Name: derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening
Uploaded: 2021-01-16T15:00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Esta investigación se llevó a cabo en la línea de haz MX1 en el Sincrotrón Australiano, parte de ANSTO. Los autores desean reconocer a los miembros de los laboratorios Shearwin y Bruning para los debates sobre este trabajo. Los autores también quieren reconocer a la Dra. Santosh Panjikar y a la Dra. Linda Whyatt-Shearwin que contribuyeron a la obra original que fue pionera en este protocolo.
Se reconoce la siguiente financiación: Consejo Australiano de Investigación (concesión Nos. DP150103009 y DP160101450 a Keith E. Shearwin); Universidad de Adelaida (Beca de estipendio del Programa de Entrenamiento de Investigación del Gobierno Australiano para Jia Quyen Truong y Stephanie Nguyen).

Los autores no tienen nada que revelar.

La determinación de la estructura de una proteína novedosa en ausencia de un modelo de homología adecuado para el reemplazo molecular requiere una fase experimental. Estos métodos requieren la incorporación de átomos pesados en el cristal proteico que añade un nivel de complejidad a la tubería de determinación de la estructura y puede introducir numerosos obstáculos que deben ser abordados. Los átomos pesados se pueden incorporar directamente en la proteína a través de la expresión etiquetada utilizando selenomethionina y selenocisteína. Como este método es costoso, laborioso y puede resultar en menores rendimientos proteicos, la proteína etiquetada a menudo se expresa después de que se han encontrado condiciones de cristalización y se ha optimizado con proteínas sin etiquetar. Alternativamente, los cristales pueden ser derivados empapando en una solución que contiene átomos pesados22,63,64. Este método a menudo utiliza cristales de alta calidad y por lo tanto se realiza después de que ya se ha desarrollado un método de cristalización robusto. Obtener con éxito un cristal derivado utilizando este método requiere una mayor optimización de los procedimientos de remojo y el cribado de diferentes compuestos de fase, añadiendo así más tiempo a un proceso ya laborioso.
La co-cristalización de la proteína con el átomo pesado se puede realizar en la etapa de cribado, agilizando así eficientemente el proceso y reduciendo los pasos de manipulación de cristales que pueden causar daños. Sin embargo, todavía existe el escenario potencial de obtener pocos impactos iniciales de cristalización y el problema de elegir un compuesto de átomo pesado compatible. Muchos compuestos de fase disponibles actualmente son incompatibles con precipitantes, tampones y aditivos que se encuentran comúnmente en condiciones de cristalización. Pueden ser insolubles en tampones de sulfato y fosfato, quelato al citrato y acetato, reaccionar desfavorablemente con los amortiguadores HEPES y Tris o ser secuestrados por la TDT y β-mercaptoetanol21. Como el compuesto de fase I3C no sufre de estas incompatibilidades, es un compuesto de fase robusta que podría ser susceptible a muchas condiciones diferentes.
