5-אמינו-2,4,6-tribromoisophthalic חומצה), מציעים יתרונות מרגשים על פני תרכובות phasing קייםמראש 23,24,25. הן I3C והן B3C כוללים פיגום טבעת ארומטי עם סידור לסירוגין של פיזורים חריגים הנדרשים עבור שיטות phasing ישיר וקבוצות פונקציונליות אמינו או קרבוקסילטים אינטראקציה ספציפית עם החלבון ולספק ספציפיות אתר מחייב. הסידור המשולש ההשוותי הבא של קבוצות מתכת כבדה מאפשר אימות פשוט יותר של מבנה המשנה phasing. בעת איסוף החומר למדריך, ישנם 26 מבנים המאוגדים ב- I3C בבנק נתוני החלבון (PDB), מהם 20 נפתרו באמצעות phasing SAD26.
פרוטוקול זה משפר את היעילות של צינור קביעת מבנה על ידי שילוב השיטות של נגזרת מתכת כבדה והקרנת rMMS כדי להגדיל בו זמנית את מספר להיטי התגבשות ולפשט את תהליך גביש derivatization. הראינו ששיטה זו הייתה יעילה מאוד עם ליזוים לבנים ביצה ותחום של חלבון ליצין חדשני מבקטריופט P6827. פתרון מבנה באמצעות צינור קביעת מבנה אוטומטי-ריקשה אוטומטי מאוד מתואר, מותאם במיוחד עבור מתחם phasing I3C. קיימים צינורות אוטומטיים אחרים שניתן להשתמש בהם כגון AutoSol28, ELVES29 ו- CRANK230. ניתן להשתמש גם בחבילות לא אוטומטיות לחלוטין כגון SHELXC/D/E31,32,33. שיטה זו מועילה במיוחד לחוקרים החוקרים חלבונים חסרי מודלים הומולוגיים ב-PDB, על ידי צמצום משמעותי של מספר שלבי הסינון והאופטימיזציה. תנאי מוקדם לשיטה זו הוא גבישי חלבון או משקע גבישי של חלבון היעד, שהושג מניסויים קודמים התגבשות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL disposable luer lock syringes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>T3SS10LAT</td>
			<td>Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used for hanging drop crystal tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-506</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22178</td>
			<td>Commonly referred to as I3C in the article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-297</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18X18-2</td>
			<td>Coverslips for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning vacuum grease</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-510</td>
			<td>Used for sealing hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette 0.1 &#956;L-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 2 &#956;L-20 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1153247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 20 &#956;L-200 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1152006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>HIR92601.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Approximately 95% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IndexHT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope illuminator</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>FT192/230</td>
			<td>Light source to illuminate crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/ION HT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Liquid Dispenser</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel with scalpel blade no. 15</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>LV-SMSCPO15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope&#160;</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>EMZ-5TR</td>
			<td>Microscope for visualising crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>RAVM1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening

ההברה במבנה החלבון באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן דורשת הן גבישי מפזר באיכות גבוהה והן פתרון חישובי של בעיית שלב ההתפוררות. מבנים חדשניים שאין להם מודל הומולוגיה מתאים נגזרים לעתים קרובות עם אטומים כבדים כדי לספק מידע שלב ניסיוני. הפרוטוקול המוצג מייצר ביעילות גבישי חלבון נגזרים על ידי שילוב של הקרנת מטריצת microseeding אקראית עם נגזרת עם מולקולת אטום כבדה I3C (5-אמינו-2,4,6-triiodoisophthalic חומצה). על-ידי שילוב I3C לתוך סריג הגביש, ניתן לפתור ביעילות את בעיית שלב ההתפזרות באמצעות פיזור חריג באורך גל יחיד (SAD). סידור המשולש ההשוותי של אטומי יוד ב- I3C מאפשר אימות מהיר של תת-מבנה חריג נכון. פרוטוקול זה יהיה שימושי ביולוגים מבניים לפתור מבנים מקרומולקולריים באמצעות טכניקות מבוססות קריסטלוגרפיה עם עניין phasing ניסיוני.

