Name: derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening
Uploaded: 2021-01-16T15:00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Questa ricerca è stata intrapresa sulla linea di fascio MX1 presso l'Australian Synchrotron, parte dell'ANSTO. Gli autori vorrebbero ringraziare i membri dei laboratori Shearwin e Bruning per le discussioni su questo lavoro. Gli autori vorrebbero anche riconoscere il Dr. Santosh Panjikar e la Dott.ssa Linda Whyatt-Shearwin che hanno contribuito al lavoro originale che ha aperto la strada a questo protocollo.
Sono riconosciuti i seguenti finanziamenti: Australian Research Council (grant Nos. DP150103009 e DP160101450 a Keith E. Shearwin); Università di Adelaide (Australian Government Research Training Program borsa di studio a Jia Quyen Truong e Stephanie Nguyen).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La determinazione della struttura di una nuova proteina in assenza di un modello di omologia adatto per la sostituzione molecolare richiede una fase sperimentale. Questi metodi richiedono l'incorporazione di atomi pesanti nel cristallo proteico, il che aggiunge un livello di complessità alla pipeline di determinazione della struttura e può introdurre numerosi ostacoli che devono essere affrontati. Gli atomi pesanti possono essere incorporati direttamente nella proteina attraverso l'espressione marcata usando selenometinina e selenocisteina. Poiché questo metodo è costoso, laborioso e può comportare minori rese proteiche, le proteine etichettate sono spesso espresse dopo che le condizioni di cristallizzazione sono state trovate e ottimizzate con proteine non etichettate. In alternativa, i cristalli possono essere derivati immergendosi in una soluzione contenente atomipesanti 22,63,64. Questo metodo utilizza spesso cristalli di alta qualità e viene quindi eseguito dopo che è già stato sviluppato un robusto metodo di cristallizzazione. Ottenere con successo un cristallo derivatizzato utilizzando questo metodo richiede un'ulteriore ottimizzazione delle procedure di ammollo e lo screening di diversi composti di fase, aggiungendo quindi più tempo a un processo già laborioso.
La co-cristallizzazione della proteina con l'atomo pesante può essere eseguita in fase di screening, semplificando così in modo efficiente il processo e riducendo le fasi di manipolazione del cristallo che possono causare danni. Tuttavia, esiste ancora lo scenario potenziale di ottenere pochi colpi iniziali di cristallizzazione e il problema di scegliere un composto atomico pesante compatibile. Molti composti di fase attualmente disponibili sono incompatibili con precipitanti, tamponi e additivi comunemente presenti in condizioni di cristallizzazione. Possono essere insolubili in tamponi solfati e fosfati, chelati a citrato e acetato, reagiscono sfavorevolmente con tamponi HEPES e Tris o vengono sequestrati da DTT e β-mercaptoetanolo21. Poiché il composto graduale I3C non soffre di queste incompatibilità, è un solido composto graduale che potrebbe essere suscettibile a molte condizioni diverse.
