Name: derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening
Uploaded: 2021-01-16T15:00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Bu araştırma, ANSTO'nun bir parçası olan Avustralya Synchrotron'daki MX1 ışın hattında yürütüldü. Yazarlar bu çalışma üzerinde tartışmalar için Shearwin ve Bruning laboratuvarları üyeleri kabul etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca Dr Santosh Panjikar ve Dr Linda Whyatt-Shearwin bu protokol öncülük orijinal çalışma katkıda kabul etmek istiyorum.
Aşağıdaki finansman kabul edilmektedir: Avustralya Araştırma Konseyi (hibe Nos. DP150103009 ve DP160101450 Keith E. Shearwin için); Adelaide Üniversitesi (Avustralya Hükümeti Araştırma Eğitim Programı Jia Quyen Truong ve Stephanie Nguyen için burs).

1. Deneysel planlama ve dikkat edilmesi gerekenler
<ol><li>Tercihen buhar difüzyon kristalizasyonu ile üretilen ilgi proteinin önceden varolan kristalleri kullanın. Buhar difüzyon kristalizasyonu genelleştirilmiş bir protokol için, Benvenuti ve Mangani34bakın. Yağ altında mikrobatch ve serbest arayüz difüzyon gibi kristalizasyon diğer yöntemler mikrotohumlar oluşturmak için kırma önce kristalleri hasat gerektirir.</li>
	<li>Bir tohum stok hazırlanmasında, feda edilebilir en kaliteli kristalleri kullanın. En yüksek kalitede kristal morfolojiye göre görsel olarak değerlendirilebilir veya bu veriler varsa en iyi difatkristalseçilebilir. Tohumlama yoluyla optimizasyon dan sonra daha da kaliteli kristallerin elde olması çok olasıdır. Kristallerin bulunmadığı durumlarda, spherulites ve iğneler gibi kristal çökelti kullanılabilir.</li>
	<li>Tuz kristallerini tanımlayın. Tuz kristalleri kristalleşme ekranlarında büyüyebilir ve protein kristalleri gibi görünebilir. rMMS tuz kristalleri kullanarak hiçbir fayda sağlayacak ve değerli örnek atık, bu nedenle tuz yanlış pozitif ortadan kaldırmak için önemlidir.<ol>
<li>Tuz kristalleri ezildiğinde gürültülü olurlar. Kristaller bir tohum stok oluşturmak için ezilmiş olmalıdır, bu nedenle bu strateji özellikle ilgilidir. Kristalleri ezerken duyulabilir bir çatlak sesi duyulursa, kristalin tuz olması muhtemeldir.</li>
		<li>Protein triptofan ve tirozin kalıntıları içeriyorsa, bu ışık koşullarında floresan protein kristallerini belirlemek için ultraviyole floresan mikroskobu kullanın.</li>
		<li>Protein kristallerini göreceli olarak lekelenmemiş tuz kristallerine ayırmak için izit boya (metilen mavisi) kullanın. Ancak, bu yordam daha yıkıcı ve sadece bir aynı damla çoğaltmaları yedek kristalleri varsa önerilir. NOT: Yukarıda belirtilen testler umut verici sonuçlar verebilse de, tuz kristalleri hala protein kristalleri ile karıştırılabilir. Bu durumda, kırınım deneyleri kesin bir protein ve tuz kristali arasında ayırt etmek için kullanılabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Lityum I3C stokunun hazırlanması
<ol><li>1.5 mL mikrosantrifüj tüp içine I3C (5-amino-2,4,6-triiodoishthalic asit) 120 mg dışarı ölçün.</li>
	<li>I3C'yi 2 M lityum hidroksitin 200 μL'sinde çözün. Çözelti, çözünmeyi teşvik etmek için 40-60 °C'de bir ısı bloğu kullanılarak hafifçe ısıtılabilir. Elde edilen lityum I3C çözeltisi kahverengi olmalı ve 1 M konsantrasyona sahiptir. DİkKAT: Lityum hidroksit aşındırıcıdır. Güvenlik gözlükleri, eldivenler ve laboratuvar önlüğü giyilmelidir.</li>
	<li>Çözeltinin pH'ını ölçün. Gerekirse, pH'ı 7 ile 8 arasında ayarlamak için küçük miktarlarda 1 M hidroklorik asit veya 2 M lityum hidroksit ekleyin. Son çözelti hacmini 400 μL'ye çıkarmak için milliQ su ekleyin. I3C stok çözeltisinin konsantrasyonu 0,5 M'dir. NOT: Adım 2.3 isteğe bağlıdır. Çözeltinin pH'ı herhangi bir pH ayarı öncesinde pH 7-8 arasında olmalıdır. İlgi çeken protein pH'dan güçlü bir şekilde etkileniyorsa bu adım yapılmalıdır. Protokol burada duraklatılmış olabilir. Lityum I3C en az iki hafta boyunca 4 °C'de karanlıkta tutulabilir35.</li>
</ol>3. Protein stoğuna I3C eklenmesi
<ol><li>Yöntem 1<ol>
<li>Hedef proteinin 150 μL aliquot'una stok lityum I3C ekleyin. Son konsantrasyon 5-40 mM lityum I3C arasında olmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yöntem 2 (nazik yöntem)<ol>
<li>Hedef proteinin tamponuyla eşleşen bir protein seyreltme tamponu hazırlayın. Bu seyreltme tamponu için, 10-80 mM arasında lityum I3C konsantrasyonu vermek için stok lityum I3C ekleyin.</li>
		<li>Protein 1:1 protein seyreltme tampon ile lityum I3C son konsantrasyonu vermek için 5-40 mM arasında. NOT: Bazı proteinler yöntem 1'de yüksek yoğunlukta lityum I3C ile temas ettikten sonra çökelecektir, diğer proteinler ise buna tahammül edebilirler. Yöntem 2 yağış olasılığını azaltır. Ancak bu yöntem protein konsantrasyonu yarıya indirir. Kristalizasyon protokolü olmayan proteinler için genellikle ilk kristalizasyon taraması için 10 mg/mL'lik bir protein konsantrasyonu önerilir. I3C'nin 8 proteine ilk molar oranı önerilir. İlk ekrandan sonra I3C'nin protein konsantrasyonu ve molar oranı optimize edilebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Tohum stoku yapma
<ol><li>Kristalleri ezmek için yuvarlak bir sonda yapın.<ol>
<li>Mavi alev üzerinde bir Bunsen brülör ile, ortasına doğru bir Pasteur pipet ısı. Bir cızırtı kullanarak Pasteur pipetinin ucunu çekin ve 0,3 mm'den daha az ince çapa çekin.</li>
		<li>Orta bölüm yeterince ince olduktan sonra, bu noktada pipet ayırmak ve cam sondasını bitirmek için pipetin ucunu yuvarlamak için o segmenti alev içinde tutun. NOT: Yuvarlak prob kristal kırıcılar üçüncü taraf satıcılar tarafından satılmaktadır. Bunlar yuvarlak sondalar yapmak için bir alternatiftir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Buz üzerine beş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü yerleştirin.</li>
	<li>Hafif bir mikroskop altında, mikrokristaller oluşturmak için uygun bir durum için kristalizasyon tepsisi inceleyin. İdeal olarak, iyi morfoloji büyük kristaller seçilir. Ancak, bu teknik aynı zamanda kötü morfoloji kristalleri, iğneler, plakalar, mikrokristaller ve spherülitler ile çalışır.</li>
	<li>Kristalizasyon tepsisini iyice açın. 96 iyi kristalizasyon tepsileri plastik ile mühürlü için, iyi sızdırmazlık plastik kesmek için bir neşter kullanın. Yağ ile mühürlenmiş damla tepsileri asılı için, coverslip cımbız kullanılarak kaldırılabilir ve çift bir yüzeye ters.</li>