En este estudio, se presenta un método simplificado de producción de cristales derivados listos para la fase SAD a través de la co-cristalización simultánea del compuesto de fase I3C y rMMS. La combinación de ambas técnicas aumenta el número de golpes de cristalización, con muchas de las condiciones que han mejorado la morfología y las características de difracción. En los casos de prueba Orf11 NTD y HEWL, se identificaron nuevas condiciones en la pantalla I3C-rMMS que estaban ausentes cuando I3C no estaba presente. Potencialmente, I3C puede unirse favorablemente a la proteína, facilitando la formación y estabilización de contactos de cristal27. A su vez, esto puede inducir cristalización y posiblemente mejorar las características de difracción. Además de ser un compuesto compatible con pantallas de matriz dispersas, I3C es también un atractivo compuesto de fase debido a sus propiedades intrínsecas. Los grupos funcionales que se alternan con el yodo en el andamio del anillo aromático permiten una unión específica a las proteínas. Esto conduce a una mayor ocupación y potencialmente reduce la señal de fondo23. Además, la disposición de dispersores anómalos en un triángulo equilátero es evidente en la subestructura y se puede utilizar para validar rápidamente la unión de I3C(Figura 4B y 4C). Por último, puede producir una señal anómala con radiación sincrotrón sintonizable, así como fuentes de rayos X de ánodo giratorio de cromo y cobre. Por lo tanto, se puede aplicar a muchos flujos de trabajo diferentes. Como I3C está ampliamente disponible y es barato de comprar, este enfoque está al alcance de la mayoría de los laboratorios de biología estructural.
Hay varias consideraciones experimentales que deben abordarse cuando se utiliza el método I3C-rMMS. Este método no se puede aplicar si no se puede obtener material cristalino inicial de la proteína. En casos difíciles, el material cristalino de una proteína homóloga también se puede utilizar para generar stock de semillas. Este enfoque de la siembra cruzada de rMMS ha mostrado algunos resultados prometedores7. Optimizar el número de cristal a través de la dilución del stock de semillas es un paso crucial, que no debe pasarse por alto, para maximizar la posibilidad de producir cristales grandes de alta calidad y adquirir datos de difracción adecuados. Si hay pocos sitios I3C identificados en la unidad asimétrica, las condiciones propicias para la cristalización deben optimizarse aún más con una mayor concentración de I3C. Esto puede aumentar la ocupación de I3C para maximizar la señal anómala y ayudar a la derivación de cristal.
Puede haber casos en los que esta técnica puede no ser el método óptimo para derivar cristales proteicos. A medida que aumenta el tamaño de una proteína o complejo proteico, el número limitado de sitios I3C en la superficie de la proteína puede no proporcionar suficiente potencia de fase para resolver la estructura. En estos escenarios en los que se sospecha que el tamaño de las proteínas está impidiendo la fase, el etiquetado de la proteína puede ser un enfoque más viable para la eliminación gradual de la proteína. Si la proteína tiene un número adecuado de residuos de metionina en la proteína (recomendado tener al menos una metionina por cada 100 residuos65)y se puede lograr la incorporación de selenomethionina de alta eficiencia en una proteína (como en los sistemas de expresión bacteriana66), múltiples átomos de selenio de alta ocupación estarán presentes en los cristales para fase de la estructura.
Además, algunas proteínas pueden intrínsecamente no ser adecuadas para la derivación con I3C. Los sitios de unión I3C a proteínas dependen de la estructura proteica. Puede haber proteínas que naturalmente tienen pocos parches expuestos compatibles con la unión I3C. Por lo tanto, no es imprevisible que pueda haber dificultades para co-cristalizar algunas proteínas diana con I3C.

