Name: derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening
Uploaded: 2021-01-16T15:00:00
Duration: 14 min 4 s
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この研究は、ANSTOの一部であるオーストラリアのシンクロトロンでMX1ビームラインで行われました。著者らは、この研究に関する議論のためにシアウィンとブランニング研究所のメンバーを認めたいと思います。著者らはまた、このプロトコルを開拓した元の研究に貢献したサントシュ・パンジカール博士とリンダ・ホワイアット・シアウィン博士を認めたいと考えています。
次の資金が認められています:オーストラリア研究評議会(グラントNos.DP150103009とDP160101450からキース・E・シアウィンへ;アデレード大学(オーストラリア政府研究訓練プログラムは、ジア・クイエン・チュオンとステファニー・グエンに奨学金を得る)。

著者らは開示するものは何もない。

分子置換のための適切な相同性モデルがない場合の新規タンパク質の構造決定には、実験的なフェスを必要とする。これらの方法は、構造決定パイプラインに複雑さのレベルを追加し、対処しなければならない多くの障害を導入することができるタンパク質結晶に重原子を組み込む必要があります。重原子は、セレノメチオニンおよびセレノシステインを用いた標識発現を介してタンパク質に直接組み込むことができる。この方法は高価であり、手間がかかり、より低いタンパク質収率をもたらし得る、標識されたタンパク質は、結晶化条件が発見され、標識されていないタンパク質で最適化された後にしばしば発現される。あるいは、結晶は、重原子22、63、64を含む溶液に浸すことによって誘導体化することができる。この方法は、多くの場合、高品質の結晶を使用し、堅牢な結晶化方法が既に開発された後に行われます。この方法を用いて誘導体化結晶を得るためには、浸漬手順のさらなる最適化と異なるフェス化合物のスクリーニングが必要であり、すでに面倒なプロセスに時間を追加します。
重原子とタンパク質の共結晶化は、スクリーニング段階で行うことができるので、プロセスを効率的に合理化し、損傷を引き起こす可能性のある結晶操作ステップを低減することができます。しかし、まだいくつかの初期結晶ヒットを得る潜在的なシナリオと互換性のある重原子化合物を選択する問題が存在します。現在入手可能な多くのフェス化合物は、結晶化条件で一般的に見られる沈殿剤、緩衝剤および添加物と相容れない。これらは、硫酸およびリン酸塩緩衝液に不溶性であり、クエン酸塩および酢酸塩に対して、HEPESおよびTrisバッファーと好ましくない反応をするか、またはDTTおよびβ-メルカプトエタノール21によって隔離される。I3Cフェス化合物はこれらの非互換性に苦しんでいないので、多くの異なる条件に適している可能性がある堅牢なフェスチン化合物です。
本研究では、I3Cフェース化合物とrMMSの同時共結晶化を通じてSADフェージングの準備ができて誘導体化結晶を作製する合理化された方法を提示する。両方の技術の組み合わせは、形態と回折特性を改善した条件の多くを持つ結晶化ヒットの数を増加させます。Orf11 NTD と HEWL の両方のテストケースで、I3C-rMMS 画面の新しい条件が、I3C が存在しないときに存在しなかったことが確認されました。潜在的に、I3Cはタンパク質に良好に結合し、結晶接点27の形成および安定化を促進する。この結果、結晶化を誘導し、回折特性が向上する可能性があります。疎なマトリックススクリーンと互換性のある化合物であることに加えて、I3Cは、その本質的な特性のために魅力的なフェス化合物でもあります。芳香環足場上のヨウ素と交互に作用する官能基は、タンパク質に特異的な結合を可能にする。これは、より大きな占有率につながり、潜在的にバックグラウンド信号23を減少させます。さらに、正三角形における異常散乱散乱装置の配置は、部分構造において明らかであり、I3Cの結合を迅速に検証するために使用することができる(図4B および 4C)。最後に、調整可能な放射光、クロム、銅回転アノードX線源を用いた異常信号を生成することができます。したがって、多くの異なるワークフローに適用できます。I3Cは広く利用可能で購入コストが安いため、このアプローチはほとんどの構造生物学研究所にとって手の届くところにあります。
I3C-rMMS メソッドを使用する場合は、いくつかの実験的な考慮事項に対処する必要があります。タンパク質の初期結晶性材料が得られない場合、この方法は適用できません。困難な場合には、相同タンパク質からの結晶性物質を使用して種子ストックを生成することもできる。rMMSへのこのクロスシードアプローチは、いくつかの有望な結果を示しています 7.種子ストックの希釈によって結晶数を最適化することは、高品質の大きな結晶を生成し、適切な回折データを取得する可能性を最大化するために、見逃してはならない重要なステップです。非対称ユニットで同定されたI3C部位が少ない場合、I3C濃度の上昇により、結晶化に役立つ条件をさらに最適化する必要があります。これは、異常な信号を最大化し、結晶誘導体化を助けるためにI3Cの占有率を増加させる可能性があります。