In questo studio viene presentato un metodo semplificato per produrre cristalli derivati pronti per la fase SAD attraverso la co-cristallizzazione simultanea del composto di fase I3C e rMMS. La combinazione di entrambe le tecniche aumenta il numero di colpi di cristallizzazione, con molte delle condizioni che hanno migliorato la morfologia e le caratteristiche di diffrazione. Sia nei casi di test ORF11 NTD che HEWL, sono state identificate nuove condizioni nella schermata I3C-rMMS che erano assenti quando I3C non era presente. Potenzialmente, I3C può legarsi favorevolmente alla proteina, facilitando la formazione e la stabilizzazione dei contatti cristallini27. A sua volta, questo può indurre cristallizzazione ed eventualmente migliorare le caratteristiche di diffrazione. Oltre ad essere un composto compatibile con schermi a matrice sparsa, I3C è anche un composto di fasatura attraente a causa delle sue proprietà intrinseche. I gruppi funzionali che si alternano allo iodio sull'impalcatura ad anello aromatico consentono un legame specifico con le proteine. Ciò porta a una maggiore occupazione e potenzialmente riduce il segnale di fondo23. Inoltre, la disposizione degli scatterer anomali in un triangolo equilatero è evidente nella sottostruttura e può essere utilizzata per convalidare rapidamente il legame di I3C(figure 4B e 4C). Infine, può produrre un segnale anomalo con radiazione di sincrotrone tonnibile, nonché sorgenti di raggi X anodici rotanti di cromo e rame. Pertanto, può essere applicato a molti flussi di lavoro diversi. Poiché L'I3C è ampiamente disponibile ed economico da acquistare, questo approccio è a portata di mano per la maggior parte dei laboratori di biologia strutturale.
Quando si utilizza il metodo I3C-rMMS, è necessario affrontare diverse considerazioni sperimentali. Questo metodo non può essere applicato se non è possibile ottenere materiale cristallino iniziale della proteina. Nei casi difficili, il materiale cristallino proveniente da una proteina omologa può anche essere utilizzato per generare lo stock di semi. Questo approccio di cross seeding a rMMS ha mostrato alcuni risultati promettenti7. L'ottimizzazione del numero di cristalli attraverso la diluizione dello stock di semi è un passo cruciale, che non dovrebbe essere trascurato, per massimizzare la possibilità di produrre cristalli di grandi dimensioni di alta qualità e acquisire dati di diffrazione adeguati. Se nell'unità asimmetrica sono identificati pochi siti I3C, le condizioni favorevoli alla cristallizzazione dovrebbero essere ulteriormente ottimizzate con una maggiore concentrazione di I3C. Ciò può aumentare l'occupazione di I3C per massimizzare il segnale anomalo e aiutare la derivazione del cristallo.
Ci possono essere casi in cui questa tecnica potrebbe non essere il metodo ottimale per derivare cristalli proteici. Con l'aumentare delle dimensioni di una proteina o di un complesso proteico, il numero limitato di siti I3C sulla superficie proteica potrebbe non fornire una potenza di fase sufficiente per risolvere la struttura. In questi scenari in cui si sospetta che le dimensioni delle proteine ostacolino la fase, l'etichettatura selenometinina della proteina può essere un approccio più praticabile alla graduale eliminazione della proteina. Se la proteina ha un numero adeguato di residui di metoionina nella proteina (raccomandata con almeno una metinina per 100residui 65)e si può ottenere un'incorporazione di selenomethionina ad alta efficienza in una proteina (come nei sistemi di espressionebatterica 66), nei cristalli saranno presenti più atomi di selenio ad alta occupazione per fasi della struttura.
Inoltre, alcune proteine potrebbero intrinsecamente non essere adatte per la derivazione con I3C. I siti di legame I3C sulle proteine dipendono dalla struttura proteica. Possono esistere proteine che naturalmente hanno poche patch esposte compatibili con il legame I3C. Pertanto, non è imprevedibile che ci possano essere difficoltà nel co-cristallizzare alcune proteine bersaglio con I3C.

