Name: derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening
Uploaded: 2021-01-16T15:00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Denne forskningen ble utført på MX1-strålelinjen ved den australske Synchrotron, en del av ANSTO. Forfatterne ønsker å anerkjenne medlemmer av Shearwin og laboratorier for diskusjoner om dette arbeidet. Forfatterne ønsker også å anerkjenne Dr. Santosh Panjikar og Dr. Linda Whyatt-Shearwin som bidro til det opprinnelige arbeidet som var banebrytende for denne protokollen.
Følgende finansiering er anerkjent: Australian Research Council (grant Nos. DP150103009 og DP160101450 til Keith E. Shearwin); University of Adelaide (Australian Government Research Training Program stipend stipend til Jia Quyen Truong og Stephanie Nguyen).

1. Eksperimentell planlegging og vurderinger
<ol><li>Bruk eksisterende krystaller av protein av interesse, helst generert gjennom dampdiffusjon krystallisering. For en generalisert protokoll for dampdiffusjonkrystallisering, se Benvenuti og Mangani34. Andre metoder for krystallisering som mikrobatch under olje og fri grensesnitt diffusjon vil kreve høsting krystaller før knusing for å generere mikroseeds.</li>
	<li>I utarbeidelsen av en frølager, bruk krystaller av høyeste kvalitet som kan ofres. Krystall av høyeste kvalitet kan bedømmes visuelt basert på morfologi, eller den beste diffracting krystall kan velges, hvis slike data er tilgjengelige. Det er svært sannsynlig at enda bedre kvalitet krystaller oppnås etter optimalisering gjennom seeding. I tilfelle der ingen krystaller er tilgjengelige, kan krystallinsk bunndemp som spherulites og nåler brukes.</li>
	<li>Identifiser saltkrystaller. Saltkrystaller kan vokse i krystalliseringsskjermer og kan se ut som proteinkrystaller. Bruk av saltkrystaller i rMMS vil ikke gi noen fordel og vil kaste bort dyrebar prøve, så det er viktig å eliminere salt falske positive.<ol>
<li>Saltkrystaller er høyt når de knuses. Krystaller må knuses for å generere en frølager, så denne strategien er spesielt relevant. Hvis en hørbar sprekklyd høres når du knuser krystallene, vil krystallen sannsynligvis være salt.</li>
		<li>Hvis proteinet inneholder tryptofan og tyrosinrester, bruk ultrafiolett fluorescensmikroskopi for å identifisere proteinkrystaller som fluorescerer under disse lysforholdene.</li>
		<li>Bruk Izit fargestoff (metylen blå) for å flekke proteinkrystaller for å skille dem til saltkrystaller som forblir relativt uopphetet. Denne prosedyren er imidlertid mer ødeleggende og anbefales bare hvis man har krystaller til overs fra repliker av samme fall. MERK: Selv om de nevnte testene kan gi lovende resultater, kan saltkrystaller fortsatt forveksles med proteinkrystaller. I dette tilfellet kan diffraksjonseksperimenter brukes til å definitivt skjelne mellom et protein og saltkrystall.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Utarbeidelse av litium I3C lager
<ol><li>Mål ut 120 mg I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisoftalsyre) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.</li>
	<li>Oppløs I3C i 200 μL av 2 M litiumhydroksid. Oppløsningen kan forsiktig varmes opp ved hjelp av en varmeblokk ved 40-60 °C for å oppmuntre til oppløsning. Den resulterende litium-I3C-løsningen skal være brun og har en konsentrasjon på 1 M. FORSIKTIG: Litiumhydroksid er etsende. Vernebriller, hansker og en labfrakk skal brukes.</li>
	<li>Mål pH-en til løsningen. Tilsett eventuelt små mengder 1 M saltsyre eller 2 M litiumhydroksid for å justere pH-en til mellom 7 og 8. Tilsett milliQ vann for å gjøre det endelige oppløsningsvolumet til 400 μL. Konsentrasjonen av I3C lagerløsningen er 0,5 M. MERK: Trinn 2.3 er valgfritt. Oppløsningens pH skal være mellom pH 7-8 før pH-justering. Dette trinnet bør utføres hvis proteinet av interesse er sterkt påvirket av pH. Protokollen kan settes på pause her. Litium I3C kan holdes i mørket ved 4 °C i minst to uker35.</li>
</ol>3. Tillegg av I3C til proteinbestanden
<ol><li>Metode 1<ol>
<li>Tilsett lager litium I3C til en 150 μL aliquot av målet protein. Den endelige konsentrasjonen skal være mellom 5-40 mM litium I3C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Metode 2 (mildere metode)<ol>
<li>Forbered en proteinfortynningsbuffer som samsvarer med bufferen til målproteinet. Til denne fortynningsbufferen, legg til lager litium I3C for å gi en konsentrasjon av litium I3C mellom 10-80 mM.</li>
		<li>Fortynn proteinet 1:1 med proteinfortynningsbuffer for å gi en endelig konsentrasjon av litium I3C mellom 5-40 mM. MERK: Noen proteiner vil utløse ved å komme i kontakt med høye konsentrasjoner av litium I3C i metode 1, mens andre proteiner kan tolerere det. Metode 2 reduserer sannsynligheten for nedbør. Denne metoden halverer imidlertid proteinkonsentrasjonen. For proteiner som ikke har en etablert krystalliseringsprotokoll, anbefales en proteinkonsentrasjon på 10 mg/ml vanligvis for innledende krystalliseringsscreening. Et innledende molarforhold på I3C og protein på 8 anbefales. Proteinkonsentrasjon og molarforhold på I3C og protein kan optimaliseres etter den første skjermen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Lage en frø lager
<ol><li>Lag en avrundet sonde for å knuse krystaller.<ol>
<li>Med en Bunsen brenner på den blå flammen, varme en Pasteur pipette mot midten. Bruk en pinsett til å trekke enden av Pasteur pipetten for å trekke den ut i en tynn diameter på mindre enn 0, 3 mm.</li>
		<li>Når midtseksjonen er tynn nok, hold det segmentet i flammen for å skille pipetten på dette punktet og rundt enden av pipetten for å fullføre glasssonden. MERK: Avrundede sondekrystallknusere selges av tredjepartsleverandører. Dette er et alternativ til å lage avrundede sonder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plasser fem 1,5 ml mikrocentrifuge rør på is.</li>
	<li>Under et lett mikroskop, undersøk krystalliseringsbrettet for en passende tilstand for å generere mikrokrystaller. Ideelt sett velges gode morfologi store krystaller. Denne teknikken fungerer imidlertid også med dårlige morfologikrystaller, nåler, plater, mikrokrystaller og sfærlitter.</li>