	<li>70 μL rezervuar çözeltisini mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde soğutun. Diğer mikrosantrifüj tüpleriçin, 90 μL rezervuar çözeltisi ekleyin ve soğumaya buz geri dönün. NOT: Rezervuar yeterli hacime sahip değilse veya (yağ altında mikrobatch durumunda) yoksa, uygun reaktifleri karıştırarak kristalizasyon rezervuarı oluşturun.</li>
	<li>Iyice ezmek için kristal sonda kullanarak damla kristal ajite. Kristalin tamamen ezilmesi gerekiyor ve bu da mikroskop altında izlenebiliyor.</li>
	<li>Damla tüm sıvı çıkarın ve rezervuar çözeltisi ile mikrocentrifuge tüp aktarın. Karıştırın ve daha sonra mikrocentrifuge tüp karışımı 2 μL almak ve kuyuya geri ekleyin. Çözelti ile iyi durulayın ve mikrocentrifuge tüp aktarın. Bu durulama adımLarını bir kez daha tekrarlayın. Bu noktadan itibaren, karışımdaki mikro tohumların erimesini önlemek için mikrosentrifuge tüpünü soğuk tutun.</li>
	<li>3 dakika boyunca 4 °C'de maksimum hızda tüpü girdap, aşırı ısınmayı önlemek için tüpü buz üzerinde soğutmak için düzenli olarak durun. NOT: Bazı mikrotohumlama protokolleri kristal kırma 7 ,36yardımcı olmak için mikrosantrifüj tüp bir politetrafloroetilen tohum boncuk ekleyin. Biz başarı ile bir tohum boncuk kullanmadan tekniği istihdam var, ama kristalleri ezmek için bir tohum boncuk kullanarak hiçbir sorun görmüyorum.</li>
	<li>Soğutulmuş rezervuar çözeltileri arasında 10°L'yi sırayla aktararak tohum stokunun 1'de 1 oranında seri seyreltilmesini yapın.</li>
	<li>-80 °C'de hemen kullanılmayacak tohum stoklarını saklayın.</li>
</ol>5. RMMS ekranı nın ayarlanması
<ol><li>Sıvı dağıtım robotu kullanarak 96 kuyu tarama plakası kurmak. Bir robot yokluğunda, çok kanallı bir pipet de kullanılabilir.<ol>
<li>Derin bir kuyu bloğundan 96 kuyu kristalizasyon tepsisine 75°L aktarın. Kristalizasyon damlasına 1 0L ve rezervuara 74°L ekleyin.</li>
		<li>Lityum I3C ile desteklenen protein in 1 μL, adım 2 yapılan, kristalizasyon damla.</li>
		<li>0,1 μL'lik tohum stokunu kristalizasyon düşüşüne aktarın.</li>
		<li>Plakayı net sızdırmazlık bandıyla kapatın ve kristal büyümesini sağlamak için plakayı sabit bir sıcaklıkta kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Asılı bırakma ekranları kurma<ol>
<li>Asma damla kuyuların kenarlarını yağlayın (asılı damla kristalizasyon tepsileri 24 ve 48 iyi biçimleri bulunabilir).</li>
		<li>500 μL kristalizasyon çözeltisini rezervuara aktarın.</li>
		<li>Bir cam kapak slayt merkezi yakınında, adım 2 yapılan lityum I3C ile takviye protein 1 μL damla yerleştirin.</li>
		<li>Damlaya kristalizasyon çözeltisinin 1 000'ini ekleyin.</li>
		<li>0,1 μL'lik tohum stokunu kristalizasyon düşüşüne aktarın.</li>
		<li>Kapak kaydırağını ters çevirin ve kapak kaydırağını yağa doğru iterek kristalizasyonu iyice kapatın.</li>
		<li>Kristal büyümesini sağlamak için plakayı sabit bir sıcaklıkta kuluçkaya yatırın. NOT: Yeni ve denenmemiş tohum stokları ile, kristalizasyon isabet alma şansını en üst düzeye çıkarmak için en konsantre tohum stoku kullanılması tavsiye edilir. Sonraki koşullar kristallerin sayısını optimize etmek için azaltılmış tohum konsantrasyonu ile ayarlanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kristal büyüme için düzenli olarak bir mikroskop altında kristal tepsileri inceleyin. Kristaller yeterli kalitedeyse, veri toplama için hasat edilebilirler. Kristaller aynı zamanda yinelemeli optimizasyon için izin vermek için yeni tohum stokları ve yeni rMMS ekranlar oluşturmak için kullanılabilir.</li>
</ol>6. Veri toplama
<ol><li>Kriyoloops kullanarak hasat kristalleri, kriyoprotekt kristalleri korumak ve sıvı nitrojen onları serin flaş. Flaş soğutma kristalleri hakkında daha fazla bilgi için Teng37 ve Garman ve Mitchell38'ebakın.<ol>
<li>Kriyokoruma aşamasında, kristal yeni bir sulu çözeltiden geçirilirse, i3C kriyokoruma çözeltisine girmesi nedeniyle kristalden kaybedilebilir. Bunu azaltmak için kristalizasyon durumuna uyan bir konsantrasyonda kriyokoruma çözeltisinde lityum I3C kullanın.</li>
		<li>Bu protokol kullanılarak yetiştirilen kristaller Parabar 10312 yağ bazlı kriyoprotektif (Hampton Research) kullanılarak başarıyla kriyokorunmuştur. NOT: Kristaller sıvı nitrojende depolanırken protokol burada duraklatılabilir. DİkKAT: Sıvı nitrojen soğuk yanıklara neden olabilir. Sıvı nitrojen de kapalı alanlarda kullanıldığında boğulmaya neden olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kristali X-ışını kaynağıgoniyometreye monte edin ve X-ışını kaynağına özgü protokolü kullanarak kırınım verilerini toplayın.</li>
	<li>Bu teknik, I3C'deki iyot atomlarından gelen anormal sinyale dayanır. Böylece, bu sinyali en üst düzeye çıkarmak için X-ışınının enerjisini seçin.<ol>
<li>Senkrotron X-ışını kaynaklarını mümkün olduğunca düşük ayarlanabilir enerjilere ayarlayın. Birçok makromoleküler kristalografi ışın çizgisi için en düşük yapılandırılabilir enerji 8000 ila 8500 eV'dir.</li>
		<li>Dönen anodu X-ışını kaynakları ayarlanamaz. Bakır ile yaygın olarak kullanılan anod kaynakları 8046 eV,iyot için iyi bir anormal sinyal sağlayan Kα kenarına sahiptir (f" = 6.9 e). Kromlu anod kaynakları 5415 eV'de Kα kenarına sahiptir ve iyot için büyük bir anormal sinyal sağlar (f" = 12.6 e).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Radyasyon hasarı veri toplama sırasında önemli bir sorundur çünkü anormal sinyali39'udüşürecektir. Radyasyon dozunu en aza indirirken en iyi kırınımı elde etmek için ışın maruz kalma süresini ve zayıflatma seçin. NOT: Brom atomları ile değiştirilen iyot atomları ile benzer bir phasing bileşik, radyasyon hasarı karbon brom bağı radyoliziz ve brom atomlarının doluluk bir azalma neden gösterilmiştir24.<ol>
<li>Bir toplama stratejisi olarak ters ışın SAD veri toplama kullanın. Veriler, birbirinden sonra toplanan zıt kamalarla, kamalarda toplanır. Bu, Friedel çiftlerinin eşdeğer bir dozla toplanmasını sağlar ve bu da radyasyon hasarından daha az etkilenen anormal sinyalin daha iyi ölçülmesiyle sonuçlanır. Örneğin, 360° toplamak için sekiz kama stratejisi, kama 1 (0°-45°), kama 2 (180°-225°), kama 3 (46°-90°), kama 4 (225°°) sırasına göre veri toplamayı içerir.-270°), kama 5 (90°-135°), kama 6 (270°-315°), kama 7 (135°-180°) ve kama 8 (315°-360°). NOT: Sürekli döndürme ters ışın veri toplama alternatif bir toplama stratejisidir. Toplama stratejilerinin yeni bir karşılaştırması için Garcie-Bonte & Katona40'abakınız.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Veri işleme ve yapı çözümü