Nel campo della biologia strutturale, la cristallografia a raggi X è considerata la tecnica gold standard per determinare le strutture a risoluzione atomica delle macromolecole. È stato ampiamente utilizzato per comprendere le basi molecolari delle malattie, guidare progetti razionali di progettazione di farmaci ed chiarire il meccanismo cataliticodegli enzimi 1,2. Sebbene i dati strutturali forniscano una ricchezza di conoscenze, il processo di espressione e purificazione delle proteine, cristallizzazione e determinazione della struttura può essere estremamente laborioso. Si riscontrano comunemente diverse strozzature che ostacolano lo svolgimento di questi progetti e questo deve essere affrontato per snellire in modo efficiente la pipeline di determinazione della struttura cristallina.
Dopo l'espressione ricombinante e la purificazione, devono essere identificate condizioni preliminari favorevoli alla cristallizzazione, che è spesso un aspetto arduo e dispendioso in termini di tempo della cristallografia a raggi X. Schermi a matrice sparsa commerciale che consolidano le condizioni note e pubblicate sono stati sviluppati per alleviare questo collo dibottiglia 3,4. Tuttavia, è comune generare pochi colpi da questi schermi iniziali nonostante l'uso di campioni proteici altamente puri e concentrati. Osservare gocce chiare indica che la proteina potrebbe non raggiungere i livelli di supersaturazione necessari per nucleare un cristallo. Per incoraggiare la nucleazione cristallina e la crescita, i semi prodotti da cristalli preesiste possono essere aggiunti alle condizioni e ciò consente un maggiore campionamento dello spazio di cristallizzazione. Ireton e Stoddard hanno introdotto per la prima volta il metodo di screening della matrice microseed5. Cristalli di scarsa qualità sono stati schiacciati per fare uno stock di semi e poi aggiunti sistematicamente a condizioni di cristallizzazione contenenti sali diversi per generare nuovi cristalli di qualità di diffrazione che altrimenti non si sarebbero formati. Questa tecnica è stata ulteriormente migliorata da D'Arcy et al. Ciò ha migliorato la qualità dei cristalli e aumentato il numero di colpi di cristallizzazione in media di un fattore 7.
Dopo che i cristalli sono stati prodotti con successo e si ottiene un modello di diffrazione a raggi X, si incontra un altro collo di bottiglia sotto forma di risoluzione del "problema di fase". Durante il processo di acquisizione dei dati, viene registrata l'intensità della diffrazione (proporzionale al quadrato dell'ampiezza) ma le informazioni di fase vengono perse, dando origine al problema di fase che interrompe la determinazione immediata dellastruttura 8. Se la proteina bersaglio condivide un'identità di sequenza elevata con una proteina con una struttura precedentemente determinata, la sostituzione molecolare può essere utilizzata perstimare le informazioni di fase 9,10,11,12. Sebbene questo metodo sia veloce ed economico, le strutture del modello potrebbero non essere disponibili o adatte. Il successo del metodo di sostituzione molecolare basato su modello di omologia diminuisce significativamente man mano che l'identità della sequenza scende al di sotto del 35%13. In assenza di un adeguato modello di omologia, è possibile testare metodi ab initio, come ARCIMBOLDO14, 15 e AMPLE16. Questi metodi usano modelli o frammenti computazicamente previsti come punti di partenza per la sostituzione molecolare. AMPLE, che utilizza modelli di esca previsti come punti di partenza, fatica a risolvere strutture di grandi (>100 residui) proteine e proteine contenenti prevalentemente β-sheets. ARCIMBOLDO, che tenta di inserire piccoli frammenti per estendersi in una struttura più grande, è limitato ai dati ad alta risoluzione (≤2 Å) e dalla capacità degli algoritmi di espandere i frammenti in una struttura completa.
Se i metodi di sostituzione molecolare falliscono, devono essere utilizzati metodi diretti come la sostituzione isomorfa17,18 e lo scattering anomalo a una singola lunghezza d'onda (SAD19)o a lunghezze d'onda multiple (MAD20). Questo è spesso il caso di strutture veramente nuove, dove il cristallo deve essere formato o derivatizzato con un atomo pesante. Questo può essere ottenuto immergendo o co-cristallizzando con un composto atomico pesante, modificazione chimica (come incorporazione di 5-bromodoracile nell'RNA) o espressione proteica marcata (come incorporare aminoacidi selenomethionina o selenocisteina nella struttura primaria)21,22. Ciò complica ulteriormente il processo di cristallizzazione e richiede ulteriore screening e ottimizzazione.
