Name: time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

ونود أن نشكر أعضاء معبد الهندسة الحيوية لمناقشات قيمة. نشكر ديفيد أمبروز في قلب التدفق الخلوي (كلية لويس كاتز للطب) لمساعدته في فرز الخلايا وتوني بوهم من مركز الأفكار (كلية الهندسة، جامعة تمبل) للمساعدة في الطباعة ثلاثية الأبعاد. كما نشكر موارد التمويل الخاصة بنا: منحة الباحث الباحث في جمعية السرطان الأمريكية 134415-RSG-20-034-01-CSM، قهر السرطان الآن / جائزة المحقق الشاب، المعاهد الوطنية للصحة، R00 CA172360 وR01 CA230777، كل إلى BG.

1. تصنيع جهاز تصوير Spheroid (SID) لتحسين تضمين spheroid (المدة 1 يوم)
<ol><li>إنشاء المسافة باستخدام طابعة 3D(الشكل 1A، B و ملف تكميلي 1).</li>
	<li>تزن بها نسبة 10:1 (wt/wt) من البوليمر قاعدة: crosslinker في كوب من البلاستيك [على سبيل المثال، 20 غرام من البوليمر قاعدة إيثيل بنزين و 2 غرام من الاتجات ا...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Noone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+cell+spheroid+assay+to+assess+invasion+in+a+3D+setting.">A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).</li><li>T&#246;nisen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP4+receptor+promotes+invadopodia+and+invasion+in+human+breast+cancer.">EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer.</a> European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).</li><li>Bayarmagnai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia-mediated+ECM+degradation+is+enhanced+in+the+G1+phase+of+the+cell+cycle.">Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle.</a> Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Boutin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+imaging+and+nuclear+segmentation+analysis+protocol+for+cleared+3D+culture+models.">A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models.</a> Science Reports. 8, 11135 (2018).</li><li>Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+spheroid+formation+recorded+with+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).</li><li>Marcello, M., Richards, R., Mason, D., S&#233;e, V., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cell+invasion+using+a+multicellular+spheroid+model+and+light-sheet+microscopy.">Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy.</a> Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li></ol>

تم تصميم المساحة المطبوعة ثلاثية الأبعاد لإنشاء أوراق سميكة من 1 مم من PDMS يمكن استخدامها بعد ذلك لإنشاء أشكال مختلفة من PDMS بسهولة ، كما هو مطلوب من التطبيقات التجريبية. نظرا لبساطة تلفيقه وحرية تغيير التصميم، تم اختيار هذا الأسلوب من الصب PDMS للتصميم الأولي لل SID. إذا كان هناك حاجة إلى حجم كب...

أثناء تطور السرطان، يمكن للخلايا السرطانية الحصول على نمط ظاهري ظاهري فيضوي، مما يمكنها من الهروب من كتلة الورم وغزو الأنسجة المحيطة1. في نهاية المطاف، يمكن لهذه الخلايا السرطانية الغازية الوصول والنمو داخل الأجهزة الثانوية، وهي عملية تسمى الانبثاث السرطان1. الانبثاث يسبب أكثر من 90٪ من الوفيات المرتبطة بالسرطان2. أحد أسباب ذلك هو أنه في حين أن الأورام الموضعية يمكن إدارتها سريريًا ، لا توجد طرق فعالة للقضاء على الخلايا السرطانية الغازية بمجرد حدوث الانتشار النقيلي. ولذلك، فإن ظهور الخلايا السرطانية الغازية والانتقال من مرض محلي إلى مرض غازي يشكل تحديًا سريريًا كبيرًا. تحديد كيفية بدء الخلايا السرطانية والحفاظ على سلوك الغازية قد يؤدي إلى تطوير علاجات قوية جديدة.
نموذج 3D كروي هو منصة مثالية للتحقيق في السلوك الضهر للخلايا السرطانية تحت السيطرة، ولكن الظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية3. في الواقع ، في هذا الفحص ، يتم تضمين التواء الخلايا السرطانية داخل المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، على سبيل المثال الكولاجين الأول ، الذي يحاكي ورمًا مبسطًا. ثم، يتم استخدام التصوير لتصور غزو الخلايا السرطانية من الزفير في مصفوفة الكولاجين. ومع ذلك، تحد العديد من التحديات هذا الإجراء.
التحدي الأول يحدث في خطوة التضمين، حيث يمكن أن تنتشر مصفوفة الكولاجين السائل عبر سطح الطبق، مما تسبب في spheroid للمس الجزء السفلي من الطبق. وبالتالي، انتشرت الخلايا من الزفير على السطح ثنائي الأبعاد (2D)، وكسر 3 الأبعاد (3D) المورفولوجيا. زيادة حجم الكولاجين هو حل فعال، ولكن مكلفة. لمنع الخلايا من الانتشار على السطح ثنائي الأبعاد، مع الحفاظ على الحد الأدنى من حجم الكولاجين، قمنا بتطوير جهاز تصوير سفلي (SID) من خلال ربط بوليديميثيلسيلوكسيان (PDMS) بسمك 1 مم، ثلاثية الفتحات (PDMS) على طبق زجاجي أسفل.
التحدي الثاني للمقايسة الزفية هو وضع العلامات على الخلايا السرطانية في الزفويد ، والتي يحدها الاختراق الضعيف للأجسام المضادة والأصباغ الفلورية ، وهو تأثير يزيد مع حجم الزفير. في حين أن الحل المثالي للخلايا وضع العلامات هو إنشاء خطوط الخلايا التي تعبر بشكل ثابت عن البروتين الفلوري (البروتينات) ، فإن هذا الخيار يقتصر في الغالب على خطوط الخلايا الخالدة ويقتصر على توافر الكيميرا البروتين الفلوري. هنا، ونحن وصف بروتوكول الأمثل لتلطيخ المناعة من الزفيرة، فضلا عن الاستخدام الفعال لصبغة السيتوبلازمية لتسمية الخلايا مباشرة قبل تضمين الزفيرويد.
التحدي الثالث للمقايسة الكروية هو عدم وجود وحدات ماكرو فيجي بسيطة للتحديد الكمي شبه الآلي لغزو الخلايا بمرور الوقت. لمعالجة هذا التحدي، نحن وصف منهجية بسيطة لتحليل منطقة spheroid على مر الزمن. نحن نوضح مزايا هذا البروتوكول باستخدام خطوط الخلايا 4T1 و 67NR كأمثلة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 N NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>60-014-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>SH30028.LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>T1048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti cortactin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33333</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti E-cadherin antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>1 to 100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine atelocollagen I solution (Nutragen)</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>501050ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red CMTPX Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable container</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td>Plastic cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht nuclear stain</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>S25371A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish (glass bottom dish)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6385-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>655204-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model

