Name: derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening
Uploaded: 2021-01-16T15:00:00
Duration: 14 min 4 s
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यह शोध ANSTO के हिस्से ऑस्ट्रेलियन सिंक्रोट्रॉन में एमएक्स1 बीमलाइन पर किया गया था । लेखक इस काम पर चर्चा के लिए शेरविन और ब्रूनिंग प्रयोगशालाओं के सदस्यों को स्वीकार करना चाहते हैं । लेखक डॉ संतोष पंजिकर और डॉ लिंडा व्हाट-शेरविन को भी स्वीकार करना चाहेंगे जिन्होंने इस प्रोटोकॉल का बीड़ा उठाने वाले मूल कार्य में योगदान दिया ।
निम्नलिखित धन स्वीकार किया है: ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (अनुदान नग। DP150103009 और DP160101450 कीथ ई. शेरविन के लिए); एडिलेड विश्वविद्यालय (ऑस्ट्रेलियाई सरकार अनुसंधान प्रशिक्षण कार्यक्रम जिया Quyen Truong और स्टेफनी गुयेन के लिए वजीफा छात्रवृत्ति) ।

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

आणविक प्रतिस्थापन के लिए एक उपयुक्त होमोलॉजी मॉडल के अभाव में एक उपन्यास प्रोटीन की संरचना निर्धारण के लिए प्रयोगात्मक चरणबद्ध की आवश्यकता होती है। इन तरीकों को प्रोटीन क्रिस्टल में भारी परमाणुओं के समावेश की आवश्यकता होती है जो संरचना निर्धारण पाइपलाइन में जटिलता का स्तर जोड़ता है और कई बाधाओं को पेश कर सकता है जिन्हें संबोधित किया जाना चाहिए। सेलेनोमेथियोनाइन और सेलेनोसिस्टीन का उपयोग करके लेबल की अभिव्यक्ति के माध्यम से भारी परमाणुओं को सीधे प्रोटीन में शामिल किया जा सकता है। चूंकि यह विधि महंगी, श्रमसाध्य है और इसके परिणामस्वरूप कम प्रोटीन पैदावार हो सकती है, क्रिस्टलीकरण की स्थिति पाए जाने और अवेलेबल प्रोटीन के साथ अनुकूलित होने के बाद लेबल किए गए प्रोटीन को अक्सर व्यक्त किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, क्रिस्टल को भारी परमाणुओं वाले समाधान में भिगोकर प्राप्त किया जा सकता हैजिसमें 22,63,64। यह विधि अक्सर उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल का उपयोग करती है और इसलिए एक मजबूत क्रिस्टलीकरण विधि पहले से ही विकसित होने के बाद की जाती है। इस विधि का उपयोग करके सफलतापूर्वक एक व्युत्पन्न क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए प्रक्रियाओं को भिगोने और विभिन्न चरणबद्ध यौगिकों की स्क्रीनिंग के आगे अनुकूलन की आवश्यकता होती है, इसलिए पहले से ही श्रमसाध्य प्रक्रिया में अधिक समय जोड़ते हैं।
भारी परमाणु के साथ प्रोटीन का सह-क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग चरण में किया जा सकता है, इस प्रकार प्रक्रिया को कुशलतापूर्वक सुव्यवस्थित करता है और क्रिस्टल हेरफेर चरणों को कम करता है जो नुकसान पहुंचा सकता है। हालांकि, अभी भी कुछ प्रारंभिक क्रिस्टलीकरण हिट प्राप्त करने के संभावित परिदृश्य और एक संगत भारी परमाणु यौगिक चुनने की समस्या मौजूद है। वर्तमान में उपलब्ध कई चरणबद्ध यौगिक आमतौर पर क्रिस्टलीकरण की स्थिति में पाए जाने वाले तेज़, बफ़र्स और एडिटिव्स के साथ असंगत हैं। वे सल्फेट और फॉस्फेट बफ़र्स में अघुलनशील हो सकते हैं, साइट्रेट और एसीटेट के लिए चेलेट, हेपेस और ट्रिस बफ़र्स के साथ प्रतिकूल प्रतिक्रिया करते हैं या डीटीटी और β-मर्केप्टोथेनॉल21द्वारा तनहा हो जाते हैं। चूंकि I3C चरणबद्ध यौगिक इन असंगतियों से पीड़ित नहीं है, इसलिए यह एक मजबूत चरणबद्ध यौगिक है जो कई अलग-अलग स्थितियों के लिए उत्तरदायी हो सकता है।