Una nuova classe di composti fasci, tra cui I3C (acido 5-ammino-2,4,6-triiodoisoftalico) e B3C (acido 5-ammino-2,4,6-tribromoisoftalico), offrono vantaggi entusiasmanti rispetto ai composti gradualipreesistesi 23,24,25. Sia I3C che B3C presentano un'impalcatura ad anello aromatico con una disposizione alternata di scatter anomali necessari per i metodi di fase diretta e gruppi funzionali ammino o carbossilati che interagiscono specificamente con la proteina e forniscono una specificità del sito legante. La successiva disposizione triangolare equilatero dei gruppi di metalli pesanti consente una convalida semplificata della sottostruttura a fasi. Al momento della stesura, ci sono 26 strutture legate all'I3C nella Protein Data Bank (PDB), di cui 20 sono state risolte utilizzando la fase26della SAD.
Questo protocollo migliora l'efficacia della tubazione di determinazione della struttura combinando i metodi di derivazione dei metalli pesanti e lo screening rMMS per aumentare contemporaneamente il numero di colpi di cristallizzazione e semplificare il processo di derivazione del cristallo. Abbiamo dimostrato che questo metodo era estremamente efficace con lisozima di albume d'uovo di gallina e un dominio di una nuova proteina di lisina dal batteriofago P6827. Viene descritta la soluzione di struttura che utilizza la pipeline di determinazione della struttura auto-risciò altamente automatizzata, specificamente su misura per il composto di fasatura I3C. Esistono altre pipeline automatizzate che possono essere utilizzate come AutoSol28, ELVES29 e CRANK230. Pacchetti non completamente automatizzati come SHELXC/D/E possono essere utilizzatianche 31,32,33. Questo metodo è particolarmente utile per i ricercatori che stanno studiando proteine prive di modelli omologhi nel PDB, riducendo significativamente il numero di fasi di screening e ottimizzazione. Un prerequisito per questo metodo sono i cristalli proteici o un precipitato cristallino della proteina bersaglio, ottenuto da precedenti studi di cristallizzazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL disposable luer lock syringes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>T3SS10LAT</td>
			<td>Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used for hanging drop crystal tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-506</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22178</td>
			<td>Commonly referred to as I3C in the article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-297</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18X18-2</td>
			<td>Coverslips for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning vacuum grease</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-510</td>
			<td>Used for sealing hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette 0.1 &#956;L-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 2 &#956;L-20 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1153247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 20 &#956;L-200 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1152006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>HIR92601.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Approximately 95% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IndexHT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope illuminator</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>FT192/230</td>
			<td>Light source to illuminate crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/ION HT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Liquid Dispenser</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel with scalpel blade no. 15</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>LV-SMSCPO15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope&#160;</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>EMZ-5TR</td>
			<td>Microscope for visualising crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>RAVM1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening

La spiegazione della struttura proteica mediante cristallografia a raggi X richiede sia cristalli diffrazione di alta qualità che soluzione computazionale del problema della fase di diffrazione. Le nuove strutture prive di un adeguato modello di omologia sono spesso derivati con atomi pesanti per fornire informazioni sperimentali sulla fase. Il protocollo presentato genera in modo efficiente cristalli proteici derivati combinando lo screening casuale della matrice di microseeding con la derivazione con una molecola atomica pesante I3C (acido 5-ammino-2,4,6-triiodoisoftalico). Incorporando I3C nel reticolo cristallino, il problema della fase di diffrazione può essere risolto in modo efficiente usando la fase di dispersione anomala a singola lunghezza d'onda (SAD). La disposizione triangolare equilatero degli atomi di iodio in I3C consente una rapida convalida di una corretta sottostruttura anomala. Questo protocollo sarà utile ai biologi strutturali che risolvono strutture macromolecolari utilizzando tecniche basate sulla cristallografia con interesse per la fase sperimentale.

L'integrazione di I3C in rMMS può generare nuove condizioni che supportano la crescita dei cristalli derivati L'efficacia dello screening simultaneo rMMS e della derivazione I3C è stata dimostrata in due proteine, il lisozima dell'albume di gallina (HEWL, ottenuto come polvere liofilizzata) e il dominio putativo Orf11 lysin N-terminale (Orf11 NTD) dal batteriofago P68. Ogni proteina è stata proiettata contro PEG/ION HT in quattro diverse condizioni, tra cui: non sementi, sementi, semi di I3C e sementi con I3C(Figura 1). Per entrambe le proteine, l'unica aggiunta di I3C non ha aumentato il numero di condizioni favorevoli alla cristallizzazione. Nel caso di Orf11 NTD, è stata identificata una sola condizione adeguata con e senza I3C(Figura 1B). Quando I3C è stato aggiunto agli schermi HEWL, il numero di colpi è stato ridotto da 31 a 26, evidenziando le complessità aggiunte della cristallizzazione quando si introducono composti fasci (Figura 1A). Coerentemente con altri studi, l'aggiunta di semi a schermi a matrice sparsa commerciali per generare uno schermo rMMS ha aumentato significativamente il numero di possibili condizioni di cristallizzazione per entrambe le proteine, con un aumento di 2,1 e 6 volte per HEWL e Orf11 NTD,rispettivamente 6,61 ( Figura1). Ancora più importante, l'aggiunta simultanea di I3C e seed ha aumentato il numero di hit rispetto a uno schermo non semiseed, dimostrando un aumento di 2,3 e 7 volte rispettivamente per HEWL e Orf11 NTD. Molti dei cristalli di rMMS in presenza di I3C mostrano un'eccellente morfologia cristallina (Figura 2).
La semina consente un attento controllo del numero di cristalli negli schermi I3C rMMS Negli esperimenti di microseeding, il numero di semi introdotti in una prova di cristallizzazione può essere controllato mediante diluizione dello stock di semi e ciò consente un controllo preciso della nucleazione nellagoccia 7,36. Questo spesso permette ai cristalli più grandi di formarsi poiché c'è una ridotta competizione di molecole proteiche nei siti di nucleazione. Questo vantaggio si estende anche al metodo I3C-rMMS ed è stato dimostrato con successo sia in HEWL che in Orf11 NTD. La ricreazione di una condizione di cristallizzazione identificata dallo schermo I3C-rMMS con uno stock di semi diluito ha prodotto meno cristalli ma più grandi (Figura 3).
La fase SAD può essere utilizzata per risolvere le strutture da cristalli derivati dallo schermo RMMS I3C I cristalli coltivati utilizzando lo stock di semi diluito mostrato nella figura 3 sono stati utilizzati per risolvere la struttura delle proteine utilizzando la fase SAD utilizzando i dati di diffrazione di un singolo cristallo (Figura 4). I dati sono stati raccolti sulla beamline Australian Synchrotron MX162. I dettagli dettagliati della soluzione di raccolta e struttura dei dati sono descritti altrove27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig01.jpg"> Figura 1 - rMMS è stato utilizzato per generare nuove condizioni per la crescita del cristallo in presenza di I3C per due proteine di prova. 96 schermi di cristallizzazione a diffusione del vapore sono stati eseguiti utilizzando schermi a matrice sparsa commerciali. (A) Il lisozima dell'albume di gallina è stato testato con lo schermo Index HT. I vassoi sono stati seminati con cristalli HEWL coltivati in 0,2 M di tartrato di ammonio dibasico pH 7.0, 20% (w/v) polietilene glicole 3350. (B) Orf11 NTD del batteriofago P68 è stato testato con lo schermo PEG/ION. I vassoi NTD Orf11 sono stati seminati da cristalli della condizione G12 dallo schermo non semiseed, mostrato in blu. Le condizioni che supportano la crescita del cristallo sono mostrate in rosso. La semina rMMS in presenza e assenza di I3C ha dato entrambi un numero significativamente maggiore di colpi di cristallo rispetto ai vassoi non sementi. Figura adattata da Truong etal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig02.jpg"> Figura 2 - Immagini rappresentative dei cristalli coltivati a partire dalle prove di diffusione del vapore mostrate nella figura 1, lettera a) e b). Figura adattata da Truong etal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig03.jpg"> Figura 3 - La diluizione dello stock di semi è un modo efficace per ridurre la nucleazione in una condizione di cristallizzazione trovata utilizzando il metodo I3C-rMMS, per controllare il numero di cristalli che si formano. La riduzione della nucleazione all'interno di una goccia spesso fa crescere i cristalli a dimensioni maggiori. Figura adattata da Truong etal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig04.jpg"> Figura 4 - Orf11 NTD (PDB ID 6O43) e HEWL (PDB ID 6PBB) sono stati cristallizzati utilizzando il metodo I3C-rMMS e risolti utilizzando la fase SAD auto-risciò. (A) Strutture a nastro dell'HEWL e dell'Orf11 NTD risolte mediante fase sperimentale. (B) Molecola I3C legata a HEWL e Orf11 NTD. (C) Gli atomi anomali di iodio in I3C sono disposti in un triangolo equilatero di 6 Å. Quindi la presenza di questo triangolo nella sottostruttura di fase indica che c'è una molecola I3C in quella posizione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61984fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Questo articolo presenta un metodo per generare cristalli proteici derivati con I3C (acido 5-ammino-2,4,6-triiodoisoftalico) utilizzando il microseeding per generare nuove condizioni di cristallizzazione negli schermi a matrice sparsa. I vassoi possono essere impostati utilizzando robot di erogazione di liquidi o a mano.