<ol><li>Anormal sinyali en üst düzeye çıkarmak amacıyla XDS41kullanarak kırınım verilerinde veri azaltma gerçekleştirin. Veri azaltma giriş parametreleri veri kümesine özgüdir ve bazı deneme yanılma ları gerektirebilir. Başlamak için bazı öneriler aşağıda veda edebilirsiniz.<ol>
<li>FRIEDEL HUKUK =FALSE ayarlayın. STRICT_ABSORPTION_CORRECT = DOĞRU ve STRICT_ABSORPTION_CORRECT = FALSE' u ayarlayarak CORRECT'u iki kez uygulayın. Bir koşuda diğerinden daha yüksek anormal sinyal olabilir. Çıkıştaki 'Anomal Corr' ve 'SigAno' disiplinlerini kullanarak koşular arasındaki anormal sinyalleri karşılaştırın. Bu, veri kalitesinin bir göstergesidir.</li>
		<li>XDS_ASCII SHELXC çalıştırın. Anormal sinyalin daha doğru bir göstergesi için HKL dosyası. 'Ranom' disiplini farklı çözünürlüklerde anormal sinyalin bir göstergesi olacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>Verileri ölçeklendirmek için POINTLESS42 ve AIMLESS43'u çalıştırın. AIMLESS'da anomalous ON parametresini ayarlayın. GUI kullanılırsa, aykırı reddedilme ve birleştirme istatistikleri için ayrı anormal çiftleriseçeneğini seçin. Anormal sinyali en üst düzeye çıkarmak için farklı çözünürlük kesiklerinin test edilmesi gerekebilir.</li>
	<li>Auto-Rickshaw otomatik kristal yapısı belirleme boru hattı44kullanarak protein yapısını çözün. Auto-Rickshaw faz sorunu çözmek ve protein modelleme ve arıtma yazılımı ile otomatik olarak protein kristal yapısını oluşturmak için çalışacağız.<ol>
<li>Homoloji modeli şablonu olmayan proteinler için Gelişmiş Mod'da Auto-Rickshaw'Un SAD protokolünü çalıştırın. Gerekli parametreleri girin.<ol>
<li>Molekül türü olarak PROTEIN'i seçin.</li>
			<li>Angstroms (Å) veri toplama dalga boyu girin.</li>
			<li>İyot atomlarının kullanıldığını belirtmek için alt yapı elemanı olarak "I" seçeneğini belirleyin.</li>
			<li>I3C'nin phasing molekülü olduğunu belirtmek için alt yapı türü olarak "i3c"yi seçin.</li>
			<li>Alt yapı belirleme yöntemi olarak "sub_direct" seçeneğini belirleyin. Bu yöntem, alt yapıyı aramak için SHELXD32 kullanır.</li>
			<li>Monomer başına beklenen alt yapı sayısı olarak "3"ü seçin.</li>
			<li>Alt yapı aramasının çözünürlük kesimi olarak "1" girin. Bu, Otomatik Çekçek'in uygun çözünürlük kesimini otomatik olarak belirlemesine olanak tanır.</li>
			<li>Matthews katsayısına göre tek bir monomer, veri kümesinin uzay grubundaki kalıntı sayısını ve asimetrik birimdeki molekül sayısını girin.</li>
			<li>İhtiyaçları karşılayan x-ışını verilerinin uygun yayma düzeyini seçin. "AutoRickshaw geliştiricileri" seçilmesi, Auto-Rickshaw geliştiricilerinin sorunlar ortaya çıkarsa sorunu gidermelerine olanak tanır.</li>
			<li>Anormal verileri mtz dosyası olarak girdi.</li>
			<li>Protein dizisini seq, pir veya txt dosyası olarak girin. Bir seq dosyası bir metin düzenleyicisinde oluşturulabilir (Windows'ta Notepad++9 veya Linux'ta nano gibi). Yeni bir dosya oluşturun, proteinin birincil sırasını uzun bir satır olarak girin veya satır sonları ile ayırın. .seq dosya uzantısı ile dosyayı kaydedin.</li>
			<li>Kurumsal bir e-posta adresi girin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Sonuçlar, sağlanan e-posta adresine gönderilen bir web bağlantısı aracılığıyla teslim edilir. NOT: AutoRickshaw bir X-ışını kristal yapısı 32 çözmek için çeşitli kristalografi yazılım paketleri çağırır otomatik bir boru hattı32,33,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58. Otomatik Çekçek çalıştırılan çalıştırış yapıyı çözemezse, diğer Otomatik Çekçek ayarları sınanabilir. Yapı belirleme yöntemi SHELXD32yerine Phaser59 kullanmak için "sub_phassade" olarak değiştirilebilir. Monomer başına beklenen alt yapı sayısı da artırılabilir veya azaltılabilir.</li>
	<li>Kristal yapının deneysel phasing sırasında, Auto-Rickshaw birim hücre içinde ağır atomlar konumlandırmak için çalışacağız, bir alt yapı oluşturma. I3C'deki iyot atomlarının eşkenar üçgen düzenlemesi alt yapıyı doğrulamanın etkili bir yolunu sunar. Adım 6.3 başarısız olursa, alt yapının doğrulanması sorun giderme yapısı çözümüne yardımcı olabilir.<ol>
<li>Ağır atom sitelerinin listesini Auto-Rickshaw sonuçları sayfasından indirin. "Ağır atom bölgeleri" adı verilen bir köprüdür. Bu ağır atom siteleri ile bir metin dosyası indirecektir.</li>
		<li>Dosyanın dosya uzantısını .txt'dan .pdb'a değiştirin.</li>
		<li>PDB dosyasını Coot60'daaçın. Komşu asimetrik birimlerden diğer ağır atomları görmek için simetriyi açın.</li>
		<li>Asimetrik birimler arasında da dahil olmak üzere ağır atomlar arasındaki mesafeleri ölçün. I3C 6 angstroms bir yan uzunluğu ile eşkenar üçgen olarak görünür. Bu boyutlara sahip bir üçgenin varlığı, bu ağır atomların yerleşimlerinin doğru olduğunu gösterir.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Moleküler replasman için uygun bir homoloji modeli nin yokluğunda yeni bir proteinin yapı tayini deneysel fazing gerektirir. Bu yöntemler, protein kristaline ağır atomların dahil edilmesini gerektirir ve bu da yapı belirleme boru hattına bir karmaşıklık düzeyi ekler ve ele alınması gereken çok sayıda engeli ortaya atabilir. Ağır atomlar selenomethionine ve selennosistein kullanılarak etiketli ifade yoluyla doğrudan proteiniçine dahil edilebilir. Bu yöntem pahalı, zahmetli ve daha düşük protein verimlerine neden olabileceğinden, etiketli protein genellikle kristalizasyon koşulları bulunduktan ve etiketlenmemiş proteinle optimize edildikten sonra ifade edilir. Alternatif olarak, kristaller ağır atomlar22,63,64içeren bir çözelti içinde ıslatma tarafından türevolabilir. Bu yöntem genellikle yüksek kaliteli kristaller kullanır ve bu nedenle sağlam bir kristalizasyon yöntemi zaten geliştirilmiştir sonra gerçekleştirilir. Bu yöntemi kullanarak türetiye edilmiş bir kristalin başarıyla elde edilmesi, ıslatma prosedürlerinin daha fazla optimizasyonu ve farklı kademeli bileşiklerin taranmasını gerektirir, bu nedenle zaten zahmetli bir sürece daha fazla zaman katmak.