この手法がタンパク質結晶を誘導する最適な方法ではない場合があります。タンパク質またはタンパク質複合体のサイズが大きくなるにつれて、タンパク質表面上の限られた数のI3C部位は、構造を解決するのに十分なフェージングパワーを提供しない場合がある。タンパク質サイズがフェスを妨げていると疑われるこれらのシナリオでは、タンパク質のセレノメチオニン標識は、タンパク質をフェースするより実行可能なアプローチである可能性があります。タンパク質がタンパク質に十分な数のメチオニン残基を有する場合(100残基あたり少なくとも1つのメチオニンを有することを推奨する65)、高効率のセレノメチオニンをタンパク質に組み込むこと(細菌発現系66など)、複数の高占有セレン原子が結晶中に存在して相相構造に存在する。
また、一部のタンパク質は、I3Cによる誘導体化には本質的に適していない場合があります。タンパク質上のI3C結合部位は、タンパク質構造に依存する。I3C結合と互換性のある露出したパッチが自然にほとんど存在しないタンパク質が存在する可能性があります。したがって、I3Cと一部の標的タンパク質を共結晶化することは困難である可能性があることは予測できない。

構造生物学の分野では、X線結晶学は、高分子の原子分解能構造を決定するゴールドスタンダード技術と見なされています。疾患の分子基盤を理解し、合理的な薬剤設計プロジェクトを導き、酵素1,2の触媒機構を解明するために広く利用されている。構造データは豊富な知識を提供しますが、タンパク質の発現と精製、結晶化、構造決定のプロセスは非常に面倒です。これらのプロジェクトの進行を妨げるボトルネックがいくつか発生することが多く、結晶構造決定パイプラインを効率的に合理化するために対処する必要があります。
組み換え式と精製の後、結晶化を助長する予備的な条件を特定する必要があり、これはしばしばX線結晶学の困難で時間のかかる側面である。既知の条件と公開された条件を統合する商用のまばらな行列画面は、このボトルネックを緩和するために開発されています3,4.しかし、非常に純粋で濃縮されたタンパク質サンプルを使用しているにもかかわらず、これらの初期スクリーンから少数のヒットを生成することが一般的です。透明な滴を観察することは、タンパク質が結晶を核生成するために必要な過飽和レベルに達していない可能性があることを示しています。結晶の核化と成長を促進するために、既存の結晶から生成された種子を条件に加えることができ、これは結晶化空間のサンプリングを増加させることができます。アイルトンとストッダードは、最初にマイクロシードマトリックススクリーニング方法5を導入しました。質の悪い結晶を粉砕して種子ストックを作り、異なる塩を含む結晶化条件に体系的に添加し、他の方法では形成されなかった新しい回折品質の結晶を生成しました。この技術は、予備のマトリックス結晶化スクリーン6,7に種子を導入したランダムマイクロシードマトリックススクリーニング(rMMS)を開発したD'Arcyらによってさらに改善された。これにより、結晶の品質が向上し、平均して結晶化ヒット数が7倍増加しました。
結晶が正常に生成され、X線回折パターンが得られた後、「位相問題」を解決する形で別のボトルネックが発生します。データ取得処理の間、回折の強度(振幅の二乗に比例)が記録されるが、位相情報が失われ、直ちに構造判定8を停止する位相問題を生じる。標的タンパク質が以前に決定された構造を有するタンパク質に高い配列同一性を共有する場合、分子置換を用いて相情報9、10、11、12を推定することができる。この方法は高速で安価ですが、モデル構造は利用できないか、または適切でない場合があります。相同性モデルベースの分子置換法の成功は、配列同一性が35%13を下回るにつれて大幅に低下する。適切な相同性モデルがない場合、AB initioメソッド、例えばARCIMBOLDO14、15およびAMPLE16、試験することができる。これらの方法は、分子置換の出発点として計算予測モデルまたはフラグメントを使用します。予測されたおとりモデルを出発点として使用するAMPLEは、主にβシートを含む大規模な(>100残基)タンパク質およびタンパク質の構造を解決するのに苦労しています。より大きな構造に拡張するために小さな断片を収めようとするARCIMBOLDOは、高解像度データ(≤2 Å)と、アルゴリズムがフラグメントを完全な構造に拡張する能力に限定されます。