इस अध्ययन में, आई 3सी चरणबद्ध यौगिक और आरएमएमएस के एक साथ सह-क्रिस्टलीकरण के माध्यम से एसएडी चरणबद्ध के लिए तैयार व्युत्पन्न क्रिस्टल के उत्पादन की एक सुव्यवस्थित विधि प्रस्तुत की गई है। दोनों तकनीकों का संयोजन क्रिस्टलीकरण हिट की संख्या को बढ़ाता है, जिसमें कई स्थितियों में बेहतर आकृति विज्ञान और विवर्तन विशेषताएं होती हैं। Orf11 NTD और HEWL परीक्षण दोनों मामलों में, I3C-rMMS स्क्रीन में नई शर्तों की पहचान की गई थी जो I3C मौजूद नहीं होने पर अनुपस्थित थे। संभावित रूप से, I3C प्रोटीन के लिए अनुकूल रूप से बांध सकता है, क्रिस्टल संपर्कों के गठन और स्थिरीकरण को सुविधाजनक बना सकता है27। बदले में, यह क्रिस्टलीकरण को प्रेरित कर सकता है और संभवतः विवर्तन विशेषताओं में सुधार कर सकता है। विरल मैट्रिक्स स्क्रीन के साथ संगत यौगिक होने के अलावा, I3C अपने आंतरिक गुणों के कारण एक आकर्षक चरणबद्ध यौगिक भी है। कार्यात्मक समूह जो सुगंधित अंगूठी पाड़ पर आयोडीन के साथ वैकल्पिक होते हैं, प्रोटीन के लिए विशिष्ट बाध्यकारी की अनुमति देते हैं। इससे अधिक अधिभोग होता है और संभावित रूप से पृष्ठभूमि संकेत23को कम कर देता है । इसके अलावा, एक समभुज त्रिकोण में असंगत स्कैटरर्स की व्यवस्था उपसंरचना में स्पष्ट है और इसका उपयोग I3C(चित्रा 4B और 4C)के बाध्यकारी को तेजी से मान्य करने के लिए किया जा सकता है। अंत में, यह ट्यूनेबल सिंक्रोट्रॉन विकिरण के साथ-साथ क्रोमियम और कॉपर घूर्णन एनोड एक्स-रे स्रोतों के साथ एक असंगत संकेत का उत्पादन कर सकता है। इस प्रकार, इसे कई अलग-अलग कार्यप्रवाहों पर लागू किया जा सकता है। के रूप में I3C व्यापक रूप से उपलब्ध है और खरीद करने के लिए सस्ती है, इस दृष्टिकोण सबसे संरचनात्मक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए पहुंच के भीतर है ।
I3C-rMMS विधि का उपयोग करते समय कई प्रयोगात्मक विचारों को संबोधित किया जाना चाहिए। यदि प्रोटीन की प्रारंभिक क्रिस्टलीय सामग्री प्राप्त नहीं की जा सकती है तो इस विधि को लागू नहीं किया जा सकता है। मुश्किल मामलों में, एक समरूप प्रोटीन से क्रिस्टलीय सामग्री का उपयोग बीज स्टॉक उत्पन्न करने के लिए भी किया जा सकता है। आरएमएमएस के लिए इस क्रॉस-सीडिंग दृष्टिकोण ने कुछ आशाजनक परिणाम दिखाए हैं7। बीज स्टॉक के कमजोर पड़ने के माध्यम से क्रिस्टल संख्या का अनुकूलन एक महत्वपूर्ण कदम है, जिसे अनदेखा नहीं किया जाना चाहिए, ताकि उच्च गुणवत्ता वाले बड़े क्रिस्टल के उत्पादन और उपयुक्त विवर्तन डेटा प्राप्त करने की संभावना को अधिकतम किया जा सके। यदि असममित इकाई में कुछ I3C साइटों की पहचान की जाती है, तो क्रिस्टलीकरण के लिए अनुकूल परिस्थितियों को I3C की बढ़ी हुई एकाग्रता के साथ आगे अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह असंगत संकेत को अधिकतम करने और क्रिस्टल व्युत्पन्न सहायता करने के लिए I3C की अधिभोग में वृद्धि कर सकता है।
ऐसे मामले हो सकते हैं जहां यह तकनीक प्रोटीन क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए इष्टतम विधि नहीं हो सकती है। के रूप में एक प्रोटीन या प्रोटीन जटिल बढ़ जाती है के आकार, प्रोटीन की सतह पर I3C साइटों की सीमित संख्या संरचना को हल करने के लिए पर्याप्त चरणबद्ध शक्ति प्रदान नहीं कर सकते हैं । इन परिदृश्यों में जहां प्रोटीन का आकार चरणबद्ध रूप से बाधित होने की आशंका है, प्रोटीन की सेलेनोमेथियोनाइन लेबलिंग प्रोटीन को चरणबद्ध रूप से समाप्त करने के लिए अधिक व्यवहार्य दृष्टिकोण हो सकता है । यदि प्रोटीन में मेथियोनिन अवशेषों की पर्याप्त संख्या है (प्रति 100 अवशेषों में कम से कम एक मेथियोनिन होने की सिफारिश की65)और प्रोटीन में उच्च दक्षता सेलेनोइन निगमन प्राप्त किया जा सकता है (जैसे बैक्टीरियल अभिव्यक्ति सिस्टम66में), संरचना को चरणबद्ध करने के लिए कई उच्च अधिभोग सेलेनियम परमाणु क्रिस्टल में मौजूद होंगे।
इसके अलावा, कुछ प्रोटीन स्वाभाविक रूप से I3C के साथ व्युत्पन्न के लिए अनुपयुक्त हो सकते हैं। प्रोटीन पर I3C बाध्यकारी साइटें प्रोटीन संरचना पर निर्भर हैं। ऐसे प्रोटीन मौजूद हो सकते हैं जिनमें स्वाभाविक रूप से I3C बाध्यकारी के साथ संगत कुछ उजागर पैच होते हैं। इस प्रकार, यह अनिकट नहीं है कि I3C के साथ कुछ लक्षित प्रोटीन को सह-क्रिस्टलाइज करने में कठिनाइयां हो सकती हैं।

