Name: derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening
Uploaded: 2021-01-16T15:00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Это исследование было проведено на линии пучка MX1 на австралийском синхротроне, в составе ANSTO. Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников лабораторий Ширвина и Брунинга за обсуждение этой работы. Авторы также хотели бы отметить д-ра Сантуха Панджикара и д-ра Линду Уайтт-Шервин, которые внесли свой вклад в первоначальную работу, которая стала инициатором этого протокола.
Признается следующее финансирование: Австралийский исследовательский совет (грант Nos. DP150103009 и DP160101450 Кит Э. Ширвин); Университет Аделаиды (Австралийская государственная программа подготовки научных исследований стипендию стипендию Цзя Куйен Труонг и Стефани Нгуен).

Авторов нечего раскрывать.

Определение структуры нового белка при отсутствии подходящей гомологической модели для молекулярной замены требует экспериментального поэтапного отказа. Эти методы требуют включения тяжелых атомов в кристалл белка, что добавляет уровень сложности трубопровода определения структуры и может ввести многочисленные препятствия, которые должны быть решены. Тяжелые атомы могут быть включены непосредственно в белок через маркированные выражения с использованием селенометионина и селеноцистеина. Поскольку этот метод является дорогостоящим, трудоемким и может привести к снижению урожайности белка, маркированный белок часто выражается после того, как условия кристаллизации были найдены и оптимизированы с немаркированный белок. Кроме того, кристаллы могут быть выведены путем замачивания в растворе,содержащем тяжелые атомы 22,63,64. Этот метод часто использует высококачественные кристаллы и поэтому выполняется после того, как уже разработан надежный метод кристаллизации. Успешное получение производных кристаллов с использованием этого метода требует дальнейшей оптимизации процедур замачивания и скрининга различных фазовых соединений, поэтому добавляет больше времени к и без того трудоемкому процессу.
Сокристаллизация белка с тяжелым атомом может быть выполнена на стадии скрининга, таким образом эффективно оптимизируя процесс и уменьшая шаги манипуляции кристаллом, которые могут привести к повреждению. Тем не менее, по-прежнему существует потенциальный сценарий получения нескольких первоначальных хитов кристаллизации и проблема выбора совместимого тяжелого атома соединения. Многие имеющиеся в настоящее время соединения поэтапного отказа несовместимы с обрывистыми, буферами и добавками, обычно встречаемыми в условиях кристаллизации. Они могут быть нерастворимыми в сульфатных и фосфатных буферов, хелат цитрат и ацетат, реагировать неблагоприятно с HEPES и Tris буферов или стать секвестрирован DTT и β-меркаптоэтанол21. Поскольку соединение I3C поэтапно не страдает от этих несовместимостей, это надежное поэтапное соединение, которое может быть поденципным для многих различных условий.
В этом исследовании представлен обтекаемый метод производства производных кристаллов, готовых к поэтапному отказу от САД путем одновременной совместной кристаллизации соединения I3C и rMMS. Сочетание обоих методов увеличивает количество кристаллизации хитов, со многими условиями, имеющих улучшение морфологии и дифракции характеристики. В обоих случаях испытаний Orf11 NTD и HEWL были выявлены новые условия на экране I3C-rMMS, которые отсутствовали, когда I3C не присутствовал. Потенциально I3C может благоприятно связываться с белком, способствуя образованию и стабилизации кристаллических контактов27. В свою очередь, это может вызвать кристаллизацию и, возможно, улучшить дифракционные характеристики. Помимо того, что соединение совместимо с редкими матричными экранами, I3C также является привлекательным соединением поэтапного отказа из-за его внутренних свойств. Функциональные группы, которые чередуются с йодом на ароматических эшафот кольцо позволяют конкретные связывания с белками. Это приводит к большей заполняемости и потенциально уменьшает фоновыйсигнал 23. Кроме того, расположение аномальных рассеяний в равностороннем треугольнике очевидно в подструктуре и может быть использовано для быстрой проверки связывания I3C(рисунок 4B и 4C). Наконец, он может производить аномальный сигнал с настраиваемым синхротронным излучением, а также хромом и медью вращающихся рентгеновских источников анода. Таким образом, он может быть применен к различным рабочим процессам. Поскольку I3C широко доступен и недорог в покупке, этот подход находится в пределах досягаемости для большинства лабораторий структурной биологии.
Существует несколько экспериментальных соображений, которые необходимо учитывать при использовании метода I3C-rMMS. Этот метод не может быть применен, если первоначальный кристаллический материал белка не может быть получен. В сложных случаях кристаллический материал из гомологового белка также может быть использован для генерации семенного запаса. Этот кросс-посев подход к rMMS показал некоторые многообещающие результаты7. Оптимизация кристаллического числа за счет разбавления семенного запаса является важным шагом, который не следует упускать из виду, чтобы максимизировать шансы на производство высококачественных крупных кристаллов и получение подходящих данных дифракции. Если в асимметричной единице выявлено несколько участков I3C, условия, способствующие кристаллизации, следует дополнительно оптимизировать с повышенной концентрацией I3C. Это может увеличить заполняемость I3C, чтобы максимизировать аномальный сигнал и помощь кристалла вытекают.
Там могут быть случаи, когда этот метод не может быть оптимальным методом для производных кристаллов белка. По мере увеличения размера белка или белкового комплекса ограниченное число сайтов I3C на поверхности белка может не обеспечить достаточную силу поэтапного решения структуры. В этих сценариях, где размер белка, как сообщается, является мтукации, селенометионин маркировки белка может быть более жизнеспособным подходом к поэтапному отказу от белка. Если белок имеет достаточное количество остатков метамфетамина в белке (рекомендуется иметь по крайней мере один methionine на 100остатков 65) и высокая эффективность селенометионина включения в белок может быть достигнуто (например, в бактериальныхсистем выражения 66), несколько высокой занятости атомов селена будет присутствовать в кристаллах фазы структуры.
Кроме того, некоторые белки могут по своей сути быть непригодными для производных с I3C. Места связывания I3C на белках зависят от структуры белка. Там могут существовать белки, которые, естественно, имеют несколько открытых патчей совместимы с I3C связывания. Таким образом, не предвидится, что могут возникнуть трудности в совместной кристаллизации некоторых целевых белков с I3C.