分子置換法が失敗した場合、単一波長(SAD19)または複数波長(MAD20)における同型置換17、18および異常散乱などの直接的な方法を用いる必要がある。これは、結晶を形成または重い原子で誘導しなければならない本当に新しい構造のためにしばしば当てはまりません。これは、重原子化合物と共結晶化したり、化学修飾(RNAに5-ブロモウラシルを組み込むなど)または標識タンパク質発現(セレノメチオニンまたはセレノシステインアミノ酸を一次構造に組み込むなど)21,22に浸すことによって達成できる。これはさらに結晶化プロセスを複雑にし、追加のスクリーニングと最適化を必要とします。
I3C(5-アミノ-2,4,6-トリヨードイソフタル酸)およびB3C(5-アミノ-2,4,6-トリブロマイソフタル酸)を含む新しいクラスのフェージング化合物は、既存のフェージング化合物23、24、25よりもエキサイティングな利点を提供します。I3CとB3Cの両方は、タンパク質と特異的に相互作用し、結合部位特異性を提供する直接フェース法およびアミノまたはカルボキシレート官能基に必要な異常散乱の交互配置を有する芳香環足場を特徴とする。重金属基のその後の正三角形配置により、フェス構造の検証が簡単になります。執筆時点では、タンパク質データバンク(PDB)には26のI3C結合構造があり、そのうち20個はSADフェス処理26を使用して解決された。
このプロトコルは、重金属誘導体化とrMMSスクリーニングの方法を組み合わせて、同時に結晶化ヒットの数を増やし、結晶誘導体化プロセスを簡素化することによって、構造決定パイプラインの有効性を向上させます。我々は、この方法が、鶏卵白リソザイムおよびバクテリオファージP6827からの新規リジンタンパク質のドメインと非常に効果的であることを実証した。高度に自動化された自動人力車構造決定パイプラインを用いた構造溶液が記載され、具体的にはI3Cフェス化合物に合わせた。オートソル28、ELVES29 、および CRANK230など、他の自動化されたパイプラインが存在します。SHELXC/D/E などの完全に自動化されていないパッケージも31、32、33を使用できます。この方法は、PDBで相同モデルを欠くタンパク質を研究している研究者にとって特に有益であり、スクリーニングおよび最適化のステップの数を大幅に減らすことによって有用である。この方法の前提条件は、タンパク質結晶または標的タンパク質の結晶性沈殿であり、以前の結晶化試験から得られる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL disposable luer lock syringes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>T3SS10LAT</td>
			<td>Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used for hanging drop crystal tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-506</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22178</td>
			<td>Commonly referred to as I3C in the article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-297</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18X18-2</td>
			<td>Coverslips for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning vacuum grease</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-510</td>
			<td>Used for sealing hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette 0.1 &#956;L-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 2 &#956;L-20 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1153247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 20 &#956;L-200 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1152006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>HIR92601.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Approximately 95% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IndexHT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope illuminator</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>FT192/230</td>