Proteinin ağır atomla birlikte kristalizasyonu tarama aşamasında gerçekleştirilebilir, böylece süreci verimli bir şekilde düzene sokabilir ve hasara yol açabilecek kristal manipülasyon adımlarını azaltır. Ancak, hala birkaç ilk kristalizasyon isabet ve uyumlu bir ağır atom bileşik seçme sorunu elde potansiyel senaryo var. Birçok şu anda mevcut phasing bileşikleri genellikle kristalizasyon koşullarında bulunan çökeltme, tamponlar ve katkı maddeleri ile uyumsuzdur. Onlar sülfat ve fosfat tamponlar çözünmez olabilir, sitrat ve asetat için chelate, HEPES ve Tris tamponlar ile olumsuz tepki veya DTT ve β-mercaptoetanol tarafından tecrit olmak21. I3C phasing bileşik bu uyumsuzluklar muzdarip değildir gibi, birçok farklı koşullara uygun olabilir sağlam bir phasing bileşiktir.
Bu çalışmada, I3C phasing bileşik ve rMMS eşzamanlı co-kristalizasyon yoluyla SAD phasing için hazır türevi kristaller üreten aerodinamik bir yöntem sunulmuştur. Her iki tekniğin kombinasyonu kristalizasyon isabet sayısını artırır, koşulların çoğu morfoloji ve kırınım özellikleri geliştirilmiş olan. Hem Orf11 NTD hem de HEWL test olgularında, I3C-rMMS ekranında I3C olmadığında bulunmayan yeni koşullar saptandı. Potansiyel olarak, I3C proteine olumlu bağlanabilir, kristal kontaklar oluşumunu ve stabilizasyonunu kolaylaştırarak27. Buna karşılık, bu kristalizasyon neden olabilir ve muhtemelen kırınım özelliklerini geliştirmek. Seyrek matris ekranları ile uyumlu bir bileşik olmasının yanı sıra, I3C aynı zamanda içsel özellikleri nedeniyle çekici bir phasing bileşiktir. Aromatik halka iskeleüzerinde iyot ile dönüşümlü fonksiyonel gruplar proteinlere özel bağlama sağlar. Bu daha fazla doluluk yol açar ve potansiyel arka plan sinyaliazaltır 23. Ayrıca, eşkenar üçgende anormal dağılımların düzenlenmesi alt yapıda belirgindir ve I3C 'nin(Şekil 4B ve 4C)bağlanmasını hızla doğrulamak için kullanılabilir. Son olarak, tunable senkrotron radyasyonu yanı sıra krom ve bakır dönen anot X-ışını kaynakları ile anormal bir sinyal üretebilir. Böylece, birçok farklı iş akışları uygulanabilir. I3C yaygın olarak kullanılabilir ve satın almak için ucuz olduğundan, bu yaklaşım en yapısal biyoloji laboratuvarları için ulaşılabilecek bir yaklaşımdır.
I3C-rMMS yöntemini kullanırken ele alınması gereken birkaç deneysel husus vardır. Proteinin ilk kristal materyali elde edilemiyorsa bu yöntem uygulanamaz. Zor durumlarda, homolog bir proteinden elde edilen kristal malzeme tohum stoku oluşturmak için de kullanılabilir. rMMS bu çapraz tohumlama yaklaşım bazı umut verici sonuçlargöstermiştir 7. Tohum stokunun seyreltilmesi yoluyla kristal sayısının optimize edilmesi, yüksek kaliteli büyük kristaller üretme ve uygun kırınım verileri elde etme şansını en üst düzeye çıkarmak için göz ardı edilmemesi gereken önemli bir adımdır. Asimetrik birimde tanımlanan az sayıda I3C alanı varsa, kristalleşmeye elverişli koşullar daha fazla I3C konsantrasyonu ile optimize edilmelidir. Bu anormal sinyal ve yardım kristal türevi maksimize etmek için I3C doluluk artırabilir.
Bu tekniğin protein kristallerini türemiş olmak için en uygun yöntem olmadığı durumlar olabilir. Bir protein veya protein kompleksi boyutu arttıkça, protein yüzeyindeki sınırlı sayıdaki I3C bölgesi yapıyı çözmek için yeterli phasing gücü sağlamayabilir. Protein boyutunun phasing'i engellediğinden şüphelenilen bu senaryolarda, proteinin selenometiyonin etiketlemesi proteinin phasing için daha uygun bir yaklaşım olabilir. Protein proteinde yeterli sayıda metiyonin kalıntısı varsa (100 kalıntıbaşına en az bir metiyonin olması önerilir65)ve yüksek verimli selenomethionine bir proteine dahil edilebilir (bakteriyel ekspresyon sistemlerinde olduğu gibi66),kristallerde yapıyı faza uygun çoklu yüksek doluluk selenyum atomları bulunacaktır.
Buna ek olarak, bazı proteinler doğal olarak I3C ile türeviçin uygun olmayabilir. Proteinler üzerindeki I3C bağlanma bölgeleri protein yapısına bağlıdır. Doğal olarak I3C bağlanması ile uyumlu az sayıda maruz kalan yamalar var proteinler olabilir. Bu nedenle, Bazı hedef proteinlerin I3C ile birlikte kristalize edilmesinde güçlükler olabileceği öngörülemez değildir.

Yapısal biyoloji alanında X-ışını kristalografisi makromoleküllerin atomik çözünürlük yapılarını belirlemek için altın standart teknik olarak kabul edilir. Bu hastalıkların moleküler temelini anlamak için yoğun olarak kullanılmıştır, rasyonel ilaç tasarım projeleri kılavuzu ve enzimlerin katalitik mekanizması açıklamak1,2. Yapısal veriler bilgi zenginliği sağlasa da, protein ekspresyonu ve arınma, kristalizasyon ve yapı belirleme süreci son derece zahmetli olabilir. Bu projelerin ilerlemesini engelleyen çeşitli darboğazlarla karşılaşılır ve kristal yapı belirleme boru hattını verimli bir şekilde düzene sokmak için bu konu ele alınmalıdır.