	<li>Åpne krystalliseringsbrettet godt. For 96 godt krystallisering skuffer forseglet med plast, bruk en skalpell for å kutte plast tetting brønnen. For hengende dråpebrett forseglet med fett, kan dekkslipsen fjernes ved hjelp av pinsett og invertert på en jevn overflate.</li>
	<li>Overfør 70 μL reservoarløsning til et mikrocentrifugerør og avkjøl det på is. Til de andre mikrocentrifugerørene legger du til 90 μL reservoarløsning og går tilbake til is for å kjøle seg ned. MERK: Hvis reservoaret ikke har nok volum eller ikke eksisterer (i tilfelle mikrobatch under olje), må du lage krystalliseringsreservoar ved å blande de riktige reagensene.</li>
	<li>Agitate krystallen i dråpen ved hjelp av krystallsonden for å knuse den grundig. Krystallen må knuses helt som kan overvåkes under mikroskopet.</li>
	<li>Fjern all væsken fra dråpen og overfør den til mikrocentrifugerøret med reservoarløsningen. Bland og ta deretter 2 μL blanding fra mikrocentrifugerøret og legg den tilbake til brønnen. Skyll brønnen med løsningen og overfør den til mikrocentrifugerøret. Gjenta dette skylletrinnet igjen. Fra dette punktet, hold mikrocentrifugerøret kaldt for å unngå å smelte mikroseedene i blandingen.</li>
	<li>Vortex røret ved maksimal hastighet ved 4 °C i 3 min, og stopp regelmessig for å kjøle røret på isen for å unngå overoppheting. MERK: Noen mikrofrøprotokoller legger til en polytetrafluoretylenfrøperle til mikrocentrifugerøret for å hjelpe krystallknusing7,36. Vi har ansatt teknikken uten bruk av en frøperle med suksess, men ser ingen problemer med å utnytte en frøperle for å knuse krystaller.</li>
	<li>Lag en 1 av 10 seriell fortynning av frøbestanden ved å overføre 10 μL mellom de kjølte reservoarløsningene.</li>
	<li>Oppbevar frøbestander som ikke vil bli brukt umiddelbart ved -80 °C.</li>
</ol>5. Sette opp en rMMS-skjerm
<ol><li>Sette opp en 96 brønn screening plate ved hjelp av en flytende dispensering robot. I fravær av en robot kan en flerkanals pipette også brukes.<ol>
<li>Overfør 75 μL fra en dyp brønnblokk til et 96 godt krystalliseringsbrett. Tilsett 1 μL til krystalliseringsfallet og 74 μL i reservoaret.</li>
		<li>Overfør 1 μL protein supplert med litium I3C, laget i trinn 2, til krystalliseringsfallet.</li>
		<li>Overfør 0,1 μL frølager til krystalliseringsfallet.</li>
		<li>Forsegle platen med klar tetningstape og inkuber platen ved en konstant temperatur for å tillate krystallvekst.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sette opp en hengende slippskjermer<ol>
<li>Smør kantene på hengende dråpebrønner (hengende drop krystallisering skuffer kan bli funnet i 24 og 48 brønnformater).</li>
		<li>Overfør 500 μL krystalliseringsløsning til reservoar.</li>
		<li>Nær midten av et glassdeksel lysbilde, plasser en 1 μL dråpe protein supplert med litium I3C, laget i trinn 2.</li>
		<li>Tilsett 1 μL av krystalliseringsløsningen til dråpen.</li>
		<li>Overfør 0,1 μL frølager til krystalliseringsfallet.</li>
		<li>Inverter dekselet og forsegle krystalliseringen godt ved å skyve dekselet gli inn i fettet.</li>
		<li>Inkuber platen ved en konstant temperatur for å tillate krystallvekst. MERK: Med nye og utestede frøaksjer anbefales det å bruke den mest konsentrerte frøbestanden for å maksimere sjansene for å få krystalliseringstreff. Etterfølgende forhold kan settes opp med redusert frøkonsentrasjon for å optimalisere antall krystaller.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inspiser krystallskuffer under et mikroskop regelmessig for krystallvekst. Hvis krystaller er av tilstrekkelig kvalitet, kan de høstes for datainnsamling. Krystaller kan også brukes til å generere nye frøaksjer og nye rMMS-skjermer for å tillate iterativ optimalisering.</li>
</ol>6. Datainnsamling
<ol><li>Harvest krystaller ved hjelp av kryoloops, kryobeskytte krystaller og flash kjøle dem i flytende nitrogen. For ytterligere informasjon om flash kjølekrystaller, se Teng37 og Garman og Mitchell38.<ol>
<li>Under kryobeskyttelsesstadiet, hvis krystallen passeres gjennom en ny vandig løsning, kan I3C gå tapt fra krystallen på grunn av at den leeching inn i kryobeskyttelsesløsningen. Bruk litium-I3C i kryobeskyttelsesløsningen i en konsentrasjon som samsvarer med krystalliseringstilstanden for å redusere dette.</li>
		<li>Krystaller dyrket ved hjelp av denne protokollen har med hell blitt kryobeskyttet ved hjelp av Parabar 10312 oljebasert kryobeskyttende (Hampton Research). MERK: Protokollen kan settes på pause her mens krystaller lagres i flytende nitrogen. FORSIKTIG: Flytende nitrogen kan forårsake kalde forbrenninger. Flytende nitrogen kan også forårsake kvelning hvis det brukes i lukkede rom.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monter krystallen på røntgenkildegoniometeret og samle inn diffraksjonsdata ved hjelp av protokollen som er spesifikk for røntgenkilden.</li>
	<li>Denne teknikken er avhengig av uregelmessig signal fra jodatomer i I3C. Dermed velger du energien til røntgenbildet for å maksimere dette signalet.<ol>
<li>Sett synchrotron røntgenkilder med justerbare energier så lavt som mulig. For mange makromolekylære krystallografistrålelinjer er den laveste konfigurerbare energien 8000 til 8500 eV.</li>
		<li>Roterende anode røntgenkilder kan ikke justeres. Vanlige anodkilder med kobber har Kα-kanten ved 8046 eV, noe som gir et godt uregelmessig signal for jod (f" = 6,9 e). Anodekilder med krom har en Kα-kant ved 5415 eV, noe som gir et stort uregelmessig signal for jod (f" = 12,6 e).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Strålingsskader er et betydelig problem under datainnsamling, da det vil forringe det uregelmessigesignalet 39. Velg eksponeringstid og demping av strålen for å oppnå den beste diffraksjonen samtidig som strålingsdosen minimeres. MERK: I en lignende innfasingsforbindelse med jodatomer erstattet med bromatomer, har strålingsskader vist seg å forårsake radiolyse av karbonbro brombindingen og en reduksjon i belegget til bromatomer24.<ol>