			<td>Light source to illuminate crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/ION HT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Liquid Dispenser</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel with scalpel blade no. 15</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>LV-SMSCPO15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope&#160;</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>EMZ-5TR</td>
			<td>Microscope for visualising crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>RAVM1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening

X線結晶学を用いたタンパク質構造解明は、高品質の回折結晶と回折相問題の計算溶液の両方を必要とする。適切な相同性モデルを欠く新しい構造は、しばしば重原子で誘導され、実験段階情報を提供する。提示されたプロトコルは、ランダムマイクロ播種マトリックススクリーニングと重原子分子I3C(5-アミノ2,4,6-トリヨードイソフタル酸)と誘導体化を組み合わせることにより、誘導体化タンパク質結晶を効率的に生成します。I3Cを結晶格子に組み込むことで、単一波長の変性分散(SAD)フェスを用いて回折相問題を効率的に解決できる。I3Cにおけるヨウ素原子の正三角形配置により、正しい異常な部分構造を迅速に検証することができます。このプロトコルは、実験的なフェスに興味を持って結晶学ベースの技術を用いて高分子構造を解く構造生物学者にとって有用であろう。

I3CをrMMSに組み込むことで、誘導体化結晶成長を支える新しい条件を生み出すことができる 同時rMMSスクリーニングとI3C誘導体化の有効性は、卵白リゾチーム(HEWL、凍結乾燥粉末として得られる)とバクテリオファージP68由来の推定Orf11リシンN末端ドメイン(Orf11 NTD)の2つのタンパク質において実証された。各タンパク質は、シードなし、シード、I3Cでシードなし、I3Cでシードされる(図1)を含む4つの異なる条件でPEG / ION HTに対してスクリーニングされた(図1)。両方のタンパク質について、I3Cの単独添加は結晶化に役立つ条件の数を増加させなかった。Orf11 NTDの場合、I3Cの有無にかかわらず、適切な条件が1つだけ同定された(図1B)。I3CをHEWL画面に追加すると、ヒット数が31から26に減少し、フェージング化合物を導入する際の結晶化の複雑さが強調されました(図1A)。他の研究と一致して、市販のまばらなマトリックススクリーンに種子を加えてrMMSスクリーンを生成すると、両方のタンパク質に対して可能な結晶化条件の数が大幅に増加し、HEWLおよびOrf11 NTDのそれぞれ6、61(図1)に対して2.1倍および6倍の増加をもたらした。最も重要なことは、I3Cとシードの同時添加は、非シードスクリーンに対するヒット数を増加させ、HEWLとOrf11 NTDのそれぞれ2.3倍と7倍の増加を示した。I3Cの存在下でのrMMSからの結晶の多くは、優れた結晶形態を示す(図2)。
シード処理により、I3C rMMS 画面での結晶数の慎重な制御が可能 マイクロシード実験では、結晶化試験に導入された種子の数は、種子ストックの希釈によって制御することができ、これは、ドロップ7、36における核生成の正確な制御を可能にする。これは、多くの場合、核形成部位でのタンパク質分子の競争が減少しているため、より大きな結晶を形成することができます。この利点はI3C-rMMS法にも及び、HEWLとOrf11 NTDの両方で実証されています。I3C-rMMSスクリーンから希釈された種子ストックで同定された結晶化条件の再作成は、より少ないが大きな結晶を生み出した(図3)。