संरचनात्मक जीव विज्ञान के क्षेत्र में, एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी को मैक्रोमॉलिक्यूल्स की परमाणु-संकल्प संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए स्वर्ण मानक तकनीक माना जाता है। इसका उपयोग रोगों के आणविक आधार को समझने, तर्कसंगत दवा डिजाइन परियोजनाओं का मार्गदर्शन करने और एंजाइमों1,2के उत्प्रेरक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है। हालांकि संरचनात्मक डेटा ज्ञान का खजाना प्रदान करता है, प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण, क्रिस्टलीकरण और संरचना निर्धारण की प्रक्रिया बेहद श्रमसाध्य हो सकती है। कई बाधाओं को आमतौर पर सामना करना पड़ता है कि इन परियोजनाओं की प्रगति में बाधा और यह कुशलता से क्रिस्टल संरचना निर्धारण पाइपलाइन को कारगर बनाने के लिए संबोधित किया जाना चाहिए ।
पुनः संयोजन अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण के बाद, क्रिस्टलीकरण के लिए अनुकूल प्रारंभिक स्थितियों की पहचान की जानी चाहिए जो अक्सर एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी का एक दुरूह और समय लेने वाला पहलू होता है। इसअड़चनको कम करने के लिए ज्ञात और प्रकाशित स्थितियों को समेकित करने वाले वाणिज्यिक विरल मैट्रिक्स स्क्रीन विकसित किए गएहैं। हालांकि, अत्यधिक शुद्ध और केंद्रित प्रोटीन नमूनों का उपयोग करने के बावजूद इन प्रारंभिक स्क्रीन से कुछ हिट उत्पन्न करना आम बात है। स्पष्ट बूंदों को देखना इंगित करता है कि प्रोटीन क्रिस्टल को नाभिित करने के लिए आवश्यक अधिसंखन के स्तर तक नहीं पहुंच सकता है। क्रिस्टल नाभिक और विकास को प्रोत्साहित करने के लिए, पहले से मौजूद क्रिस्टल से उत्पादित बीजों को शर्तों में जोड़ा जा सकता है और यह क्रिस्टलीकरण अंतरिक्ष के बढ़ते नमूने के लिए अनुमति देता है। इरेटन और स्टोडार्ड ने सबसे पहले माइक्रोसीड मैट्रिक्स स्क्रीनिंग विधि5पेश की । खराब गुणवत्ता वाले क्रिस्टल को बीज स्टॉक बनाने के लिए कुचल दिया गया था और फिर नए विवर्तन-गुणवत्ता वाले क्रिस्टल उत्पन्न करने के लिए विभिन्न लवणों वाली क्रिस्टलीकरण स्थितियों में व्यवस्थित रूप से जोड़ा गया था जो अन्यथा नहीं बनते थे। इस तकनीक को डी आर्सी एट अल द्वारा और बेहतर बनाया गया था, जिन्होंने यादृच्छिक माइक्रोसीड मैट्रिक्स स्क्रीनिंग (आरएमएमएस) विकसित की जिसमें बीजों को अतिरिक्त मैट्रिक्स क्रिस्टलाइजेशन स्क्रीन6,7में पेश किया गया था। इससे क्रिस्टल की गुणवत्ता में सुधार हुआ और औसतन क्रिस्टलीकरण हिट की संख्या में 7 के कारक की वृद्धि हुई।
क्रिस्टल सफलतापूर्वक उत्पादित होने के बाद और एक्स-रे विवर्तन पैटर्न प्राप्त किया जाता है, 'चरण समस्या' को हल करने के रूप में एक और अड़चन का सामना करना पड़ता है। डेटा अधिग्रहण प्रक्रिया के दौरान, विवर्तन की तीव्रता (आयाम के वर्ग के आनुपातिक) दर्ज की जाती है लेकिन चरण की जानकारी खो जाती है, जिससे चरण की समस्या को जन्म दिया जाता है जो तत्काल संरचना निर्धारण8को रोकता है। यदि लक्ष्य प्रोटीन पहले से निर्धारित संरचना वाले प्रोटीन को उच्च अनुक्रम पहचान साझा करता है, तो आणविक प्रतिस्थापन का उपयोग चरण की जानकारी9,10, 11,12का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। यद्यपि यह विधि तेज और सस्ती है, मॉडल संरचनाएं उपलब्ध या उपयुक्त नहीं हो सकती हैं। होमोलॉजी मॉडल आधारित आणविक प्रतिस्थापन विधि की सफलता काफी गिर जाती है क्योंकि अनुक्रम पहचान 35%13से नीचे गिर जाती है। एक उपयुक्त होमोलॉजी मॉडल के अभाव में, एआरसीआईबोल्डो14, 15 और पर्याप्त16जैसे एबी इनिटियो विधियों का परीक्षण किया जा सकता है। ये विधियां आणविक प्रतिस्थापन के लिए शुरुआती बिंदुओं के रूप में गणना की भविष्यवाणी किए गए मॉडल या टुकड़ों का उपयोग करती हैं। पर्याप्त है, जो शुरुआती अंक के रूप में भविष्यवाणी फंदा मॉडल का उपयोग करता है, बड़े (>100 अवशेषों) प्रोटीन और प्रोटीन मुख्य रूप से β चादरें युक्त की संरचनाओं को हल करने के लिए संघर्ष । ARCIMBOLDO, जो एक बड़ी संरचना में विस्तार करने के लिए छोटे टुकड़ों को फिट करने का प्रयास करता है, उच्च रिज़ॉल्यूशन डेटा (≤2 Å) तक सीमित है और टुकड़ों को पूर्ण संरचना में विस्तारित करने के लिए एल्गोरिदम की क्षमता से सीमित है।
यदि आणविक प्रतिस्थापन विधियां विफल हो जाती हैं, तो आइसोमोर्फसरिप्लेसमेंट 17,18 और एक ही तरंगदैर्ध्य (एसएडी19)या कई तरंगदैर्ध्य (MAD20)पर असंगत बिखरने जैसे प्रत्यक्ष तरीकों का उपयोग किया जाना चाहिए। यह अक्सर वास्तव में उपन्यास संरचनाओं के लिए मामला होता है, जहां क्रिस्टल का गठन किया जाना चाहिए या भारी परमाणु के साथ प्राप्त किया जाना चाहिए। इसे भारी एटम यौगिक, रासायनिक संशोधन (जैसे आरएनए में 5-ब्रोमोरेसिल निगमन) या लेबल किए गए प्रोटीन अभिव्यक्ति (जैसे प्राथमिक संरचना में सेलेनोमेथिनोनाइन या सेलेनोसिस्टीन अमीनो एसिड को शामिल करना)21, 22के साथ भिगोने या सह-क्रिस्टलीकरण करके प्राप्त किया जा सकता है। यह क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया को और जटिल बनाता है और अतिरिक्त स्क्रीनिंग और अनुकूलन की आवश्यकता होती है।