שילוב I3C לתוך rMMS יכול ליצור תנאים חדשים התומכים בצמיחת קריסטל נגזרת היעילות של הקרנת RMMS בו זמנית וdivatization I3C הוכח בשני חלבונים, ליזוזים לבן ביצה תרנגולת (HEWL, שהושג כאבקה lyophilized) ואת Orf11 lysin N-תחום (Orf11 NTD) מן החיידק P68. כל חלבון הוקרן נגד PEG/ION HT בארבעה תנאים שונים, כולל: unseeded, זרעים, לא זרעים עם I3C וזרע עם I3C (איור 1). עבור שני החלבונים, התוספת היחידה של I3C לא להגדיל את מספר התנאים התגבשות. במקרה של Orf11 NTD, זוהה מצב מתאים אחד בלבד עם ובלי I3C (איור 1B). כאשר I3C נוסף למסכי HEWL, מספר הלהיטים הצטמצם מ-31 ל-26, והדגיש את המורכבות הנוספת של התגבשות בעת הצגת תרכובות phasing (איור 1A). עולה בקנה אחד עם מחקרים אחרים, הוספת זרעים למסכי מטריצה דליל מסחרי כדי ליצור מסך rMMS הגדילה באופן משמעותי את מספר תנאי התגבשות אפשריים עבור שני החלבונים, וכתוצאה מכך עלייה של פי 2.1 ו-6 עבור HEWL ו-Orf11 NTD,בהתאמה 6,61 ( איור1). והכי חשוב, תוספת בו-זמנית של I3C וזרע הגדילה את מספר הלהיטים ביחס למסך לא מוזרע, מה שהפגין גידול של פי 2.3 ו-7 עבור HEWL ו-Orf11 NTD, בהתאמה. רבים מהקריסטלים של rMMS בנוכחות I3C להראות מורפולוגיה קריסטל מעולה (איור 2).
זריעה מאפשרת שליטה זהירה במספר גביש במסכי I3C rMMS בניסויי microseeding, מספר הזרעים שהוכנסו לתוך ניסוי התגבשות יכול להיות נשלט על ידי דילול של מלאי הזרעים וזה מאפשר שליטה מדויקת של גרעיןבטיפה 7,36. זה לעתים קרובות מאפשר גבישים גדולים יותר ליצור מאז יש תחרות מופחתת של מולקולות חלבון באתרי גרעין. יתרון זה משתרע גם על שיטת I3C-rMMS והוכח בהצלחה הן ב-HEWL והן ב-Orf11 NTD. בילוי של מצב התגבשות שזוהה ממסך I3C-rMMS עם מלאי זרעים מדולל הניב פחות אך גבישים גדולים יותר(איור 3).
phasing עצוב יכול לשמש כדי לפתור את המבנים מקריסטלים נגזר rMMS I3C מסך גבישים שגדלו באמצעות מלאי הזרעים מדולל המוצג איור 3 שימשו כדי לפתור את המבנה של החלבונים באמצעות phasing SAD באמצעות נתוני iffraction מקריסטל יחיד(איור 4). הנתונים נאספו בקו הקרן האוסטרלי Synchrotron MX162. פרטים מפורטים על איסוף נתונים ופתרון מבנה מתוארים במקוםאחר 27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig01.jpg"> איור 1 - rMMS שימש ליצירת תנאים חדשים לצמיחת קריסטל בנוכחות I3C עבור שני חלבוני בדיקה. 96 מסכי התגבשות דיפוזיה אדים היטב בוצעו באמצעות מסכי מטריצה דליל מסחרי. (א)ליזום לבן ביצה חן נבדק עם מסך HT אינדקס. מגשים נזרעו עם גבישי HEWL גדל 0.2 M אמוניום טרטרט dibasic pH 7.0, 20% (w / v) פוליאתילן גליקול 3350. (ב)Orf11 NTD מ bacteriophage P68 נבדק עם מסך PEG / ION. מגשי NTD Orf11 נזרעו מקריסטלים ממצב G12 מהמסך ללא זרעים, המוצג בכחול. תנאים התומכים בצמיחת קריסטל מוצגים באדום. rMMS זריעה בנוכחות והיעדר I3C שניהם נתנו באופן משמעותי יותר להיטי קריסטל מאשר מגשים לא זרעים. איור הותאם מ-Truong ואח '27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig02.jpg"> איור 2 - תמונות מייצגות של גבישים הגדלים מניסויים דיפוזיה אדים המוצגים איור 1 (א) ו- (ב). איור הותאם מ-Truong ואח '27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig03.jpg"> איור 3 - דילול מלאי הזרעים הוא דרך יעילה להפחית את הגרעין במצב התגבשות שנמצא באמצעות שיטת I3C-rMMS, כדי לשלוט במספר הגבישים הנוצרים. הפחתת גרעין בתוך ירידה לעתים קרובות גורמת גבישים גדל לממדים גדולים יותר. איור הותאם מ-Truong ואח '27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig04.jpg"> איור 4 - Orf11 NTD (PDB ID 6O43) ו- HEWL (PDB ID 6PBB) התגבשו באמצעות שיטת I3C-rMMS ונפתרו באמצעות ריקשה אוטומטית SAD phasing. (א)מבני רצועת הכלים של HEWL ו- Orf11 NTD נפתרו באמצעות phasing ניסיוני. (ב)מולקולת I3C הקשורה ל-HEWL ו-Orf11 NTD. (ג) אטומי יוד חריגים ב- I3C מסודרים במשולש שווה צלעות של 6 Å. לכן הנוכחות של משולש זה במבנה המשנה phasing מצביע על כך שיש מולקולת I3C במיקום זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61984fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