Rekombinant ekspresyon ve arınma sonrasında, genellikle X-ışını kristalografisinin çetin ve zaman alıcı bir yönü olan kristalizasyona yardımcı olan ön koşullar tanımlanmalıdır. Bilinen ve yayınlanmış koşulları pekiştiren ticari seyrek matris ekranlar bu darboğaz3,4hafifletmek için geliştirilmiştir. Ancak, son derece saf ve konsantre protein örnekleri kullanarak rağmen bu ilk ekranlardan birkaç isabet oluşturmak için yaygındır. Net damlaları gözlemlemek, proteinin bir kristali çekirdeklendirmek için gerekli süper doygunluk seviyelerine ulaşamadığını gösterir. Kristal çekirdekleşme ve büyümeyi teşvik etmek için, önceden varolan kristallerden üretilen tohumlar koşullara eklenebilir ve bu da kristalizasyon alanının daha fazla örneklenmesine olanak sağlar. Ireton ve Stoddard ilk mikrotohum matris tarama yöntemi5tanıttı. Düşük kaliteli kristaller bir tohum stok yapmak için ezilmiş ve daha sonra aksi takdirde oluşmuş olmazdı yeni kırınım kalitesinde kristaller üretmek için farklı tuzlar içeren kristalizasyon koşullarına sistematik olarak eklendi. Bu teknik daha da d'Arcy ve ark. olan tohumlar yedek matris kristalizasyon ekranı6,7içine tanıtıldı rasgele mikrotohum matris tarama (rMMS) geliştirdi tarafından geliştirilmiştir. Bu kristallerin kalitesini artırdı ve 7 faktörü ile ortalama kristalizasyon isabet sayısını artırdı.
Kristaller başarıyla üretildikten ve X-ışını kırınım deseni elde edildikten sonra ,'faz probleminin' çözümü şeklinde başka bir darboğazla karşılaşılır. Veri toplama işlemi sırasında kırınım yoğunluğu (genlik karesi ile orantılı) kaydedilir ancak faz bilgileri kaybolur, bu da hemen yapı kararlılığını durduran faz sorununa yol açar8. Eğer hedef protein daha önce belirlenmiş bir yapıya sahip bir proteine yüksek sıralı kimliği paylaşıyorsa, moleküler replasman faz bilgilerini tahmin etmek için kullanılabilir9,10,11,12. Bu yöntem hızlı ve ucuz olmasına rağmen, model yapıları mevcut veya uygun olmayabilir. Homoloji modeli tabanlı moleküler replasman yönteminin başarısı, dizi kimliği %35'in altına düştüğünden önemli ölçüdedüşetmektedir. Uygun bir homoloji modelinin yokluğunda ARCIMBOLDO14,15 ve AMPLE16gibi ab initio yöntemleri test edilebilir. Bu yöntemler, moleküler değiştirme için başlangıç noktası olarak hesaplamalı olarak tahmin edilmiş modelleri veya parçaları kullanır. Öngörülen yem modellerini başlangıç noktası olarak kullanan AMPLE, ağırlıklı olarak β yaprak içeren büyük (>100 kalıntı) protein ve proteinlerin yapılarını çözmeye çalışmaz. Arcimboldo, daha büyük bir yapıya genişletmek için küçük parçaları sığdırmaya çalışır, yüksek çözünürlüklü veri (≤2 Å) ve algoritmayeteneği tam bir yapıya parçaları genişletmek için sınırlıdır.
Moleküler değiştirme yöntemleri başarısız olursa, izomorf replasman17,18 ve tek bir dalga boyunda (SAD19)veya birden fazla dalga boyunda (MAD20)anormal dağılım gibi doğrudan yöntemler kullanılmalıdır. Bu genellikle kristal oluşmalıdır veya ağır bir atom ile türev olmalıdır gerçekten yeni yapılar için durumdur. Bu, ağır bir atom bileşiği, kimyasal modifikasyon (RNA'da 5-bromouracil birleşme gibi) veya etiketli protein ekspresyonu (birincil yapıya selnometyonin veya selennosistein amino asitleri dahil etmek gibi)21,22ile ıslatma veya birlikte kristalize edilerek elde edilebilir. Bu daha da kristalizasyon sürecini zorlaştırır ve ek tarama ve optimizasyon gerektirir.
I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisofhthalic asit) ve B3C (5-amino-2,4,6-tribromoishttalc asit) dahil olmak üzere phasing bileşikleri, yeni bir sınıf, önceden varolan phasing bileşikleri üzerinde heyecan verici avantajlar sunuyoruz23,24,25. Hem I3C hem de B3C, doğrudan aşamalı yöntemler ve özellikle proteinle etkileşim edebilen ve bağlayıcı alan özgüllüğü sağlayan amino veya karboksilat fonksiyonel grupları için gerekli anormal dağılımların alternatif düzenlemesine sahip aromatik bir halka iskeleye sahiptir. Ağır metal gruplarının sonraki eşkenar üçgen düzenlemesi, phasing alt yapısının basitleştirilmiş doğrulanmasına olanak sağlar. Yazının yazıldığı sırada Protein Veri Bankası'nda (PDB) 26 Adet I3C'ye bağlı yapı bulunmaktadır ve bunların 20'si SAD phasing26kullanılarak çözülmüştür.
Bu protokol, ağır metal türevileştirme ve rMMS tarama yöntemlerini birleştirerek kristalizasyon isabetsayısını aynı anda artırmak ve kristal türevleştirme işlemini basitleştirmek için yapı belirleme boru hattının etkinliğini artırır. Biz bu yöntem son derece tavuk yumurtası beyaz lysozyme ve bakteriyofaj P6827bir roman lysin protein etki alanı ile etkili olduğunu gösterdi. Yüksek otomasyonlu Auto-Rickshaw yapı belirleme boru hattı kullanılarak yapı çözümü, özellikle I3C phasing bileşik için özel olarak tanımlanmıştır. AutoSol28,ELVES29 ve CRANK230gibi kullanılabilecek diğer otomatik boru hatları vardır. SHELXC/D/E gibi tam otomatik olmayan paketler dekullanılabilir 31,32,33. Bu yöntem özellikle PDB'de homolog modelleri olmayan proteinleri inceleyen araştırmacılar için tarama ve optimizasyon adımlarının sayısını önemli ölçüde azaltarak yararlıdır. Bu yöntemin ön koşulu protein kristalleri veya önceki kristalizasyon çalışmalarından elde edilen hedef proteinin kristalin çökeltisidir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL disposable luer lock syringes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>T3SS10LAT</td>
			<td>Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Used for hanging drop crystal tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-506</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22178</td>
			<td>Commonly referred to as I3C in the article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-297</td>
			<td>For 96 well crystallization screens set up by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18X18-2</td>
			<td>Coverslips for hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning vacuum grease</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-510</td>
			<td>Used for sealing hanging drop crystal tray wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Pipette 0.1 &#956;L-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 2 &#956;L-20 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1153247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipette 20 &#956;L-200 &#956;L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>1152006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>HIR92601.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Approximately 95% pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IndexHT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope illuminator</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>FT192/230</td>
			<td>Light source to illuminate crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/ION HT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix Liquid Dispenser</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel with scalpel blade no. 15</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>LV-SMSCPO15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope&#160;</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>EMZ-5TR</td>
			<td>Microscope for visualising crystallography experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Adelab Scientific</td>
			<td>RAVM1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivatization of protein crystals with i3c using random microseed matrix screening

X-ışını kristalografisi kullanılarak protein yapısı açıklaması hem yüksek kaliteli difüzör kristalleri hem de kırınım fazı probleminin hesaplamalı çözeltisini gerektirir. Uygun homoloji modeliolmayan yeni yapılar genellikle deneysel faz bilgisi sağlamak için ağır atomlarla türemiştir. Sunulan protokol, rasgele mikrotohumlama matris taramasını ağır bir atom molekülü Olan I3C (5-amino-2,4,6-triiodoishththalic asit) ile türevleştirme ile birleştirerek türevleştirilmiş protein kristalleri üretir. I3C'yi kristal kafese dahil ederek, kırınım fazı problemi tek dalga boyu anormal dağılım (SAD) aşamalı olarak etkin bir şekilde çözülebilir. I3C'deki iyot atomlarının eşkenar üçgen düzenlemesi doğru anormal alt yapının hızlı bir şekilde doğrulanmasını sağlar. Bu protokol, deneysel phasing ilgi ile kristalografi tabanlı teknikler kullanarak makromoleküler yapıları çözmek yapısal biyologlar için yararlı olacaktır.