En el campo de la biología estructural, la cristalografía de rayos X se considera como la técnica estándar de oro para determinar las estructuras de resolución atómica de las macromoléculas. Se ha utilizado ampliamente para entender la base molecular de las enfermedades, guiar proyectos de diseño racional de fármacos y dilucidar el mecanismo catalítico de las enzimas1,2. Aunque los datos estructurales proporcionan una gran cantidad de conocimientos, el proceso de expresión y purificación de proteínas, cristalización y determinación de la estructura puede ser extremadamente laborioso. Comúnmente se encuentran varios cuellos de botella que dificultan el progreso de estos proyectos y esto debe abordarse para agilizar eficientemente el gasoducto de determinación de la estructura cristalina.
Después de la expresión y purificación recombinantes, deben identificarse las condiciones preliminares que favorezcan la cristalización, que a menudo es un aspecto arduo y lento de la cristalografía de rayos X. Se han desarrollado pantallas de matriz dispersa comercial que consolidan las condiciones conocidas y publicadas para aliviar este cuello de botella3,4. Sin embargo, es común generar pocos impactos de estas pantallas iniciales a pesar de usar muestras de proteínas altamente puras y concentradas. Observar gotas claras indica que la proteína puede no estar alcanzando los niveles de supersaturación requeridos para nuclear un cristal. Para fomentar la nucleación cristalina y el crecimiento, las semillas producidas a partir de cristales preexistentes se pueden añadir a las condiciones y esto permite un mayor muestreo del espacio de cristalización. Ireton y Stoddard introdujeron por primera vez el método de cribado de matriz de microsedas5. Los cristales de mala calidad fueron triturados para hacer un stock de semillas y luego se añadieron sistemáticamente a las condiciones de cristalización que contienen diferentes sales para generar nuevos cristales de calidad de difracción que de otro modo no se habrían formado. Esta técnica fue mejorada aún más por D'Arcy et al. que desarrollaron cribado aleatorio de matriz de microsedas (rMMS) en el que las semillas se introdujeron en una pantalla de cristalización de matriz de repuesto6,7. Esto mejoró la calidad de los cristales y aumentó el número de impactos de cristalización en promedio en un factor de 7.
Después de que los cristales se producen con éxito y se obtiene un patrón de difracción de rayos X, se encuentra otro cuello de botella en forma de resolución del "problema de fase". Durante el proceso de adquisición de datos, se registra la intensidad de la difracción (proporcional al cuadrado de la amplitud) pero se pierde la información de fase, dando lugar al problema de fase que detiene la determinación inmediata de la estructura8. Si la proteína objetivo comparte una identidad de secuencia alta con una proteína con una estructura previamente determinada, se puede utilizar la sustitución molecular para estimar la información de fase9,10,11,12. Aunque este método es rápido y económico, las estructuras del modelo pueden no estar disponibles o no ser adecuadas. El éxito del método de reemplazo molecular basado en modelos de homología disminuye significativamente a medida que la identidad de la secuencia cae por debajo del 35%13. En ausencia de un modelo de homología adecuado, se pueden probar métodos ab initio, como ARCIMBOLDO14,15 y AMPLE16. Estos métodos utilizan modelos o fragmentos predichos computacionalmente como puntos de partida para el reemplazo molecular. AMPLE, que utiliza modelos de señuelo previstos como puntos de partida, lucha para resolver estructuras de proteínas y proteínas grandes (>100 residuos) que contienen predominantemente hojas de β. ARCIMBOLDO, que intenta encajar pequeños fragmentos para extenderse a una estructura más grande, se limita a los datos de alta resolución (≤2o) y a la capacidad de los algoritmos para expandir los fragmentos en una estructura completa.
Si los métodos de sustitución molecular fallan, deben utilizarse métodos directos como el reemplazo isomórfico17,18 y la dispersión anómala a una sola longitud de onda (SAD19)o de varias longitudes de onda (MAD20). Este es a menudo el caso de estructuras verdaderamente novedosas, donde el cristal debe ser formado o derivado con un átomo pesado. Esto se puede lograr empapando o co-cristalizando con un compuesto de átomo pesado, modificación química (como la incorporación de 5 bromouralo en el ARN) o la expresión de proteínas etiquetada (como la incorporación de selenomethionine o aminoácidos de selenocisteína en la estructura primaria)21,22. Esto complica aún más el proceso de cristalización y requiere cribado y optimización adicionales.