<li>Bruk inverse beam SAD datainnsamling som en innsamlingsstrategi. Dataene samles inn i kiler, med motsatte kiler samlet etter hverandre. Dette gjør at Friedel par kan samles med en tilsvarende dose, noe som resulterer i en forbedret måling av uregelmessig signal mindre påvirket av strålingsskader. For eksempel, en åtte kile strategi for å samle 360° ville innebære å samle inn dataene i rekkefølgen av kile 1 (0 °-45°), kile 2 (180°-225°), kile 3 (46°-90°), kile 4 (225°°-270°), kile 5 (90°-135°), kile 6 (270°-315°), kile 7 (135°-180°) og kile 8 (315°-360°). MERK: Kontinuerlig rotasjon er en alternativ innsamlingsstrategi til datainnsamling av inverse stråler. For en nylig sammenligning av innsamlingsstrategiene, se Garcie-Bonte & Katona40.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Databehandling og strukturløsning
<ol><li>Utfør datareduksjon på diffraksjonsdataene ved hjelp av XDS41, med sikte på å maksimere det uregelmessige signalet. Parametere for inndatareduksjon er spesifikke for datasettet og kan kreve litt prøving og feiling. Her er noen anbefalinger for å starte.<ol>
<li>Sett FRIEDEL'S LAW = FALSE. Utfør RIKTIG to ganger, STRICT_ABSORPTION_CORRECT = SANN og STRICT_ABSORPTION_CORRECT = USANN. Ett løp kan ha et høyere uregelmessig signal enn det andre. Sammenlign de uregelmessige signalene mellom løpene ved hjelp av 'Anomal Corr' og 'SigAno' disipliner i produksjonen. Dette gir en indikator på datakvalitet.</li>
		<li>Kjør SHELXC på XDS_ASCII. HKL-fil for en mer nøyaktig indikasjon på uregelmessig signal. "Ranom"-disiplinen vil gi en indikasjon på det uregelmessige signalet ved ulike oppløsninger.</li>
	</ol></li>
	<li>Kjør POINTLESS42 og AIMLESS43 for å skalere dataene. I AIMLESS angir du parameteren ANOMALOUS ON. Hvis GUI brukes, velger du alternativet Skill uregelmessige par for ytre avvisning og sammenslåing av statistikk. Testing av ulike oppløsningskutt kan være nødvendig for å maksimere avvikende signal.</li>
	<li>Løs proteinstrukturen ved hjelp av Auto-Rickshaw automatisert krystallstrukturbestemmelsesrørledning44. Auto-Rickshaw vil forsøke å løse faseproblemet og bygge proteinets krystallstruktur automatisk med proteinmodellerings- og raffinementprogramvare.<ol>
<li>For proteiner uten en homologi modell mal, kjøre SAD protokollen auto-Rickshaw i avansert modus. Angi de nødvendige parameterne.<ol>
<li>Velg PROTEIN som molekyltype.</li>
			<li>Skriv inn datainnsamlingen i angstroms (Å).</li>
			<li>Velg "I" som understrukturelement for å indikere jodatomer ble brukt.</li>
			<li>Velg "i3c" som understrukturtype for å indikere at I3C var innfasingsmolekylet.</li>
			<li>Velg "sub_direct" som bestemmelsesmetode for understruktur. Denne metoden bruker SHELXD32 til å søke etter understrukturen.</li>
			<li>Velg "3" som antall forventede understruktur per monomer.</li>
			<li>Skriv inn "1" som oppløsningsavskjæring av understruktursøk. Dette gjør at Auto-Rickshaw automatisk kan bestemme en passende oppløsning cutoff.</li>
			<li>Skriv inn antall rester i en enkelt monomer, romgruppe av datasettet og antall molekyler i den asymmetriske enheten basert på Matthews-koeffisienten.</li>
			<li>Velg riktig formidlingsnivå for røntgendata som passer til behovene. Ved å velge "AutoRickshaw-utviklere" kan Auto-Rickshaw-utviklere feilsøke kjøringen hvis det oppstår problemer.</li>
			<li>Skriv inn de uregelmessige dataene som en mtz-fil.</li>
			<li>Skriv inn proteinsekvensen som en seq-, pir- eller txt-fil. En seq-fil kan genereres i et tekstredigeringsprogram (for eksempel Notepad ++9 på Windows eller nano i Linux). Opprett en ny fil, skriv inn den primære sekvensen av proteinet som en lang linje eller atskilt med linjeskift. Lagre filen med den .seq filtypen.</li>
			<li>Skriv inn en institusjonell e-postadresse.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Resultatene leveres via en webkobling som sendes til den oppgitte e-postadressen. MERK: AutoRickshaw er en automatisert rørledning som påkaller ulike krystallografi programvarepakker for å løse en røntgen krystall struktur32,33,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58. Hvis Auto-Rickshaw-kjøringen ikke løser strukturen, kan andre Auto-Rickshaw-innstillinger testes. Metoden for bestemmelse av struktur kan endres til "sub_phassade" for å bruke Phaser59 i stedet for SHELXD32. Antall forventede understrukturer per monomer kan også økes eller reduseres.</li>
	<li>Under den eksperimentelle innfasingen av krystallstrukturen vil Auto-Rickshaw forsøke å plassere tunge atomer i enhetscellen, noe som skaper en understruktur. Den likesidesidete trekantordningen av jodatomer i I3C presenterer en effektiv måte å validere understrukturen på. Hvis trinn 6.3 mislykkes, kan validering av understrukturen hjelpe til med å feilsøke strukturløsning.<ol>
<li>Last ned listen over tunge atomnettsteder fra Auto-Rickshaw-resultatsiden. Det er en hyperkobling som kalles "tunge atomområder". Dette vil laste ned en tekstfil med de tunge atomnettstedene.</li>
		<li>Endre filtypen til filen fra .txt til .pdb.</li>
		<li>Åpne filen PDB i Coot60. Slå på symmetri for å se andre tunge atomer fra nærliggende asymmetriske enheter.</li>
		<li>Mål avstandene mellom de tunge atomer, inkludert på tvers av asymmetriske enheter. I3C vil vises som en likeside trekant med en sidelengde på 6 angstroms. Tilstedeværelsen av en trekant med disse dimensjonene indikerer plasseringene av de tunge atomer er riktige.</li>
	</ol></li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Strukturbestemmelse av et nytt protein i fravær av en passende homologimodell for molekylær utskifting krever eksperimentell innfasing. Disse metodene krever inkorporering av tunge atomer i proteinkrystallen som legger til et nivå av kompleksitet til strukturbestemmelsesrørledningen og kan introdusere mange hindringer som må løses. Tunge atomer kan innlemmes direkte i proteinet gjennom merket uttrykk ved hjelp av selenometionin og selenocystein. Siden denne metoden er kostbar, arbeidskrevende og kan resultere i lavere proteinutbytter, uttrykkes ofte merket protein etter at krystalliseringsforholdene er funnet og optimalisert med umerket protein. Alternativt kan krystaller utledes ved å bløtlegge i en løsning som inneholder tunge atomer22,63,64. Denne metoden bruker ofte krystaller av høy kvalitet og utføres derfor etter at en robust krystalliseringsmetode allerede er utviklet. Vellykket å skaffe en derivatisert krystall ved hjelp av denne metoden krever ytterligere optimalisering av soaking prosedyrer og screening av ulike innfasing forbindelser, derfor legge mer tid til en allerede arbeidskrevende prosess.