I3C'nin rMMS'ye dahil edilmesi, türev kristal büyümesini destekleyen yeni koşullar oluşturabilir Eşzamanlı rMMS taraması ve I3C türevizasyonunun etkinliği iki proteinde gösterilmiştir: tavuk yumurtası akı lysozyme (HEWL, lyophilized toz olarak elde edilir) ve bakteriyofaj P68'den putatif Orf11 lysin N-terminal etki alanı (Orf11 NTD). Her protein PEG/ION HT'ye karşı dört farklı koşulda tarandı: tohumsuz, tohumsuz, I3C ile tohumsuz ve I3C ile tohumlu(Şekil 1). Her iki protein için de, I3C'nin tek eklenmesi kristalleşmeye elverişli koşulların sayısını artırmadı. Orf11 NTD durumunda, I3C(Şekil 1B)ile ve olmadan sadece bir uygun koşul tanımlanmıştı. I3C HEWL ekranlarına eklendiğinde, isabet sayısı 31'den 26'ya düşürüldü ve çarpma bileşiklerini tanıtırken kristalleşmenin karmaşıklığı vurgulandı(Şekil 1A). Diğer çalışmalarile tutarlı, bir rMMS ekran oluşturmak için ticari seyrek matris ekranlara tohum ekleyerek önemli ölçüde her iki protein için olası kristalizasyon koşullarının sayısını artırdı, HEWL ve Orf11 NTD için 2.1 ve 6 kat artış ile sonuçlanan, sırasıyla6,61 (Şekil 1). En önemlisi, I3C ve tohum eşzamanlı eklenmesi, sırasıyla HEWL ve Orf11 NTD için 2,3 ve 7 kat artış gösteren, tohumsuz bir ekrana göre isabet sayısını artırdı. I3C varlığında rMMS kristallerin çoğu mükemmel kristal morfolojisi göstermektedir(Şekil 2).
Tohumlama, I3C rMMS ekranlarda kristal sayısının dikkatli bir şekilde kontrol altına alınır Mikro tohumlama deneylerinde, bir kristalizasyon deneme içine tanıtılan tohum sayısı tohum stok seyreltme ile kontrol edilebilir ve bu damla çekirdeklenme hassas kontrol sağlar7,36. Çekirdekleşme bölgelerinde protein moleküllerinin rekabeti azaldığı için bu genellikle daha büyük kristallerin oluşmasını sağlar. Bu avantaj aynı zamanda I3C-rMMS yöntemine de uzanır ve hem HEWL hem de Orf11 NTD'de başarıyla gösterilmiştir. Seyreltilmiş tohum stoku ile I3C-rMMS ekranından tanımlanan bir kristalizasyon durumunun rekreasyonu daha az ama daha büyük kristaller ortaya çıkarmaktadır(Şekil 3).
SAD phasing rMMS I3C ekranından elde edilen kristallerden yapıları çözmek için kullanılabilir Şekil 3'te gösterilen seyreltilmiş tohum stoğu kullanılarak yetiştirilen kristaller, tek bir kristalden gelen kırınım verileri kullanılarak SAD emzitleme kullanılarak proteinlerin yapısını çözmek için kullanılmıştır(Şekil 4). Veriler Avustralya Synchrotron MX1 Beamline62toplandı. Ayrıntılı veri toplama ve yapı çözüm detayları başka bir yerde27açıklanmıştır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig01.jpg"> Şekil 1 - rMMS iki test proteinleri için I3C varlığında kristal büyümesi için yeni koşullar oluşturmak için kullanılmıştır. 96 kuyu buharı difüzyon kristalizasyon ekranı ticari seyrek matris ekranlar kullanılarak yapılmıştır. (A) Tavuk yumurtası beyaz lysozyme Index HT ekranı ile test edildi. Tepsiler 0.2 M amonyum tartarat dibasic pH 7.0, %20 (w/v) polietilen glikol 3350'de yetiştirilen HEWL kristalleri ile tohumlandı. (B) P68 bakteriyofajından Orf11 NTD PEG/ION ekranı ile test edildi. Orf11 NTD tepsiler, mavi renkte gösterilen tohumsuz ekrandan G12 koşulundan kristallerden tohumlandı. Kristal büyümesini destekleyen koşullar kırmızı renkte gösterilir. I3C varlığı ve yokluğunda rMMS tohumlama hem de tohumsuz tepsiler daha önemli ölçüde daha fazla kristal isabet verdi. Şekil Truong ve ark.27uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig02.jpg"> Şekil 2 - Şekil 1 (a) ve (b)'de gösterilen buhar difüzyon denemelerinden elde edilen kristallerin temsili görüntüleri. Şekil Truong ve ark.27uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig03.jpg"> Şekil 3 - Tohum stokunun seyreltilmesi, i3C-rMMS yöntemi kullanılarak bulunan kristalizasyon durumunda çekirdekleşmeyi azaltmanın etkili bir yoludur. Bir damla içinde çekirdekleşmeyi azaltmak genellikle kristallerin daha büyük boyutlara doğru büyümesine neden olabilir. Şekil Truong ve ark.27uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig04.jpg"> Şekil 4 - Orf11 NTD (PDB ID 6O43) ve HEWL (PDB ID 6PBB) I3C-rMMS yöntemi kullanılarak kristalize edildi ve Auto-Rickshaw SAD phasing kullanılarak çözüldü. (A) HEWL ve Orf11 NTD'nin şerit yapıları deneysel phasing ile çözülür. (B) I3C molekülü HEWL ve Orf11 NTD'ye bağlıdır. (C) I3C'deki anormal iyot atomları 6 Å'lık eşkenar üçgen de düzenlenir. Bu nedenle bu üçgenin phasing alt yapısındaki varlığı bu konumda bir I3C molekülü olduğunu gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61984fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Bu makalede, seyrek matris ekranlarda yeni kristalleşme koşulları oluşturmak için mikrotohumlama kullanarak I3C (5-amino-2,4,6-triiodoishthalic asit) ile türemiş protein kristalleri oluşturmak için bir yöntem sunar. Tepsiler sıvı dağıtım robotları kullanılarak veya elle kurulabilir.