Una nueva clase de compuestos de fase, incluyendo I3C (5-amino-2,4,6-ácido triiodoisofáltico) y B3C (5-amino-2,4,6-ácido tribromoisophálico), ofrecen ventajas emocionantes sobre los compuestos de fase preexistentes23,24,25. Tanto I3C como B3C cuentan con un andamio de anillo aromático con una disposición alterna de dispersiones anómalas necesarias para los métodos de fase directa y los grupos funcionales de aminoácidos o carboxilatos que interactúan específicamente con la proteína y proporcionan especificidad del sitio de unión. La posterior disposición triangular equilátero de los grupos de metales pesados permite una validación simplificada de la subestructura de fase. En el momento de la redacción, hay 26 estructuras enlazadas a I3C en el Banco de Datos de Proteínas (PDB), de las cuales 20 se resolvieron utilizando la fase SAD26.
Este protocolo mejora la eficacia de la tubería de determinación de la estructura mediante la combinación de los métodos de derivación de metales pesados y cribado rMMS para aumentar simultáneamente el número de golpes de cristalización y simplificar el proceso de derivación de cristal. Demostramos que este método era extremadamente eficaz con la lisoz de la clara de huevo de gallina y un dominio de una nueva proteína de lesina de bacteriófago P6827. Se describe la solución de estructura mediante la tubería de determinación de estructura Auto-Rickshaw altamente automatizada, específicamente adaptada para el compuesto de fase I3C. Existen otras canalizaciones automatizadas que se pueden utilizar como AutoSol28,ELVES29 y CRANK230. Los paquetes no totalmente automatizados como SHELXC/D/E también se pueden utilizar31,32,33. Este método es particularmente beneficioso para los investigadores que están estudiando proteínas que carecen de modelos homólogos en la PDB, al reducir significativamente el número de pasos de detección y optimización. Un requisito previo para este método son los cristales de proteína o un precipitado cristalino de la proteína diana, obtenido de ensayos de cristalización anteriores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL disposable luer lock syringes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>T3SS10LAT</td>
			<td>Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used for hanging drop crystal tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-506</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22178</td>
			<td>Commonly referred to as I3C in the article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-297</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18X18-2</td>
			<td>Coverslips for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning vacuum grease</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-510</td>
			<td>Used for sealing hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette 0.1 &#956;L-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 2 &#956;L-20 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1153247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 20 &#956;L-200 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1152006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>HIR92601.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Approximately 95% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IndexHT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope illuminator</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>FT192/230</td>
			<td>Light source to illuminate crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/ION HT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Liquid Dispenser</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel with scalpel blade no. 15</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>LV-SMSCPO15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope&#160;</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>EMZ-5TR</td>
			<td>Microscope for visualising crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>RAVM1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening

La elucidación de la estructura proteica mediante cristalografía de rayos X requiere tanto cristales difractantes de alta calidad como solución computacional del problema de la fase de difracción. Las estructuras novedosas que carecen de un modelo de homología adecuado a menudo se derivan con átomos pesados para proporcionar información de fase experimental. El protocolo presentado genera eficientemente cristales de proteínas derivados mediante la combinación de cribado aleatorio de matriz de microsedora con derivatización con una molécula de átomo pesado I3C (ácido 5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic). Al incorporar I3C en la celosía de cristal, el problema de la fase de difracción se puede resolver eficientemente utilizando una sola fase de dispersión anómala de longitud de onda (SAD). La disposición del triángulo equilátero de los átomos de yodo en I3C permite una validación rápida de una subestructura anómala correcta. Este protocolo será útil para los biólogos estructurales que resuelven estructuras macromoleculares utilizando técnicas basadas en cristalografía con interés en la fase experimental.

La incorporación de I3C en rMMS puede generar nuevas condiciones que apoyen el crecimiento de cristales derivados La eficacia del cribado simultáneo de RMMS y la derivación de I3C se demostró en dos proteínas, la lysozyme de clara de huevo de gallina (HEWL, obtenida como polvo liofilizado) y el dominio putative Orf11 de lisina N-terminal (Orf11 NTD) de la bacteria P68. Cada proteína fue examinada contra PEG/ION HT en cuatro condiciones diferentes, incluyendo: sin semillas, sembrada, sin sembrar con I3C y sembrada con I3C (Figura 1). Para ambas proteínas, la única adición de I3C no aumentó el número de condiciones propicias para la cristalización. En el caso de Orf11 NTD, sólo se identificó una condición adecuada con y sin I3C (Figura 1B). Cuando se añadió I3C a las pantallas HEWL, el número de aciertos se redujo de 31 a 26, destacando las complejidades añadidas de la cristalización al introducir compuestos de fase (Figura 1A). De acuerdo con otros estudios, la adición de semillas a las pantallas de matriz dispersa comercial para generar una pantalla rMMS aumentó significativamente el número de posibles condiciones de cristalización para ambas proteínas, lo que resultó en un aumento de 2.1 y 6 veces para HEWL y Orf11 NTD, respectivamente6,61 ( Figura1). Lo más importante es que la adición simultánea de I3C y la semilla aumentó el número de visitas en relación con una pantalla no sembrada, lo que demuestra un aumento de 2,3 y 7 veces para HEWL y Orf11 NTD, respectivamente. Muchos de los cristales de rMMS en presencia de I3C muestran una excelente morfología cristalina(Figura 2).
La siembra permite un control cuidadoso del número de cristal en las pantallas I3C rMMS En experimentos de microsedas, el número de semillas introducidas en un ensayo de cristalización se puede controlar mediante la dilución del stock de semillas y esto permite un control preciso de la nucleación en la gota7,36. Esto a menudo permite que se formen cristales más grandes ya que se reduce la competencia de moléculas de proteína en los sitios de nucleación. Esta ventaja también se extiende al método I3C-rMMS y se ha demostrado con éxito en HEWL y Orf11 NTD. La recreación de una condición de cristalización identificada desde la pantalla I3C-rMMS con un stock de semillas diluida produjo menos cristales pero más grandes(Figura 3).
Sad fasesing se puede utilizar para resolver las estructuras de cristales derivados de la pantalla rMMS I3C Los cristales cultivados con el stock de semillas diluidas que se muestra en la Figura 3 se utilizaron para resolver la estructura de las proteínas utilizando la fase SAD utilizando datos de difracción de un solo cristal (Figura 4). Los datos fueron recogidos en la línea de haz Australian Synchrotron MX162. Los detalles detallados de la recopilación de datos y la solución de estructura se describen en otros lugares27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig01.jpg"> Figura 1 - rMMS se utilizó para generar nuevas condiciones para el crecimiento de cristal en presencia de I3C para dos proteínas de prueba. 96 pantallas de cristalización de difusión de vapor de pozos se llevaron a cabo utilizando pantallas de matriz dispersa comercial. (A) La lysozyme de la clara de huevo de gallina se probó con la pantalla del índice HT. Las bandejas se sembraron con cristales HEWL cultivados en tartrato de amonio de 0,2 M dibásico pH 7,0, 20% (p/v) polietilenglicol 3350. (B) Orf11 NTD de bacteriófago P68 se probó con la pantalla PEG/ION. Las bandejas NTD orf11 se sembraron de cristales de la condición G12 de la pantalla sin sembrar, mostrada en azul. Las condiciones que apoyan el crecimiento del cristal se muestran en rojo. La siembra de rMMS en presencia y ausencia de I3C dio significativamente más impactos de cristal que las bandejas sin semillas. Figura adaptada de Truong et al.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig02.jpg"> Figura 2 - Imágenes representativas de cristales cultivados a partir de los ensayos de difusión de vapor que se muestran en la Figura 1 a) y b). Figura adaptada de Truong et al.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig03.jpg"> Figura 3 - La dilución del stock de semillas es una manera eficaz de reducir la nucleación en una condición de cristalización que se encuentra utilizando el método I3C-rMMS, para controlar el número de cristales que se forman. La reducción de la nucleación dentro de una gota a menudo da como resultado que los cristales crezcan a dimensiones más grandes. Figura adaptada de Truong et al.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig04.jpg"> Figura 4 - Orf11 NTD (PDB ID 6O43) y HEWL (PDB ID 6PBB) se cristalizaron utilizando el método I3C-rMMS y se resolvieron mediante la fase de Auto-Rickshaw SAD. (A) Estructuras de cinta de HEWL y Orf11 NTD resueltos a través de la fase experimental. (B) Molécula I3C enlazada a HEWL y Orf11 NTD. (C) Los átomos de yodo anómalos en I3C están dispuestos en un triángulo equilátero de 6o. Por lo tanto, la presencia de este triángulo en la subestructura de fase indica que hay una molécula de I3C en esa posición. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61984fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Este artículo presenta un método para generar cristales proteicos derivados con I3C (5-amino-2,4,6-ácido triiodoisophtalico) utilizando microsedizaciones para generar nuevas condiciones de cristalización en pantallas de matriz dispersas. Las bandejas se pueden configurar con robots dispensadores de líquidos o a mano.