В области структурной биологии рентгеновская кристаллография рассматривается как техника золотого стандарта для определения структуры макромолекулы с атомным разрешением. Он был широко использован для понимания молекулярной основы заболеваний, руководство рациональных проектов дизайна наркотиков и выяснить каталитический механизмферментов 1,2. Хотя структурные данные предоставляют богатые знания, процесс экспрессии и очищения белка, кристаллизации и определения структуры может быть чрезвычайно трудоемким. Обычно встречаются несколько узких мест, которые препятствуют продвижению этих проектов, и это необходимо решить для эффективной оптимизации трубопровода определения кристаллической структуры.
После рекомбинантного выражения и очищения необходимо определить предварительные условия, способствующие кристаллизации, что зачастую является трудным и трудоемким аспектом рентгеновской кристаллографии. Коммерческие редкие матричные экраны, которые консолидируют известные и опубликованные условия, были разработаны, чтобы облегчитьэто узкое место 3,4. Тем не менее, он является общим для создания нескольких хитов из этих первоначальных экранов, несмотря на использование высоко чистых и концентрированных образцов белка. Наблюдение за явными каплями указывает на то, что белок может не достигать уровня супернасыщения, необходимого для нуклеата кристалла. Для поощрения кристаллизации и роста, семена, произведенные из уже существующих кристаллов могут быть добавлены к условиям, и это позволяет увеличить выборку пространства кристаллизации. Ireton и Stoddard впервые представили метод скрининга матрицы микросея5. Кристаллы низкого качества были измельчены, чтобы сделать запас семян, а затем систематически добавляются к условиям кристаллизации, содержащим различные соли для создания новых кристаллов дифракции качества, которые иначе не сформировались бы. Этот метод был дополнительно усовершенствован D'Arcy et al., который разработал случайный микросеяный матричный скрининг (rMMS), в котором семена были введены в запасной экран кристаллизацииматрицы 6,7. Это улучшило качество кристаллов и увеличило количество кристаллизации хитов в среднем в 7 раз.
После успешного производства кристаллов и получения рентгеновского дифракционного шаблона возникает еще одно узкое место в виде решения «фазовой проблемы». В процессе сбора данных регистрируется интенсивность дифракции (пропорционально квадрату амплитуды), но фазовая информация теряется, что порождает фазовую проблему, которая останавливает немедленное определениеструктуры 8. Если целевой белок разделяет высокую последовательность идентичности белка с ранее определенной структурой, молекулярная замена может быть использованадля оценки фазовой информации 9,10,11,12. Хотя этот метод является быстрым и недорогим, структуры моделей могут быть недоступны или пригодны. Успех метода молекулярной замены на основе гомологии значительно снижается по мере того, как идентичность последовательности опускается ниже 35%13. При отсутствии подходящей гомологической модели можно протестировать методы ab initio, такие как ARCIMBOLDO14,15 и AMPLE16. Эти методы используют компьютерно предсказанные модели или фрагменты в качестве отправной точки для молекулярной замены. AMPLE, которая использует предсказанные модели приманки в качестве отправной точки, изо всех сил пытается решить структуры больших (100 остатков) белков и белков, содержащих преимущественно β-листы. ARCIMBOLDO, который пытается поместить мелкие фрагменты, чтобы расширить в большую структуру, ограничивается данными высокого разрешения (≤2 К) и способностью алгоритмов расширить фрагменты в полную структуру.
Если методы молекулярной замены не удается, прямыеметоды, такие как изоморфная замена 17,18 и аномальное рассеяние наодной длине волны(SAD 19 ) или несколько длин волн (MAD20) должны быть использованы. Это часто имеет место для по-настоящему новых структур, где кристалл должен быть сформирован или выведен с тяжелым атомом. Это может быть достигнуто путем замачивания или совместного кристаллизации с тяжелым соединением атома, химической модификации (например, 5-бромурацилов включения в РНК) или помечены выражение белка (например, включение селенометионина или селеноцистеина аминокислоты впервичную структуру) 21,22. Это еще больше усложняет процесс кристаллизации и требует дополнительного скрининга и оптимизации.