I3C (5-अमीनो-2, 4, 6-ट्राइओओडोइसोफलिक एसिड) और बी 3 सी (5-अमीनो-2, 4, 6-ट्राइब्रोमोइसोफैथैलिक एसिड) सहित चरणबद्ध यौगिकों का एक नया वर्ग, पहले से मौजूदचरणबद्ध यौगिकों23,24,25पर रोमांचक लाभ प्रदान करता है। I3C और B3C दोनों में एक सुगंधित रिंग पाड़ की सुविधा है जिसमें प्रत्यक्ष चरणबद्ध तरीकों और अमीनो या कार्बोक्सिलेट कार्यात्मक समूहों के लिए आवश्यक असंगत स्कैटर की एक वैकल्पिक व्यवस्था है जो प्रोटीन के साथ विशेष रूप से बातचीत करते हैं और बाध्यकारी साइट विशिष्टता प्रदान करते हैं। भारी धातु समूहों की बाद की समभुज त्रिकोणीय व्यवस्था चरणबद्ध उपसंरचना के सरलीकृत सत्यापन के लिए अनुमति देती है। लेखन के समय, प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी) में 26 I3C-बाध्य संरचनाएं हैं, जिनमें से 20 को एसएडी चरणबद्ध26का उपयोग करके हल किया गया था ।
यह प्रोटोकॉल भारी धातु व्युत्पन्न और आरएमएमएस स्क्रीनिंग के तरीकों को मिलाकर संरचना निर्धारण पाइपलाइन की प्रभावकारिता में सुधार करता है ताकि क्रिस्टलीकरण हिट की संख्या में वृद्धि हो और क्रिस्टल व्युत्पन्न प्रक्रिया को सरल बनाया जा सके। हमने इस विधि का प्रदर्शन किया जिसमें मुर्गी के अंडे के सफेद lysozyme और बैक्टीरियोफेज पी6827से एक उपन्यास lysin प्रोटीन का डोमेन था। अत्यधिक स्वचालित ऑटो-रिक्शा संरचना निर्धारण पाइपलाइन का उपयोग करके संरचना समाधान का वर्णन किया गया है, विशेष रूप से I3C चरणबद्ध यौगिक के लिए सिलवाया गया है। अन्य स्वचालित पाइपलाइनें मौजूद हैं जिनका उपयोग ऑटोसोल28,एल्व्स29 और क्रैन 230जैसे किया जा सकता है। शेलक्ससी/डी/ई जैसे गैर-पूरी तरह से स्वचालित पैकेजों का उपयोग31,32,33भी किया जा सकता है। यह विधि विशेष रूप से शोधकर्ताओं के लिए फायदेमंद है जो पीडीबी में समरूप मॉडलों की कमी वाले प्रोटीन का अध्ययन कर रहे हैं, स्क्रीनिंग और अनुकूलन चरणों की संख्या को काफी कम करके। इस विधि के लिए एक शर्त प्रोटीन क्रिस्टल या लक्ष्य प्रोटीन का एक क्रिस्टलीय वर्षा है, जो पिछले क्रिस्टलीकरण परीक्षणों से प्राप्त की जाती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL disposable luer lock syringes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>T3SS10LAT</td>
			<td>Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used for hanging drop crystal tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-506</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22178</td>
			<td>Commonly referred to as I3C in the article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-297</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18X18-2</td>
			<td>Coverslips for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning vacuum grease</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-510</td>
			<td>Used for sealing hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette 0.1 &#956;L-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 2 &#956;L-20 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1153247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 20 &#956;L-200 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1152006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>HIR92601.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Approximately 95% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IndexHT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope illuminator</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>FT192/230</td>
			<td>Light source to illuminate crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/ION HT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Liquid Dispenser</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel with scalpel blade no. 15</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>LV-SMSCPO15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope&#160;</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>EMZ-5TR</td>
			<td>Microscope for visualising crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>RAVM1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening

एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी का उपयोग करके प्रोटीन संरचना स्पष्ट करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले विवर्तन क्रिस्टल और विवर्तन चरण समस्या के कम्प्यूटेशनल समाधान दोनों की आवश्यकता होती है। उपन्यास संरचनाओं जिनमें उपयुक्त होमोलॉजी मॉडल की कमी होती है, अक्सर प्रायोगिक चरण की जानकारी प्रदान करने के लिए भारी परमाणुओं के साथ प्राप्त होते हैं। प्रस्तुत प्रोटोकॉल कुशलता से एक भारी परमाणु अणु I3C (5-अमीनो-2,4,6-triiodoisophthalic एसिड) के साथ व्युत्पन्न के साथ यादृच्छिक माइक्रोसीडिंग मैट्रिक्स स्क्रीनिंग के संयोजन से प्राप्त प्रोटीन क्रिस्टल उत्पन्न करता है। क्रिस्टल जाली में I3C को शामिल करके, विवर्तन चरण समस्या को एकल तरंगदैर्ध्य असंगत फैलाव (एसएडी) चरणबद्ध का उपयोग करके कुशलतापूर्वक हल किया जा सकता है। I3C में आयोडीन परमाणुओं की समभुज त्रिकोण व्यवस्था एक सही विसंगतिकीय उपसंरचना के तेजी से सत्यापन के लिए अनुमति देता है । यह प्रोटोकॉल संरचनात्मक जीवविज्ञानियों के लिए उपयोगी होगा जो प्रायोगिक चरणबद्ध में रुचि के साथ क्रिस्टलोग्राफी-आधारित तकनीकों का उपयोग करके मैक्रोमॉलिकुलर संरचनाओं को हल करते हैं।