Samtidig krystallisering av proteinet med det tunge atomet kan utføres på screeningstadiet, og dermed effektivt effektivisere prosessen og redusere krystallmanipuleringstrinn som kan forårsake skade. Det finnes imidlertid fortsatt det potensielle scenariet for å få få innledende krystalliseringstreff og problemet med å velge en kompatibel tung atomforbindelse. Mange tilgjengelige innfasingsforbindelser er for tiden uforenlige med stup, buffere og tilsetningsstoffer som vanligvis finnes i krystalliseringsforhold. De kan være uoppløselige i sulfat- og fosfatbuffere, chelate for å sitere og acetat, reagere ugunstig med HEPES og Tris buffere eller bli beslagt av DTT og β-mercaptoethanol21. Siden I3C-innfasingsforbindelsen ikke lider av disse inkompatibilitetene, er det en robust innfasingsforbindelse som kan være mottagelig for mange forskjellige forhold.
I denne studien presenteres en strømlinjeformet metode for å produsere derivatiserte krystaller klar for SAD-innfasing gjennom samtidig Kombinasjonen av begge teknikkene øker antall krystalliseringstreff, med mange av forholdene som har forbedret morfologi og diffraksjonsegenskaper. I både Orf11 NTD- og HEWL-testtilfeller ble det identifisert nye betingelser i I3C-rMMS-skjermen som var fraværende da I3C ikke var til stede. Potensielt kan I3C binde seg gunstig til proteinet, noe som letter dannelsen og stabiliseringen av krystallkontakter27. I sin tur kan dette indusere krystallisering og muligens forbedre diffraksjonsegenskapene. Foruten å være en forbindelse kompatibel med sparsomme matriseskjermer, er I3C også en attraktiv innfasingsforbindelse på grunn av sine indre egenskaper. De funksjonelle gruppene som veksler med jod på det aromatiske ringstillaset tillater spesifikk binding til proteiner. Dette fører til større belegg og reduserer potensielt bakgrunnssignal23. Videre er arrangement av uregelmessige scatterers i en likesidet trekant åpenbar i understrukturen og kan brukes til raskt å validere binding av I3C (figur 4B og 4C). Til slutt kan det produsere et uregelmessig signal med tunable synchrotron stråling samt krom og kobber roterende anode røntgenkilder. Dermed kan det brukes på mange forskjellige arbeidsflyter. Som I3C er allment tilgjengelig og billig å kjøpe, er denne tilnærmingen innen rekkevidde for de fleste strukturelle biologilaboratorier.
Det er flere eksperimentelle hensyn som må tas opp ved bruk av I3C-rMMS-metoden. Denne metoden kan ikke brukes hvis det første krystallinske materialet i proteinet ikke kan oppnås. I vanskelige tilfeller kan krystallinsk materiale fra et homologt protein også brukes til å generere frølager. Denne kryssseede tilnærmingen til rMMS har vist noen lovende resultater7. Optimalisering av krystallnummer gjennom fortynning av frøbestanden er et avgjørende skritt, som ikke bør overses, for å maksimere sjansen for å produsere store krystaller av høy kvalitet og anskaffe egnede diffraksjonsdata. Hvis det er få I3C-steder identifisert i den asymmetriske enheten, bør forhold som bidrar til krystallisering optimaliseres ytterligere med økt konsentrasjon av I3C. Dette kan øke belegget til I3C for å maksimere det uregelmessige signalet og hjelpekrystallderivatiseringen.
Det kan være tilfeller der denne teknikken kanskje ikke er den optimale metoden for å derivatisere proteinkrystaller. Etter hvert som størrelsen på et protein eller proteinkompleks øker, kan det begrensede antallet I3C-steder på proteinoverflaten ikke gi tilstrekkelig innfasingskraft til å løse strukturen. I disse scenariene hvor proteinstørrelse mistenkes for å hindre innfasing, kan selenometionmerking av proteinet være en mer levedyktig tilnærming til innfasing av proteinet. Hvis proteinet har tilstrekkelig antall metioninrester i proteinet (anbefalt å ha minst en metionin per 100rester 65) og høy effektivitet selenometion inkorporering i et protein kan oppnås (for eksempel i bakterielleuttrykkssystemer 66),vil flere høy belegg selen atomer være til stede i krystallene for å fase strukturen.
I tillegg kan noen proteiner iboende være uegnet for derivatisering med I3C. I3C bindende steder på proteiner er avhengig av proteinstruktur. Det kan finnes proteiner som naturlig har få eksponerte patcher som er kompatible med I3C-binding. Dermed er det ikke uforutsette at det kan være vanskeligheter med å samtidig krystallisere noen målproteiner med I3C.