Новый класс фазирования соединений, в том числе I3C (5-амино-2,4,6-трийодоизофталеновая кислота) и B3C (5-амино-2,4,6-трибромуазофталовая кислота), предлагают захватывающие преимущества по сравнению с уже существующимисоединениями фазирования 23,24,25. Оба I3C и B3C имеют ароматические эшафот кольца с чередующимся расположением аномальных рассеяний, необходимых для прямых методов поэтапного и аминокислот или карбоксилат функциональных групп, которые взаимодействуют конкретно с белком и обеспечивают связывающую специфичность сайта. Последующее равностороннее треугольное расположение групп тяжелых металлов позволяет упростить проверку фазированной подструктуры. На момент написания статьи в Банке данных о белках (PDB) было 26 связанных I3C структур, из которых 20 были решены с помощью SAD26.
Этот протокол повышает эффективность конвейера определения структуры путем объединения методов производных тяжелых металлов и скрининга rMMS для одновременного увеличения числа кристаллизации хитов и упрощения процесса производных кристаллизации. Мы продемонстрировали, что этот метод был чрезвычайно эффективен с куриным яичным белком лизозимом и областью нового белка лизина из бактериофажа P6827. Описано структурированное решение с использованием высокоагматизированных конвейеров определения структуры Auto-rickshaw, специально разработанных для поэтапного соединения I3C. Существуют и другие автоматизированные трубопроводы, которые могут быть использованы, такие как AutoSol28,ELVES29 и CRANK230. Не полностью автоматизированные пакеты, такие как SHELXC/D/E также могут бытьиспользованы 31,32,33. Этот метод особенно полезен исследователям, изучающим белки, не имеющие гомологичные модели в PDB, значительно уменьшая количество этапов скрининга и оптимизации. Предпосылкой для этого метода являются кристаллы белка или кристаллический осадок целевого белка, полученный в ходе предыдущих испытаний кристаллизации.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL disposable luer lock syringes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>T3SS10LAT</td>
			<td>Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used for hanging drop crystal tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-506</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22178</td>
			<td>Commonly referred to as I3C in the article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-297</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18X18-2</td>
			<td>Coverslips for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning vacuum grease</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-510</td>
			<td>Used for sealing hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette 0.1 &#956;L-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 2 &#956;L-20 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1153247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 20 &#956;L-200 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1152006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>HIR92601.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Approximately 95% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IndexHT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope illuminator</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>FT192/230</td>
			<td>Light source to illuminate crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/ION HT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Liquid Dispenser</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel with scalpel blade no. 15</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>LV-SMSCPO15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope&#160;</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>EMZ-5TR</td>
			<td>Microscope for visualising crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>RAVM1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening

Разъяснение структуры белка с помощью рентгеновской кристаллографии требует как высококачественных дифракционных кристаллов, так и вычислительного решения проблемы фазы дифракции. Новые структуры, которые не имеют подходящей гомологической модели, часто получают тяжелые атомы для предоставления экспериментальной фазовой информации. Представленный протокол эффективно генерирует производные кристаллы белка путем объединения случайного микросеяного матричного скрининга с производным с тяжелой молекулой атома I3C (5-амино-2,4,6-трийодоизофталиковая кислота). Путем включения I3C в кристаллическую решетку, проблема фазы дифракции может быть эффективно решена с помощью одноволновой аномальной дисперсии (SAD) поэтапного. Равностороннее расположение атомов йода в I3C позволяет быстро исправлять правильную аномальную подструктуру. Этот протокол будет полезен структурным биологам, которые решают макромолекулярные структуры с использованием методов на основе кристаллографии, интересующихся экспериментальным фазированием.

Включение I3C в rMMS может создать новые условия, поддерживающие производный кристаллический рост Эффективность одновременного скрининга rMMS и производной I3C была продемонстрирована в двух белках, лизозиме куриного яичного белка (HEWL, полученном как лиофилизированный порошок) и предполагаемом домене Orf11 lysin N-terminal (Orf11 NTD) из бактериофажа P68. Каждый белок был проверен на PEG/ION HT при четырех различных условиях, включая: несеяные, семенами, несеяные с I3C и посеяны с I3C (Рисунок 1). Для обоих белков, единственное добавление I3C не увеличить количество условий, способствующих кристаллизации. В случае Orf11 NTD, только одно подходящее условие было определено с и без I3C (Рисунок 1B). Когда I3C был добавлен на экраны HEWL, количество попаданий было сокращено с 31 до 26, подчеркивая дополнительные сложности кристаллизации при введении фазирования соединений(рисунок 1A). В соответствии с другими исследованиями, добавление семян в коммерческие редкие матричные экраны для создания экрана rMMS значительно увеличило количество возможных условий кристаллизации для обоих белков, в результате чего в 2,1 и 6 раз больше для HEWL и Orf11 NTD,соответственно 6,61 (Рисунок 1). Самое главное, одновременное добавление I3C и семян увеличило количество попаданий относительно несеяного экрана, продемонстрировав увеличение в 2,3 и 7 раз для HEWL и Orf11 NTD, соответственно. Многие кристаллы из rMMS в присутствии I3C показывают отличную кристаллическую морфологию(рисунок 2).
Посев позволяет тщательно контролировать количество кристаллов на экранах I3C rMMS В экспериментах по микросеянию количество семян, введенных в испытание кристаллизации, можно контролировать путем разбавления семенного запаса, что позволяет точно контролировать нуклеациюпри падении 7,36. Это часто позволяет более крупным кристаллам формироваться, так как существует снижение конкуренции белковых молекул в местах нуклеации. Это преимущество также распространяется на метод I3C-rMMS и успешно продемонстрировано как в HEWL, так и в Orf11 NTD. Восстановление состояния кристаллизации, идентифицированного на экране I3C-rMMS с разбавленным запасом семян, дало меньше, но больших кристаллов(рисунок 3).
SAD поэтапное может быть использовано для решения структур из кристаллов, полученных из экрана rMMS I3C Кристаллы, выращенные с использованием разбавленного семенного запаса, показанного на рисунке 3, использовались для решения структуры белков с использованием SAD phasing с использованием данных дифракции из одногокристалла (рисунок 4). Данные были собраны на австралийском синхротроне MX1 луч62. Подробные детали сбора данных и структурного решения описаны вдругом месте 27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig01.jpg"> Рисунок 1 - rMMS был использован для создания новых условий для роста кристалла в присутствии I3C для двух тестовых белков. 96 хорошо пара диффузии кристаллизации экраны были проведены с использованием коммерческих редких матричных экранов. (A) Куриный яичный белок лизозим был протестирован с экраном индекс HT. Треи были посеяны с кристаллами HEWL, выращенными в 0.2 M аммония tartrate dibasic pH 7.0, 20% (w/v) полиэтиленгликоль 3350. (B) Orf11 NTD из бактериофажа P68 был протестирован с экраном PEG/ION. Лотки Orf11 NTD были посеяны из кристаллов из состояния G12 с несеяного экрана, показанного синим цветом. Условия, поддерживающие рост кристалла, показаны красным цветом. rMMS посева в присутствии и отсутствии I3C как дал значительно больше кристаллических хитов, чем несеяные лотки. Рисунок адаптирован из Труонг и др.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig02.jpg"> Рисунок 2 - Репрезентативные изображения кристаллов, выращенных в результате диффузионных испытаний пара, показанных на рисунке 1 (a) и b). Рисунок адаптирован из Труонг и др.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig03.jpg"> Рисунок 3 - Разбавление семенного запаса является эффективным способом уменьшения нуклеации в состоянии кристаллизации, найденной с использованием метода I3C-rMMS, для контроля количества кристаллов, которые образуются. Уменьшение нуклеации в капле часто приводит к росту кристаллов до больших размеров. Рисунок адаптирован из Труонг и др.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig04.jpg"> Рисунок 4 - Orf11 NTD (PDB ID 6O43) и HEWL (PDB ID 6PBB) были кристаллизованы с помощью метода I3C-rMMS и решены с помощью автоматического поэтапного отказа от рикши SAD. (A)Лентоные структуры HEWL и Orf11 NTD решаются путем экспериментального поэтапного отказа. (B) молекула I3C связана с HEWL и Orf11 NTD. (C) Аномальные атомы йода в I3C расположены в равностороннем треугольнике 6. Таким образом, наличие этого треугольника в фазированной подструктуре указывает на то, что в этом положении находится молекула I3C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61984fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