RMMS में I3C शामिल करने से व्युत्पन्न क्रिस्टल विकास का समर्थन करने वाली नई स्थितियां उत्पन्न हो सकती हैं एक साथ आरएमएमएस स्क्रीनिंग और आई 3सी व्युत्पन्न की प्रभावकारिता को दो प्रोटीन, मुर्गी अंडे सफेद लिसोजाइम (एचईडब्ल्यूएल, एक लिओफिलाइज्ड पाउडर के रूप में प्राप्त) और बैक्टीरियोफेज P68 से ख्यात Orf11 lysin N-टर्मिनल डोमेन (Orf11 NTD) में प्रदर्शित किया गया था। प्रत्येक प्रोटीन सहित चार अलग शर्तों के तहत खूंटी/आयन एचटी के खिलाफ जांच की गई थी: गैर वरीयता प्राप्त, वरीयता प्राप्त, I3C के साथ गैर वरीयता प्राप्त और I3C(चित्रा 1)के साथ वरीयता प्राप्त । दोनों प्रोटीन के लिए, I3C के एकमात्र इसके अलावा क्रिस्टलीकरण के लिए अनुकूल शर्तों की संख्या में वृद्धि नहीं की । Orf11 NTD के मामले में, केवल एक उपयुक्त स्थिति के साथ और I3C(चित्रा 1B) केबिना पहचान की गई थी । जब I3C को एचईडब्ल्यूएल स्क्रीन में जोड़ा गया था, तो हिट की संख्या 31 से घटाकर 26 कर दी गई थी, जो चरणबद्ध यौगिकों(चित्रा 1A)को पेश करते समय क्रिस्टलीकरण की अतिरिक्त जटिलताओं को रेखांकित करती थी। अन्य अध्ययनों के अनुरूप, आरएमएमएस स्क्रीन उत्पन्न करने के लिए वाणिज्यिक विरल मैट्रिक्स स्क्रीन में बीज जोड़ने से दोनों प्रोटीन के लिए संभावित क्रिस्टलीकरण की स्थिति की संख्या में काफी वृद्धि हुई, जिसके परिणामस्वरूप एचईडब्ल्यूएल और ऑर्फ 11 एनटीडी के लिए क्रमशः6,61 (चित्रा 1)में2.1और 6 गुना वृद्धि हुई। सबसे महत्वपूर्ण बात, I3C और बीज के एक साथ जोड़ एक गैर वरीयता प्राप्त स्क्रीन के सापेक्ष हिट की संख्या में वृद्धि हुई है, क्रमशः HEWL और Orf11 NTD के लिए एक २.३ और 7 गुना वृद्धि का प्रदर्शन । I3C की उपस्थिति में आरएमएमएस से कई क्रिस्टल उत्कृष्ट क्रिस्टल आकृति विज्ञान(चित्रा 2) दिखाते हैं।
सीडिंग I3C rMMS स्क्रीन में क्रिस्टल संख्या के सावधान नियंत्रण की अनुमति देता है माइक्रोसीडलिंग प्रयोगों में, क्रिस्टलीकरण परीक्षण में पेश किए गए बीजों की संख्या को बीज स्टॉक को कमजोर करके नियंत्रित किया जा सकता है और यह ड्रॉप7,36में नाभिक के सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है। यह अक्सर बड़े क्रिस्टल बनाने की अनुमति देता है क्योंकि नाभिक स्थलों पर प्रोटीन अणुओं की प्रतिस्पर्धा कम होती है। यह लाभ I3C-rMMS विधि तक भी फैली हुई है और एचईडब्ल्यूएल और ऑर्फ 11 एनटीडी दोनों में सफलतापूर्वक प्रदर्शित किया गया है। एक पतला बीज स्टॉक के साथ I3C-rMMS स्क्रीन से पहचाने गए क्रिस्टलीकरण की स्थिति का मनोरंजन कम लेकिन बड़ा क्रिस्टल(चित्रा 3)मिला।