SADのフェージングは、rMMS I3C画面から導出された結晶から構造を解決するために使用することができます 図3に示す希釈種子ストックを用いて成長させた結晶を用いて、単結晶からの回折データを用いてSADフェースを用いてタンパク質の構造を解いた(図4)。データは、オーストラリアのシンクロトロンMX1ビームライン62で収集されました。詳細なデータ収集と構造ソリューションの詳細については、他の場所27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig01.jpg"> 図1- rMMSは、2つの試験タンパク質に対するI3Cの存在下での結晶成長のための新しい条件を生成するために使用された。96ウェル蒸気拡散結晶化スクリーンは、市販のまばらなマトリックススクリーンを用いて行った。(A)ヘン卵白リソザイムは、インデックスHT画面でテストされました。トレイは、0.2 Mのタルゲン酸アンモニウム二塩基pH 7.0、20%(w/v)ポリエチレングリコール3350で成長させたHEWL結晶を播種した。(B) 細菌ファージ P68 から Orf11 NTD を PEG/ION 画面で試験した。Orf11 NTDトレイは、青色で示された未播種のスクリーンから条件G12から結晶から播種した。結晶成長を支える条件は赤色で示されている。I3Cの存在下および不在でのrMMSシードは、いずれもシードされていないトレイよりも有意に多くの結晶ヒットを与えた。Truongらから適応した図27.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig02.jpg"> 図2-図1(a)および(b)に示す蒸気拡散試験から成長した結晶の代表的な画像。Truongらから適応した図27.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig03.jpg"> 図3-種子ストックの希釈は、I3C-rMMS法を用いて見つけた結晶化条件における核生成を低減する有効な方法であり、形成する結晶の数を制御する。落下内の核形成を減らすと、結晶が大きな寸法に成長することがよくあります。Truongらから適応した図27.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig04.jpg"> 図4 - Orf11 NTD(PDB ID 6O43)およびHEWL(PDB ID 6PBB)をI3C-rMMS法を用いて結晶化し、自動人力車SADフェースを用いて解いた。(A)HEWLとOrf11 NTDのリボン構造は実験的なフェージングによって解いた。(B) I3C分子をHEWLとOrf11 NTDに結合した。(C)I3Cにおける異常ヨウ素原子は、6Åの正三角形に配置されている。従って、この三角形がフェス構造下に存在することは、その位置にI3C分子があることを示している。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61984fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

本稿では、マイクロシードを用いてI3C(5-アミノ-2,4,6-トリヨードイソフタル酸)で誘導体化したタンパク質結晶を生成し、まばらなマトリックススクリーンで新しい結晶化条件を生成する方法を紹介します。トレイは液体分配ロボットを使用して、または手で設定することができます。

ランダムマイクロシードマトリックススクリーニングによるI3Cによるタンパク質結晶の誘導体化

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

タンパク質結晶の成長を最適化すると同時に、X線結晶学によってタンパク質の構造を決定するフェージング分子でタンパク質を誘導するように設計された結晶化プロトコルです。完全に新しいタンパク質のX線結晶構造を決定するために、結晶化条件が最適化され、高品質の結晶を生成します。完全に新しいタンパク質の場合、重原子を結晶に導入して誘導体化結晶を生成する必要があります。X線回折データは、導出結晶から収集され、X線結晶構造を作り出すために計算的に解決されなければならない。結晶化と誘導化は、どちらも面倒なプロセスです。これらのボトルネックに対処するために、我々は同時にこれらの目標の両方を達成する最適化されたスクリーニング手順を考案しました。このプロトコルは、ランダムマイクロシードマトリックススクリーニングとして知られている以前に開発された技術を使用しています。結晶または結晶性沈殿物は、完全に独立した条件で結晶成長を開始するために使用することができるマイクロシードに粉砕されます。同時に、結晶化条件にI3Cというフェスニング分子を導入します。この分子は、単一の波長の異常な議論のフェージングによって構造を解決することを可能にする大きな異常な信号を提供する。結晶構造の実験的なサイジングに慣れていないユーザーのために、私たちは部分的にI3Cからの異常な信号を使用するようにそれを調整する構造ソリューションを自動化するためにユーザーフレンドリーなソフトウェアパイプラインを提示します。