В этой статье представлен метод генерации кристаллов белка, полученных с помощью I3C (5-амино-2,4,6-трийодоизофталеновой кислоты) с использованием микросея, чтобы генерировать новые условия кристаллизации в редких матричных экранах. Лотки могут быть настроены с помощью жидких роботов дозирования или вручную.

Вывод белковых кристаллов с I3C с помощью случайного скрининга матрицы микросея

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Микрокристаллизация кристаллов белков и<em&gt; Разное</em&gt; Дифракция

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Растущий белок кристаллы с отдельных измерений с помощью автоматизированных кристаллизации, в сочетании с в Situ Динамическое рассеяние света

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Оценка взаимодействия белкови-белков с использованием метода пищеварения On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Скрининг ингибиктора Киназы в самособранных микроарах человеческого белка

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Кинетический скрининг nuclease деятельности с использованием нуклеиновой кислоты зондов

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Создание высокоспецифических химически индуцированных систем димеризации белка по шагу Phage Выбор комбинаторных однодоменных антител библиотеки

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Стратегический скрининг и характеристика визуального GPCR-мини-G Белковый сигнальный комплекс для успешной кристаллизации

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Оптимизация роста кристаллов эндотиапепсина для серийных кристаллографических экспериментов

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Бактериальная экспрессия и очистка металлопротеиназы-3 матрицы человека с помощью аффинной хроматографии

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...