מאמר זה מציג שיטה ליצירת גבישי חלבון נגזר עם I3C (5-אמינו-2,4,6-triiodoisophthalic חומצה) באמצעות microseeding כדי ליצור תנאי התגבשות חדשים במסכי מטריצה דלילה. ניתן להגדיר את המגשים באמצעות רובוטים לחלק נוזלים או ביד.

גניבות של גבישי חלבון עם I3C באמצעות הקרנת מטריצת מיקרו-זרעים אקראית

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

זהו פרוטוקול התגבשות שנועד לייעל את הצמיחה של גביש חלבון ובו זמנית להפיק את החלבון עם מולקולה phasing כדי לקבוע את המבנה של חלבון על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן. כדי לקבוע את מבנה גבישי הרנטגן של חלבון חדשני לחלוטין, תנאי התגבשות מותאמים לייצור גבישים איכותיים. במקרה של חלבון חדשני לחלוטין, אטומים כבדים צריכים להיות הציג לתוך הגביש כדי לייצר גביש נגזר.נתוני עיסוק קרני רנטגן נאספים מהקריסטל הנגזר ויש לפתור אותם באופן חישובי כדי לייצר מבנה גבישי רנטגן. התגבשות ונגזרת הן תהליכים מייגעים. כדי לטפל בצווים בקבוק אלה, פיתחנו הליך סינון ממוטב שמשיג בו זמנית את שתי המטרות הללו.פרוטוקול זה משתמש בטכניקה שפותחה בעבר הידועה בשם הקרנת מטריצת מיקרו-אורגניזם אקראית. גבישים או משקע גבישי נמחץ לתוך microseeds אשר ניתן להשתמש בהם כדי להתחיל צמיחת גביש בתנאים עצמאיים לחלוטין. במקביל, אנו מציגים מולקולת phasing הנקראת I3C למצב התגבשות.מולקולה זו מספקת אות חריג גדול המאפשר למבנה להיפתר על ידי דיון חריג באורך גל אחד. עבור משתמשים שאינם מכירים את הגודל הניסיוני של מבני גבישים אנו מציגים צינור תוכנה ידידותי למשתמש כדי להפוך באופן חלקי את פתרון המבנה המתאים אותו לשימוש באות החריג מ- I3C. הצעד הראשון הוא ליצור מניית I3C.למדוד 120 מיליגרם של I3C לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף 200 מיקרוליטרים של שני ליתיום הידרוקסיד טוחנת לצינור microcentrifuge. חימום הצינור ב 40 עד 60 מעלות ומערבולת ניתן להשתמש כדי לעודד פירוק.המלאי הטנוני היחיד של פתרון ליתיום I3C צריך להיות חום. ניתן להשתמש בשתי שיטות כדי להציג את I3C במלאי החלבון. ליתיום I3C ניתן להוסיף ישירות למלאי החלבון.3.75 microliters כדי 30 microliters של I3C ניתן להוסיף 150 microliters של חלבון לתת ריכוז בין חמישה ל 14 מילימולר. חלבונים מסוימים יכולים לזרז במגע עם ריכוזים גבוהים של I3C. במקרים אלה, ליתיום I3C ניתן להוסיף חיץ דילול חלבון כי הוא חיץ תאם את החלבון מדגם לריכוז סופי בין 10 ל 80 מילימולר.הוסיפו 150 מיקרוליטרים של מאגר דילול החלבון ל-150 מיקרוליטרים של דגימת חלבון. גשוש זכוכית למחוץ גבישים עשוי פיפטה פסטר זכוכית. עם מבער בונזן על הלהבה הכחולה, מחממים את פיפטה פסטר לכיוון האמצע.