Rastgele Mikrotohum Matris Taraması Ile Protein Kristallerinin I3C ile Türevleştirilmesi

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Bu, bir protein kristalinin büyümesini optimize etmek için tasarlanmış bir kristalizasyon protokolüdür ve aynı zamanda proteini bir phasing molekülü ile türeterek x-ışını kristalografisi ile bir proteinin yapısını belirler. Tamamen yeni bir proteinin x-ışını kristal yapısını belirlemek için, kristalizasyon koşulları kaliteli kristaller üretmek için optimize edilebiyir. Tamamen yeni bir protein söz konusu olduğunda, türev leştirilmiş bir kristal üretmek için ağır atomların kristalin içine sokulması gerekir.X-ışını kırınım verileri türemiş kristalden toplanır ve x-ışını kristal yapısı oluşturmak için hesaplamalı olarak çözülmesi gerekir. Kristalizasyon ve türetme hem zahmetli süreçlerdir. Bu darboğazları gidermek için, aynı anda bu hedeflerin her ikisine de ulaşabilen optimize edilmiş bir tarama prosedürü tasarladık.Bu protokol, rastgele mikrotohum matris taraması olarak bilinen daha önce geliştirilmiş bir teknik kullanır. Kristaller veya kristal çökelti tamamen bağımsız koşullarda kristal büyümesini başlatmak için kullanılabilir mikrotohumlar içine ezilir. Aynı zamanda, kristalizasyon durumuna I3C adı verilen bir phasing molekülü sıyoruz.Bu molekül, yapının tek bir dalga boyu anormal tartışma phasing tarafından çözülmesini sağlayan büyük bir anormal sinyal sağlar. Kristal yapıların deneysel boyutlandırmasına aşina olmayan kullanıcılar için, I3C'den gelen anormal sinyali kullanacak şekilde uyarlayan yapı çözümünün kısmen otomatikleştirilmesi için kullanıcı dostu bir yazılım hattı saiyoruz. İlk adım bir I3C stok oluşturmaktır.Mikrosantrifüj tüpüne 120 miligram I3C ölçün. Mikrosantrifüj tüpüne 200 mikrolitre iki molar lityum hidroksit ekleyin. Tüpün 40 ila 60 derecede ısıtılması ve girdapların çözülmesiteşvik edilmesi için kullanılabilir.Lityum I3C çözeltisinin tek azı lı stoku kahverengi olmalıdır. Protein stoğuna I3C'yi tanıtmak için iki yöntem kullanılabilir. Lityum I3C doğrudan protein stoğuna eklenebilir.I3C 30 mikrolitre 3.75 mikrolitre protein 150 mikrolitre beş ve 14 milimolar arasında bir konsantrasyon vermek için eklenebilir. Bazı proteinler I3C yüksek konsantrasyonlarda temas üzerine çökelti olabilir. Bu durumlarda, lityum I3C tampon 10 ila 80 milimolar arasında son konsantrasyon için örnek protein eşleşen bir protein seyreltme tampon eklenebilir.Protein numunesi 150 mikrolitre protein seyreltme tampon 150 mikrolitre ekleyin. Kristalleri ezmek için bir cam sonda bir cam Pasteur pipet yapılır. Mavi alev üzerinde bir Bunsen brülör ile, ortasına doğru Pasteur pipet ısı.Bir çift cımbız kullanarak Pasteur pipetinin uçlarını 0,3 milimetreden daha az ince çapa çekin. Bu noktada pipet ayırmak ve cam sondabitirmek için pipet ucunu yuvarlak alev bu segment tutun. Bu cam pipet nasıl görünmesi gerektiğini bir örnektir.Kristal ezilmeler de kendi bir mikrotohum stok yapmak için bir alternatif olarak üçüncü taraf satıcılardan sipariş edilebilir protein kristalleri veya kristal çökelti kadar ezerek oluşturulur. Buz üzerine beş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü yerleştirin. Bir ışık mikroskobu altında, feda edilebilir en iyi morfoloji kristalleri veya kristal çökelti seçin.96 iyi kristalizasyon tepsileri için plastik sızdırmazlık bandı keserek kuyuyu açın. Damla tepsileri asılı için, kapak kayma cımbız kullanılarak kaldırılabilir ve düz bir yüzeye ters. 70 mikrolitre rezervuar çözeltisini mikrosantrifüj tüplerinden birine aktarın ve buz üzerinde soğutun.Kalan tüpleriçin, ona rezervuar çözeltisi 90 mikrolitre aktarın ve soğumaya buz dönmek. Yeterli rezervuar hacmi mevcutsa kristalizasyon haznesi uygun reaktifler karıştırılarak yapılabilir ve bunun yerine kullanılabilir. Cam sondası kullanarak kristalizasyon damla kristalleri çalkalayın iyice ezmek.Kristal veya kristal malzeme görünmeden ilerleme mikroskop altında izlenebilir. 70 mikrolitre rezervuar çözeltisi içeren mikrosantrifüj tüpüne sıvının tümünü damladan aktarın. Yukarı ve aşağı boru lar karıştırarak karıştırın.2-3 mikrolitre karışımı kuyuya geri aktarın ve yukarı ve aşağı boru lar ekleyerek kuyuyu durulayın. Karışımı mikrosentrifüge tüpüne geri aktarın. Bu durulama adımı bir kez daha tekrarlanmalıdır.Mikrosentrifuge tüp mikrotohumları erime önlemek için bu noktadan ileri soğuk tutulmalıdır. Aşırı ısınmayı önlemek için tüpü düzenli olarak buz üzerinde soğutma yaklaşık üç dakika boyunca dört derece maksimum hızda tüp girdap. soğutulmuş rezervuar çözeltileri arasında 10 mikrolitre sırayla aktararak tohum stokunun 10 seri seyreltmebiri olun.Tohum stok seyreltmeleri arasında tüp girdap olmalıdır. Hemen kullanılmayacak tohum stokları, eksi 80 derece ultra soğuk dondurucuda saklanmalıdır. Bir 96 iyi rasgele mikrotohum matris ekran bir sıvı dağıtım robotu kullanılarak kurulabilir.Robota tohum stoğunu, I3C ve kristalizasyon ekranı ile takviye edilmiş protein stok çözeltisini yerleştirin. Robot kullanarak kristalizasyon ekranından 96 kuyu tepsisine 75 mikrolitre aktarın. Kristalizasyon damla bir mikrolitre ve rezervuar için 74 mikrolitre ekleyin.I3C ile desteklenen bir mikrolitre proteini kristalizasyon damlasına aktarın. 0,1 mikrolitre tohum stokunun kristalizasyon damlasına aktarılması. Sızdırmazlık bandı kullanarak plakayı kapatın.Asılı damla ekranlar 24 iyi asılı damla kristalizasyon tepsileri kurulabilir. Asma damla kuyularının kenarlarını yağlayın. 