最初のステップは、I3C在庫を作成することです。マイクロ遠心分離管にI3Cの120ミリグラムを測定します。2つの水酸化リチウムリチウム200マイクロセントリフュージチューブに200マイクロリットルを加えます。40〜60度でチューブを加熱し、渦液は、溶解を促進するために使用することができます。リチウムI3C溶液の1モルストックは茶色でなければなりません。2つの方法を用い、I3Cをタンパク質ストックに導入することができる。リチウムI3Cは、タンパク質ストックに直接添加することができます。3.75マイクロリットルから30マイクロリットルのI3Cを150マイクロリットルのタンパク質に加え、5~14ミリモルの濃度を与えることができる。一部のタンパク質は、高濃度のI3Cと接触すると沈殿する可能性があります。これらの場合、リチウムI3Cは、10〜80ミリモルの間の最終濃度にサンプルタンパク質を一致するバッファーであるタンパク質希釈バッファーに添加することができます。150マイクロリットルのタンパク質サンプルに150マイクロリットルのタンパク質希釈バッファーを加えます。結晶を粉砕するガラスプローブは、ガラスパスツールピペットから作られています。青い炎の上にブンゼンバーナーで、パスツールピペットを真ん中に向かって加熱します。ピンセットを使用して、パスツールピペットの端部を0.3ミリメートル未満の細い直径に引き出します。この時点でピペットを分離し、ピペットの端を丸める炎の中にそのセグメントを保持し、ガラスプローブを終了します。これはガラスピペットがどのように見えるかの例です。クリスタルクラッシュは、タンパク質結晶または結晶性沈殿物を粉砕することによって生成されるマイクロシードストックを独自に作る代わりに、サードパーティベンダーから注文されるかもしれません。氷の上に5つの1.5 mLマイクロ遠心分離管を置きます。軽顕微鏡の下で、犠牲にできる最良の形態結晶または結晶性沈殿物を選択してください。96井戸結晶化トレイの場合は、プラスチック製のシーリングテープを切断して井戸を開きます。吊り下げの下の皿のために、カバースリップはピンセットを使用して取除き、平らな表面に逆張ることができる。70マイクロリザーバー溶液をマイクロ遠心チューブの1つに移し、氷の上で冷やします。残りのチューブに、リザーバー溶液の90マイクロリットルをそれに移し、氷に戻して冷やします。貯蔵量が不足している場合は結晶化貯留槽を適宜試薬を混合して作製でき、代わりに使用することができる。ガラスプローブを使用して結晶液中の結晶を十分に粉砕します。結晶や結晶材料が見えなくなるまで、顕微鏡下で進行を監視することができます。滴から70マイクロリットルのリザーバ溶液を含むマイクロ遠心管に液体のすべてを移す。上下にピペットを入れ、混ぜます。2~3マイクロリットルの混合物を井戸に戻し、上下にピペットを入れ、井戸をすすきます。混合物をマイクロ遠心分離チューブに戻します。このすすいステップをもう一度繰り返す必要があります。マイクロ遠心チューブは、マイクロシードを溶かさないように、この時点から前方に冷たく保つ必要があります。過熱を防ぐために、氷の上でチューブを定期的に冷やして約3分間、最高速度でチューブを4度で渦を出します。冷却貯留液の間で10マイクロリットルを順次移すことによって、種子ストックの10の連続希釈物の1つを作る。種子ストック希釈の間に、チューブは渦を起たるべきです。すぐに使用されない種子株は、マイナス80度の超低温冷凍庫に保管する必要があります。96ウェルランダムマイクロシードマトリックススクリーンは液体分配ロボットを使用して設定することができる。ロボットにシードストック、I3Cを補ったタンパク質ストック溶液、結晶化スクリーンを配置します。ロボットを使用して、結晶化スクリーンから96ウェルトレイに75マイクロリットルを転送します。結晶化液に1マイクロリットル、リザーバーに74マイクロリットルを加えます。I3Cを補った1マイクロリットルのタンパク質を結晶化低下に移す。0.1マイクロリットルの種子ストックを結晶化ドロップに移します。シールテープを使用してプレートを密封します。吊り下げドロップスクリーンは、24ウェル吊り下げドロップ結晶化トレイに設定することができます。吊り下げドロップウェルの端をグリースします。500マイクロリットルの結晶化液をリザーバーに移します。ガラスカバースライドの中央付近には、結晶化液の1マイクロリットルの滴を置きます。このドロップには、リチウムI3Cを添加したタンパク質1マイクロリットルと種子ストック0.1マイクロリットルを加えます。カバースライドを反転し、カバースライドをグリースに押し込んで結晶をよく密封します。吊り下げドロップとシーリングドロップトレイは、結晶を形成できるように一定の温度でインキュベートされます。それらは定期的に結晶成長のための顕微鏡の下で検査されるべきである。