Derivazione di cristalli proteici con I3C utilizzando lo screening casuale della matrice microseed

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Questo è un protocollo di cristallizzazione progettato per ottimizzare la crescita di un cristallo proteico mentre allo stesso tempo deriva la proteina con una molecola di fase per determinare la struttura di una proteina mediante cristallografia a raggi X. Per determinare la struttura cristallina a raggi X di una proteina completamente nuova, le condizioni di cristallizzazione sono ottimizzate per produrre cristalli di qualità. Nel caso di una proteina completamente nuova, gli atomi pesanti devono essere introdotti nel cristallo per produrre un cristallo derivatizzato.I dati di diffrazione dei raggi X vengono raccolti dal cristallo derivatizzato e devono essere risolti computazalmente per produrre una struttura cristallina a raggi X. Cristallizzazione e derivitizzazione sono entrambi processi laboriosi. Per affrontare queste strozzature, abbiamo ideato una procedura di screening ottimizzata che contemporaneamente raggiunge entrambi questi obiettivi.Questo protocollo utilizza una tecnica precedentemente sviluppata nota come screening casuale della matrice di microseed. Cristalli o precipitato cristallino vengono frantumati in microseedi che possono essere utilizzati per iniziare la crescita cristallina in condizioni completamente indipendenti. Allo stesso tempo, introduciamo una molecola di fase chiamata I3C nella condizione di cristallizzazione.Questa molecola fornisce un grande segnale anomalo che permette alla struttura di essere risolta da una singola lunghezza d'onda anomica di discussione graduale. Per gli utenti che non hanno familiarità con il dimensionamento sperimentale delle strutture cristalline presentiamo una pipeline software intuitiva per automatizzare parzialmente la soluzione di struttura adattandosi per utilizzare il segnale anomalo di I3C. Il primo passo è creare un magazzino I3C.Misurare 120 milligrammi di I3C in un tubo di microcentrifugo. Aggiungere 200 microlitri di due idrossido di litio molare al tubo del microcentrifugo. Il riscaldamento del tubo a 40-60 gradi e il vortice possono essere utilizzati per incoraggiare la dissoluzione.L'unico stock molare di soluzione di litio I3C dovrebbe essere marrone. Due metodi possono essere utilizzati per introdurre I3C allo stock proteico. Litio I3C può essere aggiunto direttamente allo stock proteico.3,75 microlitri a 30 microlitri di I3C possono essere aggiunti a 150 microlitri di proteine per dare una concentrazione compresa tra cinque e 14 millimolari. Alcune proteine possono precipitare a contatto con alte concentrazioni di I3C. In questi casi, il litio I3C può essere aggiunto a un tampone di diluizione proteica che è tampone abbinato alla proteina campione a una concentrazione finale compresa tra 10 e 80 millimolare.Aggiungere 150 microlitri del tampone di diluizione proteica a 150 microlitri di campione proteico. Una sonda di vetro per schiacciare i cristalli è realizzata con una pipetta Pasteur in vetro. Con un bruciatore Bunsen sulla fiamma blu, scaldare la pipetta Pasteur verso il centro.Utilizzando un paio di pinzette, estrarre le estremità della pipetta Pasteur in un diametro sottile inferiore a 0,3 millimetri. Tenere quel segmento nella fiamma per separare la pipetta a questo punto e arrotondare l'estremità della pipetta per completare la sonda di vetro. Questo è un esempio di come dovrebbe apparire la pipetta di vetro.Le frane di cristallo potrebbero anche essere ordinate da fornitori di terze parti in alternativa alla creazione del proprio stock di microseed A generato schiacciando cristalli proteici o precipitati cristallini. Posizionare cinque tubi di microcentrifugo da 1,5 ml sul ghiaccio. Al microscopio leggero, selezionare i migliori cristalli morfologici o precipitati cristallini che possono essere sacrificati.Per 96 vassoi di cristallizzazione del pozzo aprire il pozzo tagliando il nastro di tenuta in plastica. Per appendere i vassoi di caduta, lo scivolo del coperchio può essere rimosso utilizzando una pinzetta e invertito su una superficie piana. Trasferire 70 microlitri di soluzione di serbatoio in uno dei tubi di microcentrifugo e raffreddare sul ghiaccio.Ai tubi rimanenti, trasferire 90 microlitri di soluzione di serbatoio ad esso e tornare al ghiaccio per raffreddare. Se il volume insufficiente del serbatoio è presente, il serbatoio di cristallizzazione può essere effettuato mescolando i reagenti appropriati e può essere utilizzato. Agitare i cristalli nella goccia di cristallizzazione usando la sonda di vetro schiacciarla accuratamente.I progressi possono essere monitorati al microscopio fino a quando non sono visibili cristalli o materiale