באמצעות זוג פינצטה, למשוך את הקצוות של פיפטה פסטר החוצה לקוטר דק של פחות מ 0.3 מילימטרים. החזק קטע זה בלהבה כדי להפריד את פיפטה בשלב זה ולעגל את הקצה של פיפטה כדי לסיים את החללית זכוכית. זוהי דוגמה של איך פיפטה זכוכית צריך להיראות.ריסוקים קריסטל עשוי גם להיות הורה מספקי צד שלישי כחלופה להכנת מלאי microseed משלך נוצר על ידי ריסוק גבישי חלבון או משקע גבישי. מניחים חמישה צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל על קרח. תחת מיקרוסקופ אור, בחר את גבישי המורפולוגיה הטובים ביותר או משקעים גבישיים שניתן להקריב.עבור 96 מגשי התגבשות היטב לפתוח את הבאר על ידי חיתוך סרט איטום פלסטיק. עבור מגשי טיפה תלויים, ניתן להסיר את פתק המכסה באמצעות פינצטה ולהסתובב על משטח שטוח. מעבירים 70 מיקרוליטרים של תסכולת מאגר לאחד מצינורות המיקרוצנטריפוגה ומצננים על הקרח.לצינורות הנותרים, להעביר 90 microliters של פתרון המאגר אליו ולחזור לקרח כדי לצנן. אם קיים מספיק נפח מאגר התגבשות ניתן לעשות על ידי ערבוב reagents המתאים ניתן להשתמש במקום. להתסיס את הגבישים בירידה התגבשות באמצעות החללית זכוכית לרסק אותו ביסודיות.ניתן לפקח על ההתקדמות מתחת למיקרוסקופ עד שלא ניתן יהיה לראות גבישים או חומר גבישי. מעבירים את כל הנוזלים מהירידה לצינור המיקרוצנטריפוגה המכיל 70 מיקרוליטרים של תותר המאגר. מערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה.מעבירים שניים עד שלושה מיקרוליטרים של תערובת בחזרה לתוך באר ולשטוף את הטוב על ידי צינור למעלה ולמטה. מעבירים את התערובת בחזרה לצינור המיקרוצנטריפוגה. שלב שטיפה זה צריך לחזור על עצמו פעם נוספת.צינור microcentrifuge צריך להישמר קר מנקודה זו ואילך, כדי למנוע המסת microseeds. מערבולת הצינור במהירות מקסימלית בארבע מעלות במשך כשלוש דקות מצמרר את הצינור על קרח באופן קבוע כדי למנוע התחממות יתר. לעשות אחד מכל 10 דילולים סדרתיים של מלאי הזרעים על ידי העברה רציפה של 10 microliters בין פתרונות המאגר המצונן.בין דילול מלאי הזרעים, הצינור צריך להיות מערבולת. מלאי זרעים שלא ישמש באופן מיידי, צריך להיות מאוחסן במקפיא קר במיוחד מינוס 80 מעלות. ניתן להגדיר מסך מטריצת מיקרו-מזנון אקראי 96 היטב באמצעות רובוט מחלק נוזלי.מניחים את מלאי הזרעים, פתרון מלאי החלבון בתוספת I3C ומסך התגבשות ברובוט. באמצעות הרובוט להעביר 75 microliters ממסך התגבשות למגש 96 באר. הוסף מיקרוליטר אחד לירידה התגבשות ו 74 microliters למאגר.מעבירים מיקרוליטר אחד של חלבון בתוספת I3C לירידה התגבשות. העבר 0.1 מיקרוליטרים של מלאי זרעים לירידה התגבשות. לאטום את הצלחת באמצעות סרט איטום.ניתן להגדיר מסכי טיפה תלויים ב-24 מגשי התגבשות תלויים היטב. משמנים את הקצוות של בארות הירידה התלויות. העבר 500 מיקרוליטרים של פתרון התגבשות למאגר.