Innen strukturell biologi anses røntgenkrystallografi som gullstandardteknikken for å bestemme atomoppløsningsstrukturene til makromolekyler. Det har blitt brukt mye for å forstå det molekylære grunnlaget for sykdommer, veilede rasjonelle legemiddeldesignprosjekter og belyse den katalytiske mekanismen til enzymer1,2. Selv om strukturelle data gir et vell av kunnskap, kan prosessen med proteinuttrykk og rensing, krystallisering og strukturbestemmelse være ekstremt arbeidskrevende. Det oppstår ofte flere flaskehalser som hindrer fremdriften i disse prosjektene, og dette må tas opp for å effektivisere krystallstrukturbestemmelsesrørledningen.
Etter rekombinant uttrykk og rensing må foreløpige forhold som bidrar til krystallisering identifiseres, noe som ofte er et krevende og tidkrevende aspekt ved røntgenkrystallografi. Kommersielle sparsomme matriseskjermer som konsoliderer kjente og publiserte forhold er utviklet for å lette denne flaskehalsen3,4. Det er imidlertid vanlig å generere få treff fra disse første skjermene til tross for å bruke svært rene og konsentrerte proteinprøver. Observere klare dråper indikerer at proteinet ikke kan nå nivåene av supermetning som kreves for å kjerne en krystall. For å oppmuntre krystall kjerner og vekst, frø produsert fra eksisterende krystaller kan legges til forholdene, og dette gir mulighet for økt prøvetaking av krystallisering plass. Ireton og Stoddard introduserte først mikrofrømatrisescreeningsmetoden5. Krystaller av dårlig kvalitet ble knust for å lage en frøbestand og deretter lagt systematisk til krystalliseringsforhold som inneholder forskjellige salter for å generere nye diffraksjonskvalitetkrystaller som ellers ikke ville ha dannet seg. Denne teknikken ble ytterligere forbedret av D'Arcy et al. som utviklet tilfeldig mikrofrømatrisescreening (rMMS) der frø ble introdusert i en ekstra matrisekrystalliseringsskjerm6,7. Dette forbedret kvaliteten på krystaller og økte antall krystalliseringstreff i gjennomsnitt med en faktor på 7.
Etter at krystaller er produsert og et røntgendiffraksjonsmønster oppnås, oppstår det en annen flaskehals i form av å løse "faseproblemet" . Under datainnsamlingsprosessen registreres intensiteten av diffraksjon (proporsjonal med amplitudens kvadrat) men faseinformasjonen går tapt, noe som gir opphav til faseproblemet som stopper umiddelbar strukturbestemmelse8. Hvis målproteinet deler høy sekvens identitet til et protein med en tidligere bestemt struktur, molekylær erstatning kan brukes til å estimerefaseinformasjon 9,10,11,12. Selv om denne metoden er rask og billig, kan modellstrukturer ikke være tilgjengelige eller egnet. Suksessen til homologi modellbasert molekylær erstatning metoden synker betydelig som sekvens identitet faller under 35%13. I fravær av en passende homologimodell kan ab initio metoder, som ARCIMBOLDO14,15 og AMPLE16,testes. Disse metodene bruker beregningsmessig spådde modeller eller fragmenter som utgangspunkt for molekylær erstatning. AMPLE, som bruker spådde lokkemodeller som utgangspunkt, sliter med å løse strukturer av store (> 100 rester) proteiner og proteiner som hovedsakelig β-ark. ARCIMBOLDO, som forsøker å passe små fragmenter for å utvide seg til en større struktur, er begrenset til høyoppløselige data (≤2 Å) og av algoritmenes evne til å utvide fragmentene til en full struktur.
Hvis molekylære erstatningsmetoder mislykkes, må direkte metoder som isomorfe erstatning17,18 og uregelmessig spredning ved en enkelt bølgelengde (SAD19) eller flere bølgelengder (MAD20) brukes. Dette er ofte tilfelle for virkelig nye strukturer, hvor krystallen må dannes eller utledes med et tungt atom. Dette kan oppnås ved å bløtlegge eller samtidig krystallisere med en tung atomforbindelse, kjemisk modifikasjon (for eksempel 5-bromouracil inkorporering i RNA) eller merket proteinuttrykk (som å innlemme selenometionin eller selenocystein aminosyrer i primærstrukturen)21,22. Dette kompliserer ytterligere krystalliseringsprosessen og krever ytterligere screening og optimalisering.
En ny klasse av innfasing forbindelser, inkludert I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid) og B3C (5-amino-2,4,6-tribromoisophthalic acid), tilbyr spennende fordeler over eksisterende phasingforbindelser 23,24,25. Både I3C og B3C har et aromatisk ringstillas med et vekslende arrangement av uregelmessige scattere som kreves for direkte innfasingsmetoder og amino- eller karboksylatfunksjonelle grupper som samhandler spesielt med proteinet og gir bindende stedspesifisitet. Den påfølgende likesidete trekantede ordningen av tungmetallgrupper muliggjør forenklet validering av innfasingsunderbygningen. I skrivende stund er det 26 I3C-bundne strukturer i Protein Data Bank (PDB), hvorav 20 ble løst ved hjelp av SAD-innfasing26.
Denne protokollen forbedrer effekten av strukturen bestemmelse rørledningen ved å kombinere metoder for tungmetall derivatization og rMMS screening for å samtidig øke antall krystallisering treff og forenkle krystall derivatization prosessen. Vi demonstrerte denne metoden var ekstremt effektiv med høne eggehvite lysozyme og et domene av en ny lysin protein fra bakteriofag P6827. Strukturløsning ved hjelp av den svært automatiserte Auto-Rickshaw strukturbestemmelsesrørledningen er beskrevet, spesielt skreddersydd for I3C-innfasingsforbindelsen. Det finnes andre automatiserte rørledninger som kan brukes som AutoSol28,ELVES29 og CRANK230. Ikke-helautomatiske pakker som SHELXC/D/E kan også brukes31,32,33. Denne metoden er spesielt gunstig for forskere som studerer proteiner som mangler homologe modeller i PDB, ved å redusere antall screening- og optimaliseringstrinn betydelig. En forutsetning for denne metoden er proteinkrystaller eller et krystallinsk bunnskudd av målproteinet, hentet fra tidligere krystalliseringsstudier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL disposable luer lock syringes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>T3SS10LAT</td>
			<td>Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used for hanging drop crystal tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-506</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22178</td>
			<td>Commonly referred to as I3C in the article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-297</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18X18-2</td>
			<td>Coverslips for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning vacuum grease</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-510</td>
			<td>Used for sealing hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette 0.1 &#956;L-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 2 &#956;L-20 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1153247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 20 &#956;L-200 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1152006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>HIR92601.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Approximately 95% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IndexHT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope illuminator</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>FT192/230</td>
			<td>Light source to illuminate crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/ION HT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Liquid Dispenser</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel with scalpel blade no. 15</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>LV-SMSCPO15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope&#160;</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>EMZ-5TR</td>
			<td>Microscope for visualising crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>RAVM1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening

Proteinstrukturbelysning ved hjelp av røntgenkrystallografi krever både høykvalitets diffracting krystaller og beregningsløsning av diffraksjonsfaseproblemet. Nye strukturer som mangler en passende homologimodell blir ofte derivatisert med tunge atomer for å gi eksperimentell faseinformasjon. Den presenterte protokollen genererer effektivt derivatiserte proteinkrystaller ved å kombinere tilfeldig mikroseederende matrisescreening med derivatisering med et tungt atommolekyl I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisoftalsyre). Ved å innlemme I3C i krystallgitteret, kan diffraksjonsfaseproblemet effektivt løses ved hjelp av enkelt bølgelengde uregelmessig dispergering (SAD) innfasing. Den likesidesidet trekantarrangement av jodatomer i I3C gir rask validering av en korrekt uregelmessig understruktur. Denne protokollen vil være nyttig for strukturelle biologer som løser makromolekylære strukturer ved hjelp av krystallografibaserte teknikker med interesse for eksperimentell innfasing.