cristallino. Trasferire tutto il liquido dalla goccia al tubo di microcentrifugo contenente 70 microlitri di soluzione di serbatoio. Mescolare pipettando su e giù.Trasferire da due a tre microlitri di miscela al pozzo e risciacquare il pozzo tubazione su e giù. Trasferire la miscela nel tubo di microcentrifugo. Questo passaggio di risciacquo deve essere ripetuto ancora una volta.Il tubo di microcentrifugo deve essere tenuto freddo da questo punto in avanti per evitare la fusione dei microseedi. Vortice il tubo alla massima velocità a quattro gradi per circa tre minuti raffrecciando regolarmente il tubo sul ghiaccio per evitare il surriscaldamento. effettuare una diluizione seriale su 10 del patrimonio di semi trasferendo in sequenza 10 microlitri tra le soluzioni del serbatoio refrigerato.Tra le diluizioni dello stock di semi, il tubo deve essere vortice. Le scorte di semi che non verranno utilizzate immediatamente, devono essere conservate in un congelatore ultra freddo meno 80 gradi. Uno schermo a matrice di microseed ben casuale può essere impostato utilizzando un robot di erogazione del liquido.Posizionare lo stock di semi, la soluzione di stock proteico integrata con I3C e lo schermo di cristallizzazione nel robot. Utilizzando il robot trasferire 75 microlitri dallo schermo di cristallizzazione al vassoio del pozzo 96. Aggiungere un microlitro alla goccia di cristallizzazione e 74 microlitri al serbatoio.Trasferire un microlitro di proteine integrato con I3C alla goccia di cristallizzazione. Trasferire 0,1 microlitri di materiale di semi alla goccia di cristallizzazione. Sigillare la piastra utilizzando nastro adesivo.Gli schermi a goccia appesi possono essere impostati in 24 vassoi di cristallizzazione a goccia ben appesi. Ungere i bordi dei pozzi di caduta appesi. Trasferire 500 microlitri di soluzione di cristallizzazione nel serbatoio.Vicino al centro di uno scivolo di copertura in vetro posizionare una goccia di microlitro di soluzione di cristallizzazione. A questa goccia, aggiungere un microlitro di proteine integrato con litio I3C e 0,1 microlitri di stock di semi. Invertire lo scivolo del coperchio e sigillare bene la cristallizzazione spingendo il coperchio scivolare nel grasso.I vassoi di caduta e sigillatura appesi vengono incubati a temperatura costante per consentire la forma dei cristalli. Dovrebbero essere regolarmente ispezionati al microscopio per la crescita dei cristalli. Dopo che i dati di diffrazione sono stati ottenuti, integrati e scalati come spiegato nel protocollo scritto accompagnato, la pipeline automatizzata di determinazione della struttura cristallina Auto-Rickshaw può essere utilizzata per risolvere il problema di fase e modellare la proteina.Nella pagina di destinazione Auto-Risciò fare clic sul pulsante procedi. Inserisci la tua e-mail istituzionale nel modulo Web Autori risciò e fai clic su procedi con l'esecuzione di Autori risciò. Per le proteine senza un modello moto di omologia eseguire il protocollo SAD di Auto-Risciò in modalità avanzata.Immettere i parametri richiesti. Selezionare la proteina come tipo di molecola. Immettere la lunghezza d'onda della raccolta dati negli angstrom.Così come io come elemento di sottostruttura per indicare gli atomi di iodio sono stati usati. Selezionare il tipo di sottostruttura I3C per indicare che I3C era la molecola di fase. Selezionare sub_direct come metodo di determinazione della sottostruttura.Selezionarne tre come numero di sottostrutture previste per monomero. Immetterne uno come limite di prenotazione della ricerca della sottostruttura. Ciò consente all'auto-risciò di determinare automaticamente un taglio di risoluzione adatto.Immettere il numero di residui in un singolo monomero, il gruppo spaziale del set di dati e il numero di molecole nell'unità asimmetrica in base al coefficiente di Matthews. Seleziona il livello di diffusione appropriato dei dati a raggi-X che si adatta alle tue esigenze. Immettere i dati anomali come file impostato vuoto.Inserire la sequenza proteica come file SEQ, PIR o TXT. Inserisci il tuo indirizzo email istituzionale. I risultati ti vengono consegnati tramite un link web inviato all'indirizzo e-mail fornito.Se Auto-Risciò non riesce a risolvere la struttura utilizzando la sottostruttura determinata che convalida la sottostruttura, potrebbe essere d'aiuto nella risoluzione dei problemi della soluzione della struttura. Scarica l'elenco dei siti di atomi pesanti dalla pagina dei risultati di Auto-Risciò. È un collegamento ipertestuale chiamato siti atomi pesanti.Questo scarica un file di testo con i siti atomi pesanti. Modificare l'estensione del file da txt a pdb. Aprire il file pdb in Coot.Attiva la simmetria per vedere tutti gli atomi pesanti delle unità asimmetriche vicine. Misurare