ליד מרכז מגלשת כיסוי זכוכית מניחים טיפת מיקרוליטר אחת של פתרון התגבשות. לירידה זו, יש להוסיף מיקרוליטר אחד של חלבון בתוספת ליתיום I3C ו-0.1 מיקרוליטרים של מלאי זרעים. להפוך את החלקת המכסה ולאטום את התגבשות היטב על ידי דחיפת החלקת המכסה לתוך השומן.מגשי טיפה ואיטום תלויים דגירה בטמפרטורה קבועה כדי לאפשר גבישים להיווצר. הם צריכים להיבדק באופן קבוע תחת מיקרוסקופ לצמיחת גביש. לאחר שהושגו נתוני דיפוזיה, משולבים ומורחבים כפי שהוסבר בפרוטוקול הכתוב הנלווה, ניתן להשתמש בצינור קביעת מבנה הגביש האוטומטי של Auto-Rickshaw כדי לפתור את בעיית הפאזה ולדגמן את החלבון.בדף הנחיתה Auto-Rickshaw, לחץ על לחצן המשך. הזן את הדואר האלקטרוני המוסדי שלך בטופס האינטרנט של ריקשה אוטומטית ולחץ על המשך בהפעלת ריקשה אוטומטית. עבור חלבונים ללא תבנית מוטו הומולוגיה להפעיל את פרוטוקול SAD של ריקשה אוטומטית במצב מתקדם.הזן את הפרמטרים הדרושים. בחר חלבון כסוג המולקולה. הזן את אורך הגל של איסוף הנתונים באנגסטרום.אז כמו שאני כאלמנט תת-מבנה כדי לציין נעשה שימוש באטומים של יוד. בחר סוג מבנה משנה I3C כדי לציין I3C היה מולקולת phasing. בחר sub_direct כשיטה לקביעת מבנה המשנה.בחר שלושה כמספר מבני המשנה הצפויים לכל מונומר. הזן אחד כניתוק ההזמנה של חיפוש מבנה משנה. הדבר מאפשר ל-Auto-Rickshaw לקבוע באופן אוטומטי ניתוק רזולוציה מתאים.הזן את מספר השאריות במונומר יחיד, קבוצת חלל של ערכת הנתונים ומספר המולקולות ביחידה האסימטרית בהתבסס על מקדם מתיוס. בחר את רמת ההפצה המתאימה של נתוני רנטגן המתאימה לצרכיך. הזן את הנתונים החריגים כקובץ קבוצה ריק.הזן את רצף החלבון שלך כקובץ SEQ, PIR או TXT. הזן את כתובת הדוא"ל המוסדית שלך. התוצאות מועברות אליך באמצעות קישור אינטרנט שנשלח לכתובת הדוא"ל שסופקה.אם Auto-Rickshaw אינו מצליח לפתור את המבנה באמצעות מבנה המשנה הנחוש שלו אימות מבנה המשנה יכול לסייע בפתרון פתרון פתרון מבנה. הורד את רשימת אתרי האטומים הכבדים מדף התוצאות של Auto-Rickshaw. זהו היפר-קישור הנקרא אתרי אטום כבדים.פעולה זו תוריד קובץ טקסט עם אתרי האטום הכבדים. שנה את סיומת הקובץ מ- txt ל- pdb. פתח את קובץ ה- pdb ב- Coot.הפעל סימטריה כדי לראות את כל האטומים הכבדים מיחידות אסימטריות שכנות. למדוד את המרחקים בין האטומים הכבדים, כולל על פני יחידות אסימטריות. I3C יופיע כמשולש שיווי משקל עם אורך צד של שישה אנגסטרום.נוכחותו של משולש עם ממדים אלה מצביעה על כך שהמיקומים של אותם אטומים כבדים נכונים. אם מבנה המשנה Auto-Rickshaw להפעלה שגוי, ניתן לבדוק הגדרות אחרות של ריקשה אוטומטית כפי שנדון בפרוטוקול הכתוב. שיטת I3C RMMS נבדקה על שני חלבונים, lysozyme לבן ביצה תרנגולת באמצעות מסך ב- HT ממחקר המפטון ואת התחום של חלבון ליסין Orf11 מ בקטריופאג P68.