Derivatización de cristales proteicos con I3C mediante el cribado de matriz de microsemalla aleatoria

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Este es un protocolo de cristalización diseñado para optimizar el crecimiento de un cristal de proteína al mismo tiempo que se deriva la proteína con una molécula de fase para determinar la estructura de una proteína mediante cristalografía de rayos X. Para determinar la estructura de cristal de rayos X de una proteína completamente novedosa, las condiciones de cristalización están optimizadas para producir cristales de calidad. En el caso de una proteína completamente novedosa, los átomos pesados necesitan ser introducidos en el cristal para producir un cristal derivado.Los datos de difracción de rayos X se recopilan del cristal derivado y deben resolverse computacionalmente para producir una estructura de cristal de rayos X. La cristalización y la desrivitización son procesos laboriosos. Para hacer frente a estos cuellos de botella, hemos ideado un procedimiento de cribado optimizado que simultáneamente logra ambos objetivos.Este protocolo utiliza una técnica previamente desarrollada conocida como cribado aleatorio de matriz de microselécticas. Cristales o precipitado cristalino se tritura en microsempresas que se pueden utilizar para iniciar el crecimiento de cristal en condiciones completamente independientes. Al mismo tiempo, introducimos una molécula de fase llamada I3C en la condición de cristalización.Esta molécula proporciona una gran señal anómala que permite que la estructura se resuelva mediante una sola fase de discusión anómala de longitud de onda. Para los usuarios que no están familiarizados con el tamaño experimental de las estructuras de cristal, presentamos una canalización de software fácil de usar para automatizar parcialmente la solución de estructura a medida para utilizar la señal anómala de I3C. El primer paso es crear un stock I3C.Mida 120 miligramos de I3C en un tubo de microcentrífuga. Añadir 200 microlitros de dos molares de hidróxido de litio al tubo de microcentrífuga. Calentar el tubo a 40 a 60 grados y el vórtice se puede utilizar para fomentar la disolución.El stock molar de solución de litio I3C debe ser marrón. Se pueden utilizar dos métodos para introducir I3C en el stock de proteínas. El litio I3C se puede añadir directamente al stock de proteínas.Se pueden añadir 3,75 microlitros a 30 microlitros de I3C a 150 microlitros de proteína para dar una concentración de entre cinco y 14 milimolares. Algunas proteínas pueden precipitarse al contacto con altas concentraciones de I3C. En estos casos, el litio I3C se puede añadir a un tampón de dilución de proteína que es tampón que coincide con la proteína de la muestra a una concentración final entre 10 a 80 mililitros.Añadir 150 microlitros del tampón de dilución de proteínas a 150 microlitros de muestra de proteína. Una sonda de vidrio para aplastar cristales está hecha de una pipeta Pasteur de vidrio. Con un quemador Bunsen en la llama azul, calienta la pipeta Pasteur hacia el medio.Con un par de pinzas, tire de los extremos de la pipeta Pasteur hacia fuera en un diámetro delgado de menos de 0,3 milímetros. Sostenga ese segmento en la llama para separar la pipeta en este punto y alrededor del extremo de la pipeta para terminar la sonda de vidrio. Este es un ejemplo de cómo debe verse la pipeta de vidrio.Los trituradores de cristal también se pueden pedir a proveedores externos como alternativa a hacer que su propia población de microselémiles A se genere triturando cristales de proteína o precipitado cristalino. Coloque cinco tubos de microcentrífuga de 1,5 ml sobre hielo. Bajo un microscopio de luz, seleccione los mejores cristales morfológicos o precipitados cristalinos que se pueden sacrificar.Para 96 bandejas de cristalización de pozos abrir el pozo mediante el corte de la cinta de sellado de plástico. Para las bandejas colgantes, el resbalón de la cubierta se puede quitar con pinzas e invertirse en una superficie plana. Transfiera 70 microlitros de solución de depósito a uno de los tubos de microcentrífuga y escalfa sobre hielo.A los tubos restantes, transfiera 90 microlitros de solución de depósito a él y vuelva al hielo para enfriar. Si el volumen de depósito insuficiente está presente, el depósito de cristalización se puede hacer mezclando los reactivos apropiados y se puede utilizar en su lugar. Agitar los cristales en la gota de cristalización usando la sonda de vidrio aplastarlo a fondo.El progreso se puede monitorear bajo el microscopio hasta que no se puedan ver cristales ni material cristalino. Transfiera todo el líquido de la gota al tubo de microcentrífuga que contiene 70 microlitros de