le distanze tra gli atomi pesanti, anche tra unità asimmetriche. I3C apparirà come un triangolo equilatero con una lunghezza laterale di sei angstrom.La presenza di un triangolo con queste dimensioni indica che i posizionamenti di quegli atomi pesanti sono corretti. Se la sottostruttura di esecuzione auto-risciò non è corretta, è possibile testare altre impostazioni auto-risciò come discusso nel protocollo scritto. Il metodo I3C RMMS è stato testato su due proteine, il lisozima bianco uovo di gallina utilizzando lo schermo in HT di Hampton Research e il dominio della proteina Orf11 lisina dal batteriofago P68.Sono stati allestiti schermi completi per ogni proteina corrispondente alla schermata di controllo senza I3C o microseed, schermo con microseed aggiunto, schermo con I3C e infine schermo con I3C e microseed. L'aggiunta di I3C a uno schermo di cristallo non sembra aumentare il numero di riscontri di cristallizzazione. Con il lisozima dell'albume di gallina, il numero di condizioni è sceso da 31 a 26.Con il dominio Orf11 è stata trovata una singola condizione di hit nella schermata di controllo. L'aggiunta di I3C allo schermo ha anche dato un singolo colpo nelle stesse condizioni. L'aggiunta di microseed al pozzo ha comportato un aumento significativo del numero di condizioni di hit con conseguente aumento di 2,1 e sei volte rispettivamente per il lisozima dell'uovo di gallina e il dominio Orf11.Questo risultato è coerente con altri studi che testano RMMS. Ancora più importante, l'aggiunta di I3C e microseed su uno schermo ha anche aumentato il numero di condizioni di hit relative alla schermata di controllo dimostrando un aumento di 2,3 e sette volte rispettivamente per il lisozima dell'albume di gallina e il dominio Orf11. Ciò dimostra che il metodo I3C RMMS può produrre in modo efficiente nuove condizioni per i cristalli derivati.I cristalli di queste condizioni potrebbero essere raccolti e utilizzati per risolvere la struttura cristallina. Sia la struttura del dominio orf11 dell'uovo di gallina potrebbe essere risolta con la fase SAD sulla pipeline Auto-Risciò, utilizzando il segnale anomalo di I3C che dimostra una derisione riuscita da parte dello schermo I3C RMMS. Abbiamo presentato un protocollo semplice ed efficiente per produrre cristalli di alta qualità derivatizzati con la molecola di fase I3C.Riduce al minimo il numero di schermi e passaggi di movimentazione cristallina, ed è quindi di particolare interesse per i biologi strutturali che studiano nuove proteine. Si consiglia vivamente di ottimizzare le dimensioni del cristallo testando diverse diluizioni dello stock di semi che sono state effettuate durante la preparazione del campione di semi. E questo passaggio è completato dopo che le schermate iniziali sono state fatte.I3C è ampiamente disponibile ed è economico da acquistare e quindi crediamo che questo metodo sia alla portata della maggior parte dei laboratori di biologia strutturale.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcristallografia dei cristalli proteici e<em&gt; In Cellulo</em&gt; Diffrazione

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Ricerca

Biochimica

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Cristalli della proteina crescente con dimensioni distinte utilizzando automatizzato cristallizzazione accoppiato con In Situ dispersione della luce dinamica

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Alta sensibilità misura dell'affinità di legame di DNA di fattore di trascrizione per titolazione competitivo mediante microscopia a fluorescenza

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Valutazione delle interazioni tra proteine e proteine utilizzando una tecnica di digestione On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Screening dell'inibitore della kinasi in microarray proteici umane auto-assemblati

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Screening cinetico dell'attività nucleana utilizzando sonde con acido Nucleic

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine altamente specifici indotta chimicamente mediante la selezione stepwise di phage di una biblioteca combinatoria di anticorpi a dominio singolo

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Screening strategico e caratterizzazione del complesso di segnalazione delle proteine Visual GPCR-mini-G per una cristallizzazione di successo

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Ottimizzazione della crescita dei cristalli di endotiapepsina per esperimenti di cristallografia seriale

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Espressione batterica e purificazione della metalloproteinasi-3 della matrice umana mediante cromatografia di affinità

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...