Innlemme I3C i rMMS kan generere nye forhold som støtter derivatisert krystallvekst Effekten av samtidig rMMS screening og I3C-derivatisering ble demonstrert i to proteiner, høneeggehvite lysozym (HEWL, oppnådd som et lyofilisert pulver) og det antatte Orf11 lysin N-terminaldomenet (Orf11 NTD) fra bakteriofage P68. Hvert protein ble screenet mot PEG/ION HT under fire forskjellige forhold, inkludert: usett, seeded, usett med I3C og seeded med I3C (figur 1). For begge proteinene økte ikke det eneste tillegget av I3C antall forhold som bidrar til krystallisering. Når det gjelder Orf11 NTD, ble bare en egnet tilstand identifisert med og uten I3C (figur 1B). Da I3C ble lagt til HEWL-skjermene, ble antall treff redusert fra 31 til 26, noe som fremhevet de ekstra kompleksitetene ved krystallisering ved innføring av innfasingsforbindelser (figur 1A). I samsvar med andre studier, legge frø til kommersielle sparsomme matrise skjermer for å generere en rMMS skjerm betydelig økt antall mulige krystallisering forhold for begge proteiner, noe som resulterer i en 2.1 og 6 fold økning for HEWL og Orf11 NTD,henholdsvis 6,61 ( Figur1). Viktigst, samtidig tillegg av I3C og frø økte antall treff i forhold til en useeded skjerm, viser en 2,3 og 7 ganger økning for HEWL og Orf11 NTD, henholdsvis. Mange av krystallene fra rMMS i nærvær av I3C viser utmerket krystallmorfologi (figur 2).
Seeding gir nøye kontroll av krystallnummer i I3C rMMS-skjermer I mikrofrøeksperimenter kan antall frø introdusert i en krystalliseringsstudie kontrolleres ved fortynning av frøbestanden, og dette gir presis kontroll av kjerner idråpe 7,36. Dette gjør det ofte mulig for større krystaller å danne siden det er redusert konkurranse av proteinmolekyler på kjernesteder. Denne fordelen strekker seg også til I3C-rMMS-metoden og har blitt demonstrert med hell i både HEWL og Orf11 NTD. Rekreasjon av en krystallisering tilstand identifisert fra I3C-rMMS skjermen med en fortynnet frø lager ga færre, men større krystaller (Figur 3).
SAD innfasing kan brukes til å løse strukturer fra krystaller avledet fra rMMS I3C-skjermen Krystaller dyrket ved hjelp av fortynnet frø lager vist i figur 3 ble brukt til å løse strukturen av proteiner ved hjelp av SAD innfasing ved hjelp av diffraksjon data fra en enkelt krystall (Figur 4). Data ble samlet inn på den australske Synchrotron MX1 beamline62. Detaljerte detaljer om datainnsamling og strukturløsning er beskrevet andre steder27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig01.jpg"> Figur 1 - rMMS ble brukt til å generere nye forhold for krystallvekst i nærvær av I3C for to testproteiner. 96 brønndiffusjon krystallisering skjermer ble utført ved hjelp av kommersielle sparsomme matrise skjermer. (A) Høneeggehvite lysozym ble testet med Index HT-skjermen. Skuffer ble seeded med HEWL krystaller dyrket i 0,2 M ammonium tartrat dibasic pH 7,0, 20% (w / v) polyetylenglykol 3350. (B) Orf11 NTD fra bakteriofage P68 ble testet med PEG/ION-skjermen. Orf11 NTD skuffer ble seeded fra krystaller fra tilstand G12 fra usett skjerm, vist i blått. Forhold som støtter krystallvekst er vist i rødt. rMMS seeding i nærvær og fravær av I3C begge ga betydelig flere krystall treff enn usette skuffer. Figur tilpasset fra Truong et al.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig02.jpg"> Figur 2 - Representative bilder av krystaller dyrket fra dampdiffusjonsforsøkene vist i figur 1 (a) og (b). Figur tilpasset fra Truong et al.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig03.jpg"> Figur 3 - Fortynning av frøbestanden er en effektiv måte å redusere kjerner i en krystalliseringstilstand som finnes ved hjelp av I3C-rMMS-metoden, for å kontrollere antall krystaller som dannes. Å redusere kjerner i en dråpe fører ofte til at krystaller vokser til større dimensjoner. Figur tilpasset fra Truong et al.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig04.jpg"> Figur 4 - Orf11 NTD (PDB ID 6O43) og HEWL (PDB ID 6PBB) ble krystallisert ved hjelp av I3C-rMMS-metoden og løst ved hjelp av Auto-Rickshaw SAD-innfasing. (A) Båndstrukturer av HEWL og Orf11 NTD løst gjennom eksperimentell innfasing. (B) I3C molekyl bundet til HEWL og Orf11 NTD. (C) Uregelmessige jodatomer i I3C er arrangert i en likesidet trekant på 6 Å. Dermed indikerer tilstedeværelsen av denne trekanten i innfasingsunderbygningen at det er et I3C-molekyl i den posisjonen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61984fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Denne artikkelen presenterer en metode for å generere proteinkrystaller derivatisert med I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisoftalsyre) ved hjelp av mikroseeding for å generere nye krystalliseringsforhold i sparsomme matriseskjermer. Brettene kan settes opp ved hjelp av flytende dispenseringsroboter eller for hånd.