מסכים מלאים הוקמו עבור כל חלבון המתאים למסך הבקרה ללא I3C או microseed, מסך עם microseed הוסיף, מסך עם I3C, ולבסוף את המסך עם I3C ו microseed. הוספת I3C למסך קריסטל אינה מגדילה את מספר כניסות ההתגבשות. עם ליסוזיים לבן ביצה תרנגולת, מספר התנאים ירד מ 31 ל 26.עם התחום Orf11 נמצא תנאי להיט יחיד במסך הפקד. הוספת I3C למסך גם נתן להיט אחד באותם תנאים. הוספת microseed ל באר הביאה לעלייה משמעותית במספר תנאי הלהיט וכתוצאה מכך עלייה של פי 2.1 ו-6 עבור ליסוזיים לבן ביצה ותחום Orf11 בהתאמה.תוצאה זו עולה בקנה אחד עם מחקרים אחרים בדיקת RMMS. והכי חשוב, הוספת I3C ו microseed למסך גם הגדילה את מספר תנאי הלהיט ביחס למסך הבקרה המדגים עלייה של פי 2.3 ו-7 עבור ליזויזים לבן ביצה ותחום Orf11 בהתאמה. הדבר מוכיח כי שיטת I3C RMMS יכולה לייצר ביעילות תנאים חדשים עבור גבישים נגזרים.גבישים מתנאים אלה ניתן לקצור ו לשמש כדי לפתור את מבנה הגביש. הן המבנה של תרנגולת ביצה לבן lysozyme Orf11 תחום יכול להיפתר עם phasing SAD על צינור ריקשה אוטומטית, באמצעות אות חריג מ I3C המדגים נגזרת מוצלחת על ידי מסך I3C RMMS. הצגנו פרוטוקול פשוט ויעיל לייצור גבישים באיכות גבוהה שמקורם במולקולת phasing I3C.היא ממזערת את מספר המסכים ואת שלבי הטיפול הגבישיים, ולכן היא מעניינת במיוחד ביולוגים מבניים החוקרים חלבונים חדשניים. אנו ממליצים בחום לייעל את גודל הגביש על ידי בדיקת דילול מלאי זרעים שונים שנעשו במהלך הכנת מלאי הזרעים. וצעד זה הושלם לאחר שמסכים ראשוניים נעשו.I3C זמין באופן נרחב וזה זול לרכוש ולכן אנו מאמינים שיטה זו היא בהישג ידם של רוב מעבדות ביולוגיה מבנית.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography של קריסטלים חלבון ו<em&gt; בסולו</em&gt; השתברות

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

גידול גבישים חלבון עם ממדים ברורים באמצעות כלים אוטומטיים התגבשות בשילוב עם בחיי עיר פיזור אור דינאמי

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

קינטי הקרנה של פעילות Nuclease באמצעות חומצות גרעין רגשים

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

יצירת חלבון מאוד ספציפי הנגרמת כימית מערכות דימריזציה על ידי בחירת בחירה באמצעות מבחר של קומבינטורית מתחם יחיד בספריית הנוגדן

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

הקרנה אסטרטגית ואפיון של הקומפלקס החזותי של החלבון GPCR-mini-G של התגבשות מוצלחת

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

אופטימיזציה של הצמיחה של גבישי אנדותיאפפסין לניסויי קריסטלוגרפיה סדרתיים

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

ביטוי חיידקי וטיהור של מטריקס אנושי Metalloproteinase-3 באמצעות כרומטוגרפיה זיקה

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...