500 mikrolitre kristalizasyon çözeltisini rezervuara aktarın.Bir cam kapak slayt merkezi yakınında kristalizasyon çözeltisi bir mikrolitre damla yerleştirin. Bu damla için, lityum I3C ve tohum stok 0.1 mikrolitre ile desteklenen protein bir mikrolitre ekleyin. Kapak kaydırağını ters çevirin ve kapak kaydırağını yağa doğru iterek kristalizasyonu iyice kapatın.Asılı damla ve sızdırmazlık damla tepsileri kristaller oluşturmak için izin vermek için sabit bir sıcaklıkta kuluçka ya. Kristal büyümesi için düzenli olarak mikroskop altında kontrol edilmelidir. Kırınım verileri elde edildikten, entegre edildikten ve yazılı protokolde açıklandığı gibi ölçeklendirildikten sonra, Faz problemini çözmek ve proteini modellemek için Auto-Rickshaw otomatik kristal yapı belirleme boru hattı kullanılabilir.Otomatik Çekçek açılış sayfasında devam et düğmesini tıklatın. Kurumsal e-postanızı Auto-Rickshaw web formuna girin ve Auto-Rickshaw'ı çalıştırmaya devam etmek için tıklayın. Homoloji moto şablonu olmayan proteinler için Auto-Rickshaw'Un SAD protokolünü gelişmiş modda çalıştırın.Gerekli parametreleri girin. Molekül tipi olarak proteini seçin. Angstroms veri toplama dalga boyu girin.Yani ben de iyot atomlarını göstermek için alt yapı elemanı olarak kullanıldım. I3C'nin phasing molekülü olduğunu belirtmek için I3C alt yapı türünü seçin. Alt yapı belirleme yöntemi olarak sub_direct'yi seçin.Monomer başına beklenen alt yapıların sayısı olarak üç seçin. Alt yapı aramasının rezervasyon kesimi olarak birini girin. Bu, Otomatik Çekçek'in uygun çözünürlük kesimini otomatik olarak belirlemesine olanak tanır.Matthews katsayısına göre tek bir monomer, veri kümesinin uzay grubu ve asimetrik birimdeki molekül sayısını girin. İhtiyaçlarınıza uygun uygun x-ışını verilerinin uygun yayma düzeyini seçin. Anormal verileri boş bir ayar dosyası olarak girdi.Protein dizinizi SEQ, PIR veya TXT dosyası olarak girin. Kurumsal e-posta adresinizi girin. Sonuçlar size verilen e-posta adresine gönderilen bir web bağlantısı üzerinden teslim edilir.Auto-Rickshaw, alt yapıyı doğrulayan kararlı alt yapısını kullanarak yapıyı çözemezse, sorun giderme yapısı çözümüne yardımcı olabilir. Ağır atom siteleri listesini Auto-Rickshaw sonuçları sayfasından indirin. Ağır atom bölgeleri olarak adlandırılan bir köprüdür.Bu ağır atom siteleri ile bir metin dosyası indirecektir. Dosyanın dosya uzantısını txt'den pdb'ye değiştirin. Pdb dosyasını Coot'ta açın.Komşu asimetrik birimlerden gelen tüm ağır atomları görmek için simetriyi açın. Asimetrik birimler arasında da dahil olmak üzere ağır atomlar arasındaki mesafeleri ölçün. I3C altı angstrom bir yan uzunluğu ile eşkenar üçgen olarak görünür.Bu boyutlara sahip bir üçgenin varlığı, bu ağır atomların yerleşimlerinin doğru olduğunu gösterir. Otomatik Çekçek çalıştırılan alt yapı yanlışsa, diğer Otomatik Çekçek ayarları yazılı protokolde belirtildiği gibi sınanabilir. I3C RMMS yöntemi Hampton Research'ün HT ekranında tavuk yumurtası akı lysozyme ve bakteriyofaj P68'den Orf11 lysin proteininin etki alanı kullanılarak iki protein üzerinde test edildi.I3C veya mikrotohum olmadan kontrol ekranına karşılık gelen her protein için tam ekran, mikrotohum ekli ekran, I3C ile ekran ve son olarak I3C ve mikrotohum ile ekran kuruldu. Kristal ekrana I3C eklenmesi kristalizasyon isabet sayısını artırmak için görünmüyor. Tavuk yumurtası beyaz lysozyme ile, koşullar sayısı 31'den 26'ya düştü.Orf11 etki alanı ile tek bir hit durum kontrol ekranında bulundu. Ekrana I3C eklenmesi de aynı koşullarda tek bir hit verdi. Kuyuya mikrotohum eklenmesi, sırasıyla tavuk yumurtası beyaz lızme ve Orf11 etki alanı için 2,1 ve altı kat artışla sonuçlanan isabet koşullarının sayısında önemli bir artışa yol açtı.Bu sonuç, RMMS'yi test etmek le diğer çalışmalarla tutarlıdır. En önemlisi, i3C ve mikrotohum bir ekrana ekleyerek de tavuk yumurtası beyaz lysozyme ve Orf11 etki alanı için 2.3 ve yedi kat artış gösteren kontrol ekranına göre isabet koşulları nın sayısını artırdı. Bu, I3C RMMS yönteminin türev kristaller için verimli bir şekilde yeni koşullar üretebileceğini göstermektedir.Bu koşullardan elde edilen kristaller hasat edilebilir ve kristal yapısını çözmek için kullanılabilir. Tavuk yumurtası beyaz lysozyme Orf11 etki alanının yapısı, I3C RMMS ekranı ile başarılı bir türetme gösteren I3C'den gelen anormal sinyal kullanılarak, Otomatik Çekçek boru hattında SAD kademeli olarak çözülebilir. Biz phasing molekülÜ I3C ile türev yüksek kaliteli kristaller üretmek için basit ve verimli bir protokol sunduk.Bu ekranların sayısını ve kristal işleme adımları en aza indirir, ve böylece yeni proteinler ilerken yapısal biyologlar için özel ilgi çekicidir. Tohum stok uyraması sırasında yapılan farklı tohum stok seyreltmelerini test ederek kristal boyutunu optimize etmenizi şiddetle tavsiye ediyoruz. Ve bu adım ilk ekranlar yapıldıktan sonra tamamlanır.I3C yaygın olarak kullanılabilir ve satın almak için ucuz ve bu nedenle bu yöntemin en yapısal biyoloji laboratuvarları ulaşabileceği nde olduğuna inanıyoruz.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Protein Kristallerinin Mikrokristalografisi ve<em&gt; Selülozda</emKırınım

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Situ dinamik ışık saçılma ile birleştiğinde kristalizasyon büyüyen Protein kristalleri kullanarak farklı boyutları ile otomatik

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nükleik Asit Probları Kullanılarak Nükleaz Aktivitesinin Kinetik Taraması

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Bir Kombinatoryal Tek Etki Alanı Antikor Kütüphanesi adım wise Faj Seçimi ile Son Derece Spesifik Kimyasal Kaynaklı Protein Dimerization Sistemleri Oluşturma

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Başarılı Kristalizasyon Için Görsel GPCR-mini-G Protein Sinyal Kompleksi Stratejik Tarama ve Karakterizasyonu

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Seri Kristalografi Deneyleri için Endotiapepsin Kristallerinin Büyümesini Optimize Etme

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Afinite Kromatografisi Kullanılarak İnsan Matriksi Metalloproteinaz-3'ün Bakteriyel İfadesi ve Saflaştırılması

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...