Derivatisering av proteinkrystaller med I3C ved hjelp av tilfeldig mikroseede matrix screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Dette er en krystalliseringsprotokoll designet for å optimalisere veksten av en proteinkrystall samtidig som proteinet utfaser med et innfasingsmolekyl for å bestemme strukturen til et protein ved røntgenkrystallografi. For å bestemme røntgenkrystallstrukturen til et helt nytt protein, er krystalliseringsforhold optimalisert for å produsere kvalitetskrystaller. I tilfelle av et helt nytt protein, må tunge atomer introduseres i krystallen for å produsere en derivatisert krystall.Røntgendiffraksjonsdata samles inn fra den derivatiserte krystallen og må beregnes på en beregningsmessig løsning for å produsere en røntgenkrystallstruktur. Krystallisering og derivitisering er begge arbeidskrevende prosesser. For å løse disse flaskehalsene har vi utviklet en optimalisert screeningprosedyre som samtidig oppnår begge disse målene.Denne protokollen bruker en tidligere utviklet teknikk kjent som tilfeldig mikroseed matrise screening. Krystaller eller krystallinsk bunnsplitt knuses opp i mikroseeder som kan brukes til å starte krystallvekst under helt uavhengige forhold. Samtidig introduserer vi et innfasingsmolekyl kalt I3C i krystalliseringstilstanden.Dette molekylet gir et stort uregelmessig signal som gjør at strukturen kan løses ved en enkelt bølgelengde uregelmessig diskusjonsfasing. For brukere som ikke er kjent med eksperimentell størrelse på krystallstrukturer, presenterer vi en brukervennlig programvarerørledning for å delvis automatisere strukturløsningen som skreddersyr den til å bruke det uregelmessige signalet fra I3C. Det første trinnet er å opprette en I3C-lager.Mål ut 120 milligram I3C i et mikrocentrifugerør. Tilsett 200 mikroliter med to molar litiumhydroksid til mikrocentrifugerøret. Oppvarming av røret ved 40 til 60 grader og vortexing kan brukes til å oppmuntre til oppløsning.Den ene molar lager av litium I3C-løsningen skal være brun. To metoder kan brukes til å introdusere I3C til proteinlageret. Litium I3C kan legges direkte til proteinlageret.3,75 mikroliter til 30 mikroliter I3C kan tilsettes til 150 mikroliter protein for å gi en konsentrasjon mellom fem og 14 millimolar. Noen proteiner kan utløse ved kontakt med høye konsentrasjoner av I3C. I disse tilfellene kan litium I3C legges til en proteinfortynningsbuffer som er buffer matchet prøveproteinet til en endelig konsentrasjon mellom 10 og 80 millimolar.Tilsett 150 mikroliter proteinfortynningsbuffer til 150 mikroliter proteinprøve. En glasssonde for å knuse krystaller er laget av et glass Pasteur pipette. Med en Bunsen brenner på den blå flammen, varme Pasteur pipette mot midten.Bruk et par pinsett, trekk endene av Pasteur pipetten ut i en tynn diameter på mindre enn 0,3 millimeter. Hold det segmentet i flammen for å skille pipetten på dette punktet og rundt enden av pipetten for å fullføre glasssonden. Dette er et eksempel på hvordan glasspipetten skal se ut.Krystall knuser kan også bestilles fra tredjepartsleverandører som et alternativ til å lage din egen En mikroseed lager genereres ved å knuse opp protein krystaller eller krystallinsk utfelling. Plasser fem 1,5 ml mikrocentrifuge rør på is. Under et lett mikroskop velger du de beste morfologikrysteriene eller krystallinsk utfelling som kan ofres.For 96 godt krystallisering skuffer åpne brønnen ved å kutte plast tetningstape. For hengende dråpebrett kan dekselet fjernes ved hjelp av pinsett og invertert på en flat overflate. Overfør 70 mikroliter reservoarløsning til et av mikrocentrifugerørene og chill på is.Til de resterende rørene, overfør 90 mikroliter reservoarløsning til den og gå tilbake til is for å kjøle seg ned. Hvis det ikke er til stede krystalliseringsreservoaret kan gjøres ved å blande de riktige reagensene og kan brukes i stedet. Agiter krystallene i krystalliseringsdråpen ved hjelp av glasssonden grundig knuse den opp.Fremgang kan overvåkes under mikroskopet til ingen krystaller eller krystallinsk materiale er synlig. Overfør all væsken fra dråpen til mikrocentrifugerøret som inneholder 70 mikroliter reservoaroppløsning. Bland ved å pipetter opp og ned.Overfør to til tre mikroliter av blandingen tilbake til brønnen og skyll brønnen ved å pipetter opp og ned. Overfør blandingen tilbake til mikrocentrifugerøret. Dette skylletrinnet bør gjentas igjen.Mikrocentrifugerøret bør holdes kaldt fra dette punktet fremover for å unngå å smelte mikroseedene. Vortex røret ved maksimal hastighet ved fire grader i ca tre minutter chilling røret på isen regelmessig for å hindre overoppheting. lage en av 10 seriell fortynninger av frøbestanden ved å sekvensielt overføre 10 mikroliter mellom de kjølte reservoarløsningene.Mellom frø lager fortynninger, bør røret være vortexed. Frøaksjer som ikke umiddelbart vil bli brukt, bør lagres i en minus 80 graders ultrakald fryser. En 96 godt tilfeldig mikroseed matrise skjerm kan settes opp ved hjelp av en flytende dispensering robot.Plasser frølageret, proteinlagerløsningen supplert med I3C og krystalliseringsskjermen i roboten. Bruk roboten overføre 75 mikroliter fra krystalliseringsskjermen til 96-brønnskuffen. Legg til en mikroliter til krystalliseringsfallet og 74 mikroliter i reservoaret.Overfør en mikroliter protein supplert med I3C til krystalliseringsfallet. Overfør 0,1 mikroliter frølager til krystalliseringsfallet. Forsegle platen ved hjelp av tetningstape.Hengende drop-skjermer kan settes opp i 24 godt hengende drop krystallisering skuffer. Smør kantene på hengende dråpebrønner. Overfør 500 mikroliter krystalliseringsløsning til reservoaret.Nær midten av et glassdeksel lysbilde plassere en en mikroliter dråpe krystallisering løsning. Til denne dråpen, legg til en mikroliter protein supplert med litium I3C og 0,1 mikroliter frølager. Inverter dekselet og forsegle krystalliseringen godt ved å skyve dekselet gli inn i fettet.Hengende dråpe- og tetningsdråpebrett ruges ved en konstant temperatur slik