solución de depósito. Mezclar en pipeteando arriba y abajo.Transfiera de dos a tres microlitros de mezcla de vuelta al pozo y enjuague el pozo pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la mezcla de nuevo al tubo de microcentrífuga. Este paso de enjuague debe repetirse una vez más.El tubo de microcentrífuga debe mantenerse frío desde este punto hacia adelante para evitar la fusión de las microsedas. Vórtice el tubo a una velocidad máxima a cuatro grados durante unos tres minutos enfriando el tubo sobre hielo regularmente para evitar el sobrecalentamiento. hacer una de cada 10 diluciones en serie del stock de semillas mediante la transferencia secuencial de 10 microlitros entre las soluciones de depósito refrigerado.Entre las diluciones de stock de semillas, el tubo debe ser vórtice. Las existencias de semillas que no se utilizarán inmediatamente, deben almacenarse en un congelador ultra frío de menos 80 grados. Se puede configurar una pantalla de matriz de microselédigo al azar de 96 años utilizando un robot dispensador de líquidos.Coloque el stock de semillas, la solución de proteína suplementada con I3C y la pantalla de cristalización en el robot. Usando el robot transfiera 75 microlitros de la pantalla de cristalización a la bandeja de 96 pozos. Agregue un microlitro a la gota de cristalización y 74 microlitros al depósito.Transfiera un microlitro de proteína suplementado con I3C a la gota de cristalización. Transfiera 0,1 microlitros de stock de semillas a la caída de cristalización. Selle la placa con cinta adhesiva.Las pantallas colgantes se pueden configurar en 24 bandejas de cristalización de gotas colgantes. Engrase los bordes de los pozos colgantes. Transfiera 500 microlitros de solución de cristalización al depósito.Cerca del centro de una corredera de cubierta de vidrio coloque una gota de microlitrotro de solución de cristalización. A esta gota, añadir un microlitro de proteína suplementado con litio I3C y 0,1 microlitros de stock de semillas. Invierta la corredera de la cubierta y selle bien la cristalización empujando el portaobjetos de la cubierta en la grasa.Las bandejas colgantes de caída y sellado se incuban a una temperatura constante para permitir la formación de cristales. Deben ser inspeccionados regularmente bajo un microscopio para el crecimiento de cristales. Una vez obtenidos, integrados y escalados los datos de difracción como se explica en el protocolo escrito acompañado, la tubería de determinación automatizada de la estructura cristalina Auto-Rickshaw se puede utilizar para resolver el problema de fase y modelar la proteína.En la página de destino de Auto-Rickshaw, haga clic en el botón proceder. Ingrese su correo electrónico institucional en el formulario web de Auto-Rickshaw y haga clic en continuar con la ejecución de Auto-Rickshaw. Para proteínas sin una plantilla de moto homología ejecutar el protocolo SAD de Auto-Rickshaw en modo avanzado.Introduzca los parámetros necesarios. Seleccione la proteína como el tipo de molécula. Introduzca la longitud de onda de recopilación de datos en angstroms.Así como yo como elemento de subestructura para indicar que se utilizaron átomos de yodo. Seleccione el tipo de subestructura I3C para indicar que I3C era la molécula de fase. Seleccione sub_direct como método de determinación de subestructuras.Seleccione tres como el número de subestructuras esperadas por monómero. Introduzca uno como límite de reserva de búsqueda de subestructuras. Esto permite que Auto-Rickshaw determine automáticamente un límite de resolución adecuado.Introduzca el número de residuos en un solo monómero, grupo espacial del conjunto de datos y número de moléculas en la unidad asimétrica en función del coeficiente Matthews. Seleccione el nivel de difusión adecuado de los datos de rayos X que se adapte a sus necesidades. Introduzca los datos anómalos como un archivo de conjunto vacío.Introduzca la secuencia de proteínas como un archivo SEQ, PIR o TXT. Introduzca su dirección de correo electrónico institucional. Los resultados se le entregan a través de un enlace web enviado a la dirección de correo electrónico proporcionada.Si Auto-Rickshaw no resuelve la estructura utilizando su subestructura determinada que valida la subestructura podría ayudar a solucionar la solución de estructura. Descargue la lista de sitios de átomos pesados desde la página de resultados de Auto-Rickshaw. Es un hipervínculo llamado sitios de átomos pesados.Esto descargará un archivo de texto con los sitios de átomos pesados. Cambie la extensión de archivo del archivo de txt a pdb. Abra el archivo pdb en Coot.Active la simetría para ver todos los átomos pesados de las unidades asimétricas vecinas. Mida las