एसएडी चरणबद्ध का उपयोग आरएमएमएस I3C स्क्रीन से प्राप्त क्रिस्टल से संरचनाओं को हल करने के लिए किया जा सकता है चित्रा 3 में दिखाए गए पतला बीज स्टॉक का उपयोग करके उगाए गए क्रिस्टल का उपयोग एक क्रिस्टल(चित्रा 4)से विवर्तन डेटा का उपयोग करके एसएडी चरणबद्ध का उपयोग करके प्रोटीन की संरचना को हल करने के लिए किया गया था। डेटा ऑस्ट्रेलियन सिंक्रोट्रॉन एमएक्स 1 बीमलाइन62पर एकत्र किया गया था। विस्तृत डेटा संग्रह और संरचना समाधान विवरणकहीं और 27वर्णित हैं ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig01.jpg"> चित्रा 1 - आरएमएमएस का उपयोग दो परीक्षण प्रोटीन के लिए I3C की उपस्थिति में क्रिस्टल विकास के लिए नई स्थितियां उत्पन्न करने के लिए किया गया था। 96 अच्छी तरह से वाष्प प्रसार क्रिस्टलीकरण स्क्रीन वाणिज्यिक विरल मैट्रिक्स स्क्रीन का उपयोग कर किया गया। (A)इंडेक्स एचटी स्क्रीन के साथ मुर्गी अंडे की सफेदी की जांच की गई। ट्रे को एचडब्ल्यूएल क्रिस्टल के साथ वरीयता प्राप्त 0.2 मीटर अमोनियम टार्ट्रेट डायबेसिक पीएच 7.0, 20% (डब्ल्यू/वी) पॉलीथीन ग्लाइकोल 3350 में उगाया गया था। (ख)जीवाणु पी68 से Orf11 एनटीडी का परीक्षण खूंटी/आयन स्क्रीन के साथ किया गया था । Orf11 NTD ट्रे गैर वरीयता प्राप्त स्क्रीन से हालत G12 से क्रिस्टल से वरीयता प्राप्त थे, नीले रंग में दिखाया गया है । क्रिस्टल विकास का समर्थन करने वाली स्थितियां लाल रंग में दिखाई जाती हैं। I3C की उपस्थिति और अनुपस्थिति में आरएमएमएस सीडिंग दोनों ने गैर-वरीयता प्राप्त ट्रे की तुलना में काफी अधिक क्रिस्टल हिट दिया। ट्रूओंग एट अल27से अनुकूलित चित्रा । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig02.jpg"> चित्रा 2 - वाष्प प्रसार परीक्षणों से उगाए गए क्रिस्टल की प्रतिनिधि छवियां चित्र 1 (ए) और (ख) में दिखाई गई हैं। ट्रूओंग एट अल27से अनुकूलित चित्रा । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig03.jpg"> चित्रा 3 - बीज स्टॉक को कमजोर करना आई 3सी-आरएमएमएस विधि का उपयोग करके पाए जाने वाले क्रिस्टलीकरण स्थिति में नाभिक को कम करने का एक प्रभावी तरीका है, जो क्रिस्टल की संख्या को नियंत्रित करने के लिए है। एक बूंद के भीतर नाभिक को कम करने के परिणामस्वरूप अक्सर क्रिस्टल बड़े आयामों तक बढ़ जाते हैं। ट्रूओंग एट अल27से अनुकूलित चित्रा । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig04.jpg"> चित्रा 4 - Orf11 NTD (PDB ID 6O43) और HEWL (PDB ID 6PBB) I3C-rMMS विधि का उपयोग कर सघन और ऑटो रिक्शा SAD चरणबद्ध का उपयोग कर हल किया गया। (A)एचईडब्ल्यूएल और ऑर्फ 11 एनटीडी की रिबन संरचनाओं को प्रायोगिक चरणबद्ध रूप से हल किया गया। (ख)आई3सी अणु एचईडब्ल्यूएल और ऑर्फ11 एनटीडी से बंधे । (ग) आई3 सी में असंगत आयोडीन परमाणुओं की व्यवस्था 6 Å के समभुज त्रिकोण में की जाती है । इस प्रकार चरणबद्ध उपसंरचना में इस त्रिकोण की उपस्थिति इंगित करती है कि उस स्थिति में एक I3C अणु है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61984fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