at det dannes krystaller. De bør regelmessig inspiseres under et mikroskop for krystallvekst. Etter at diffraksjonsdata er innhentet, integrert og skalert som forklart i den med fulgte skriftlige protokollen, kan Auto-Rickshaw automatisert krystallstrukturbestemmelsesrørledning brukes til å løse faseproblemet og modellere proteinet.Klikk på Fortsett-knappen på landingssiden for Auto-Rickshaw. Skriv inn din institusjonelle e-post i Auto-Rickshaw-webskjemaet, og klikk fortsett med å kjøre Auto-Rickshaw. For proteiner uten en homologi moto mal kjøre SAD protokollen auto-Rickshaw i avansert modus.Angi de nødvendige parameterne. Velg protein som molekyltype. Skriv inn datainnsamlingen bølgelengde i angstroms.Så som jeg som understrukturelement for å indikere jodatomer ble brukt. Velg I3C-understrukturtype for å indikere at I3C var innfasingsmolekylet. Velg sub_direct som bestemmelsesmetode for understruktur.Velg tre som antall forventede understrukturer per monomer. Angi en som reservasjonsavskjæring av understruktursøk. Dette gjør at Auto-Rickshaw automatisk kan bestemme en passende oppløsning cutoff.Angi antall rester i en enkelt monomer, romgruppe av datasettet og antall molekyler i den asymmetriske enheten basert på Matthews-koeffisienten. Velg riktig formidlingsnivå for røntgendata som passer dine behov. Skriv inn de uregelmessige dataene som en tom settfil.Skriv inn proteinsekvensen som en SEQ-, PIR- eller TXT-fil. Skriv inn din institusjonelle e-postadresse. Resultatene leveres til deg via en weblink sendt til den oppgitte e-postadressen.Hvis Auto-Rickshaw ikke løser strukturen ved hjelp av sin bestemte understruktur validering av understrukturen kan hjelpe i feilsøking struktur løsning. Last ned listen over tunge atomer nettsteder fra Auto-Rickshaw resultater siden. Det er en hyperkobling som kalles tunge atomområder.Dette vil laste ned en tekstfil med de tunge atomnettstedene. Endre filtypen for filen fra txt til pdb. Åpne pdb-filen i Coot.Slå på symmetri for å se alle de tunge atomer fra nærliggende asymmetriske enheter. Mål avstandene mellom de tunge atomer, inkludert på tvers av asymmetriske enheter. I3C vil vises som en likeside trekant med en sidelengde på seks angstroms.Tilstedeværelsen av en trekant med disse dimensjonene indikerer plasseringene av de tunge atomer er riktige. Hvis Auto-Rickshaw-understrukturen er feil, kan andre Auto-Rickshaw-innstillinger testes som beskrevet i den skriftlige protokollen. I3C RMMS-metoden ble testet på to proteiner, høneeggehvite lysozym ved hjelp av i HT-skjermen fra Hampton Research og domenet til Orf11 lysinprotein fra bakteriofage P68.Fullskjermer ble satt opp for hvert protein som tilsvarer kontrollskjermen uten I3C eller microseed, skjerm med microseed lagt til, skjerm med I3C, og til slutt skjermen med I3C og microseed. Legge I3C til en krystallskjerm ser ikke ut til å øke antall krystallisering treff. Med høneeggehvite lysozyme falt antall forhold fra 31 til 26.Med Orf11-domenet ble det funnet en enkelt treffbetingelse i kontrollskjermen. Legge I3C til skjermen ga også en enkelt hit i samme forhold. Å legge mikroseed til brønnen resulterte i en betydelig økning i antall treffforhold som resulterte i en 2,1 og seks ganger økning for henseeggehvite lysozyme og Orf11-domenet.Dette resultatet er i samsvar med andre studier testing RMMS. Viktigst, å legge I3C og microseed til en skjerm økte også antall treffforhold i forhold til kontrollskjermen som viser en 2,3 og syv ganger økning for henseeggehvite lysozyme og Orf11-domenet henholdsvis. Dette viser at I3C RMMS-metoden effektivt kan produsere nye forhold for derivatiserte krystaller.Krystaller fra disse forholdene kan høstes og brukes til å løse krystallstrukturen. Både strukturen av høne eggehvite lysozyme Orf11 domenet kan løses med SAD innfasing på Auto-Rickshaw rørledningen, ved hjelp av uregelmessig signal fra I3C demonstrere vellykket derivitization av I3C RMMS skjermen. Vi har presentert en enkel og effektiv protokoll for å produsere krystaller av høy kvalitet derivatisert med innfasingsmolekylet I3C.Det minimerer antall skjermer og krystallinske håndteringstrinn, og er dermed av særlig interesse for strukturelle biologer som studerer nye proteiner. Vi anbefaler på det sterkeste å optimalisere krystallstørrelsen ved å teste forskjellige frølagerfortynninger som ble gjort under frølagerforberedelse. Og dette trinnet er fullført etter at de første skjermene er gjort.I3C er allment tilgjengelig, og det er billig å kjøpe, og dermed tror vi denne metoden er innenfor rekkevidde av de fleste strukturelle biologi laboratorier.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Mikrokrystallografi av proteinkrystaller og<em&gt; I Cellulo</em&gt; Diffraksjon

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Voksende Protein krystaller med forskjellige dimensjoner bruke automatisert krystallisering kombinert med In Situ dynamisk lysspredning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluering av protein-protein interaksjoner ved hjelp av en on-membran fordøyelsen Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase inhibitor screening i selv-monterte Human protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetic screening av Nuklease aktivitet ved hjelp nukleinsyre acid sonder

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Opprette svært spesifikke kjemisk indusert protein Dimerization Systems av trinnvis Phage utvalg av Kombinatorisk single-Domain antistoff bibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisk screening og karakterisering av Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for vellykket krystallisering

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimalisering av veksten av endothiapepsinkrystaller for serielle krystallografieksperimenter

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Bakteriell uttrykk og rensing av human matrise Metalloproteinase-3 ved hjelp av affinitet kromatografi

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...