distancias entre los átomos pesados, incluso a través de unidades asimétricas. I3C aparecerá como un triángulo equilátero con una longitud lateral de seis angstroms.La presencia de un triángulo con estas dimensiones indica que las ubicaciones de esos átomos pesados son correctas. Si la subestructura de ejecución de Auto-Rickshaw es incorrecta, se pueden probar otras configuraciones de Auto-Rickshaw como se describe en el protocolo escrito. El método I3C RMMS se probó en dos proteínas, la lysozyme de clara de huevo de gallina utilizando la pantalla en HT de Hampton Research y el dominio de la proteína de lisina Orf11 de bacteriófago P68.Se configuraron pantallas completas para cada proteína correspondiente a la pantalla de control sin I3C o microsedas, pantalla con microsema agregó, pantalla con I3C, y finalmente la pantalla con I3C y microsemedor. Añadir I3C a una pantalla de cristal no parece aumentar el número de golpes de cristalización. Con la lysozime de clara de huevo de gallina, el número de condiciones disminuyó de 31 a 26.Con el dominio Orf11 se encontró una sola condición de acierto en la pantalla de control. La adición de I3C a la pantalla también dio un solo golpe en las mismas condiciones. La adición de microsemedros al pozo dio lugar a un aumento significativo en el número de condiciones de impacto, lo que resultó en un aumento de 2,1 y seis veces para la lysozime de clara de huevo de gallina y el dominio Orf11 respectivamente.Este resultado es consistente con otros estudios que prueban RMMS. Lo más importante, la adición de I3C y microsema a una pantalla también aumentó el número de condiciones de impacto en relación con la pantalla de control que demuestra un aumento de 2,3 y siete veces para la lysozyme de clara de huevo de gallina y el dominio Orf11 respectivamente. Esto demuestra que el método I3C RMMS puede producir eficientemente nuevas condiciones para cristales derivados.Los cristales de estas condiciones podrían ser cosechados y utilizados para resolver la estructura cristalina. Tanto la estructura del dominio de la lesozima de la clara de huevo de gallina Orf11 podría resolverse con la fase SAD en el gasoducto Auto-Rickshaw, utilizando la señal anómala de I3C que demuestra la derivitización exitosa por la pantalla I3C RMMS. Hemos presentado un protocolo simple y eficiente para producir cristales de alta calidad derivados con la molécula de fase I3C.Minimiza el número de pantallas y pasos de manejo cristalino, y por lo tanto es de particular interés para los biólogos estructurales que estudian proteínas novedosas. Recomendamos encarecidamente optimizar el tamaño del cristal probando diferentes diluciones de stock de semillas que se hicieron durante la preparación del stock de semillas. Y este paso se completa después de que se hayan realizado las pantallas iniciales.I3C está ampliamente disponible y es barato de comprar y por lo tanto creemos que este método está al alcance de la mayoría de los laboratorios de biología estructural.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcristalografía de Protein Crystals y<em&gt; En Cellulo</em&gt; Difracción

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Investigación

Bioquímica

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Cristales de proteína creciente con distintas dimensiones usando automatizado de cristalización juntada con In Situ dispersión ligera dinámica

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Medición de alta sensibilidad de transcripción DNA Factor obligatorio afinidades por valoración competitiva utilizando microscopía de fluorescencia

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluación de interacciones proteínas-proteínas utilizando una técnica de digestión en la membrana

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Detección de inhibidores de la quinasa en microarrays de proteínas humanas autoensamblados

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Examen cinético de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Creación de sistemas de dimerización de proteínas altamente específicos inducidos químicamente por la selección de fagos escalonados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Examen estratégico y caracterización del complejo de señalización de proteínas Visual GPCR-mini-G para una cristalización exitosa

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimización del crecimiento de cristales de endotiapepsina para experimentos de cristalografía en serie

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Expresión bacteriana y purificación de la metaloproteinasa-3 de matriz humana mediante cromatografía de afinidad

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...