यह लेख विरल मैट्रिक्स स्क्रीन में नई क्रिस्टलीकरण की स्थिति उत्पन्न करने के लिए माइक्रोसीडिंग का उपयोग करके I3C (5-अमीनो-2, 4,6-ट्राइओडोडिसोफैथैलिक एसिड) के साथ प्राप्त प्रोटीन क्रिस्टल उत्पन्न करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। ट्रे तरल वितरण रोबोट या हाथ से उपयोग कर स्थापित किया जा सकता है।

रैंडम माइक्रोसीेड मैट्रिक्स स्क्रीनिंग का उपयोग करके I3C के साथ प्रोटीन क्रिस्टल का व्युत्पन्न

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

प्रोटीन क्रिस्टल की माइक्रोक्रिस्ट्रॉलोग्राफ़ी और<em&gt; सेलुलो में</em&gt; विवर्तन

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

अलग आयामों के साथ बढ़ती प्रोटीन क्रिस्टल का उपयोग कर स्वचालित क्रिस्टलीकरण में सीटू गतिशील प्रकाश बिखरने के साथ युग्मित

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

प्रतिलेखन फैक्टर के उच्च संवेदनशीलता माप-प्रतिस्पर्धी अनुमापन द्वारा डीएनए बाध्यकारी समानताएं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

एक पर झिल्ली पाचन तकनीक का उपयोग कर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरेक्शन का मूल्यांकन

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase अवरोधक स्क्रीनिंग में स्वयं इकट्ठे मानव प्रोटीन Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

न्यूक्लिक एसिड जांच का उपयोग कर न्यूक्लीज गतिविधि का काइनेटिक स्क्रीनिंग

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

एक संयोजन एकल डोमेन एंटीबॉडी लाइब्रेरी के स्टेपवाइज फाग चयन द्वारा अत्यधिक विशिष्ट रासायनिक प्रेरित प्रोटीन डामरीकरण सिस्टम बनाना

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

सफल क्रिस्टलीकरण के लिए विजुअल जीपीसीआर-मिनी-जी प्रोटीन सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स की रणनीतिक स्क्रीनिंग और लक्षण वर्णन

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

सीरियल क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों के लिए एंडोथियापेप्सिन क्रिस्टल के विकास का अनुकूलन

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

बैक्टीरियल अभिव्यक्ति और मानव मैट्रिक्स Metaloproteinase-3 के शुद्धिकरण आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...