回折データが取得され、統合され、また、付随する書面によるプロトコルで説明されているようにスケーリングされた後、自動人力車の自動結晶構造決定パイプラインを使用して、位相問題を解決し、タンパク質をモデル化することができます。自動人力車のランディング ページで、進むボタンをクリックします。自動人力車ウェブフォームに機関の電子メールを入力し、自動人力車の実行を続行をクリックします。ホモロジーモトテンプレートのないタンパク質の場合は、高度なモードで自動人力車のSADプロトコルを実行します。必要なパラメータを入力します。分子タイプとしてタンパク質を選択します。オングストロームのデータ収集波長を入力します。ヨウ素原子を示す部分構造要素として私のように使用された。I3Cがフェス構造分子であることを示すI3Cサブ構造タイプを選択します。sub_directをサブ構造決定方法として選択します。モノマー当たりの予想される下位構造の数として 3 つを選択します。部分構造検索の引当カットオフとして 1 を入力します。これにより、自動人力車は適切な解像度カットオフを自動的に決定できます。マシューズ係数に基づいて、単一のモノマー、データセットの空間グループ、および非対称単位の分子数の残基数を入力します。必要に応じて、適切な X 線データの普及レベルを選択します。異常なデータを空のセット ファイルとして入力します。タンパク質配列を、SEQ、PIR、または TXT ファイルとして入力します。教育機関の電子メール アドレスを入力します。結果は、提供された電子メールアドレスに送信されたWebリンクを介してあなたに配信されます。Auto-人力車が決定された部分構造を使用して構造を解決できなかった場合、構造の解決のトラブルシューティングに役立ちます。自動人力車の結果ページから重い原子サイトのリストをダウンロードします。これは、重原子サイトと呼ばれるハイパーリンクです。これは、重い原子サイトとのテキストファイルをダウンロードします。ファイルの拡張子を txt から pdb に変更します。Pdb ファイルをクートで開きます。対称をオンにして、隣接する非対称単位からすべての重原子を表示します。非対称単位を含む重い原子間の距離を測定します。I3Cは、6つのオングストロームの側面長を持つ正三角形として表示されます。これらの寸法を持つ三角形の存在は、それらの重い原子の配置が正しいことを示しています。自動人力車の実行部分構造が正しくない場合、他の自動人力車の設定は、書かれたプロトコルで説明したようにテストすることができます。I3C RMMS法は、ハンプトンリサーチのHTスクリーンとバクテリオファージP68由来のOrf11リジンタンパク質のドメインを使用して、2つのタンパク質、鶏卵白リソザイムで試験した。I3Cまたはマイクロシードなしでコントロールスクリーンに対応する各タンパク質ごとに全画面を設置し、マイクロシードを加えたスクリーン、I3Cによるスクリーン、そして最後にI3Cとマイクロシードでスクリーンを設置した。I3Cを結晶スクリーンに追加しても、結晶化ヒット数が増加するようには見えません。鶏卵白リソザイムでは、条件の数は31から26に減少しました。Orf11 ドメインでは、コントロール画面に 1 回のヒット条件が見つかりました。I3Cを画面に追加すると、同じ条件で単一のヒットを与えました。マイクロシードを井戸に加えると、ヒット条件の数が大幅に増加し、鶏卵白リソザイムとOrf11ドメインがそれぞれ2.1倍と6倍増加しました。この結果は、RMMSをテストする他の研究と一致しています。最も重要なことは、I3Cとマイクロシードをスクリーンに加えることは、それぞれ鶏卵白リソザイムとOrf11ドメインに対して2.3倍と7倍の増加を示す制御画面に対するヒット条件の数を増加させることである。これは、I3C RMMS法が効率的に誘導体化結晶の新しい条件を生成できることを示しています。これらの条件からの結晶を収穫し、結晶構造を解決するために使用することができます。鶏卵白リソザイムOrf11ドメインの両方の構造は、I3C RMMSスクリーンによる誘導化に成功したことを示すI3Cからの異常信号を使用して、自動人力車パイプライン上のSADフェージングで解決することができました。私たちは、フェス化分子I3Cで導出された高品質の結晶を生成するためのシンプルで効率的なプロトコルを提示しました。スクリーンの数と結晶処理のステップを最小限に抑え、新しいタンパク質を研究する構造生物学者に特に関心があります。我々は強く種子ストックの準備中に行われた異なる種子ストック希釈をテストすることにより、結晶サイズを最適化することをお勧めします。そして、このステップは、最初の画面が完了した後に完了します。I3Cは広く利用可能であり、購入するには安価であり、したがって、我々はこの方法は、ほとんどの構造生物学研究所の手の届くところにあると考えています。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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