غزو الخلايا السرطانية من الورم الأساسي إلى الأنسجة السليمة المجاورة هي خطوة مبكرة في الانبثاث. وتشكل الخلايا السرطانية الغازية تحديا سريريا كبيرا لأنه لا توجد طريقة فعالة للقضاء عليها بمجرد نشرها. قد يؤدي فهم أفضل للآليات التي تنظم غزو الخلايا السرطانية إلى تطوير علاجات قوية جديدة. بسبب التشابه الفسيولوجي للأورام، spheroids جزءا لا يتجزأ من الكولاجين لقد استخدمت على نطاق واسع من قبل الباحثين لدراسة الآليات التي تحكم غزو الخلايا السرطانية في مصفوفة خارج الخلية (ECM). ومع ذلك، يقتصر هذا الفحص بواسطة (1) عدم التحكم في تضمين spheroids في ECM; (2) ارتفاع تكلفة الكولاجين الأول والزجاج الأطباق القاع، (3) لا يمكن الاعتماد عليها وضع العلامات immunofluorescent، وذلك بسبب اختراق غير فعال من الأجسام المضادة والأصباغ الفلورية و (4) معالجة الصور تستغرق وقتا طويلا، وتحديد كم البيانات. ولمعالجة هذه التحديات، قمنا بتحسين بروتوكول الزفير ثلاثي الأبعاد (3D) إلى الخلايا السرطانية المسماة بالفلورسنت والمضمروسة في الكولاجين الأول، إما باستخدام مقاطع فيديو الفاصل الزمني أو التصوير الطولي، وتحليل غزو الخلايا السرطانية. أولا، نحن وصف تصنيع جهاز التصوير spheroid (SID) لتضمين spheroids موثوق بها وفي الحد الأدنى من حجم الكولاجين الأول، والحد من تكلفة المقايسة. بعد ذلك، نقوم بتحديد الخطوات لوضع علامة الفلوريسين القوية على الـ spheroids الحية والثابتة. وأخيرا، نحن نقدم ماكرو فيجي سهلة الاستخدام لمعالجة الصور والبيانات. تماما، توفر هذه المنهجية البسيطة منصة موثوقة وبأسعار معقولة لرصد غزو الخلايا السرطانية في الكولاجين I. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل هذا البروتوكول بسهولة لتتناسب مع احتياجات المستخدمين.

ونظراً لتفاعلها البيولوجي، فإن نظام إدارة المباني يستخدم على نطاق واسع في التكبير المجهري لرُبُس الآبار والطوابع والقوالب، مما أحدث ثورة في الأجهزة الصغيرة والفولفلورية. في الطريقة المذكورة هنا، يتم استخدامه لإنشاء SIDs، والآبار للتخصيص التي تحسن التضمين spheroid وإجراءات التصوير. <strong class="xf...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

هنا هو بروتوكول لتصنيع جهاز التصوير spheroid. هذا الجهاز يتيح دينامية أو تصوير الفلورية طولية من الخلايا السرطانية spheroids. كما يقدم البروتوكول إجراء بسيط لمعالجة الصور لتحليل غزو الخلايا السرطانية.

الوقت تحليل التصوير الفلوري وتحليل غزو الخلايا السرطانية في نموذج 3D Spheroid

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة الآليات التي تحكم غزو الخلايا السرطانية إلى المصفوفة خارج الخلية في الوقت الحقيقي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم جهاز تصوير كروي بسيط ، مما يجعل فحص غزو الزفو أسهل في إعداده ويحسن كفاءته وتكلفته. بينما نبرهن على استخدام فحص الغزو الزاوي لنموذج سرطان الثدي، هذا الفحص هو نموذج ممتاز لغزو أي ورم صلب في الأنسجة السليمة المحيطة.بعد الطباعة 3D من المسافة، والوزن من نسبة 10:1 من البوليمر قاعدة إلى عبر رابط في كوب من البلاستيك واستخدام ماصة المتاح لخلط شامل الحل PDMS الناتجة في الكأس. وضع الكأس في غرفة فراغ والإفراج بسرعة عن ضغط الفراغ لإزالة أي الهواء المحاصرين على سطح الخليط وتبديد فقاعات الهواء المتبقية. احتضان 3D فراغ المطبوعة في 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لزيادة مرونته وتنظيف اثنين من لوحات الزجاج مع isopropanol 100٪.ضع المسافة بحيث يكون تدفق بين اثنين من لوحات تنظيفها ووضع اثنين من مقاطع الموثق كبيرة على الحافة السفلية واحد على الزاوية العليا لختم القالب على الحواف الخارجية للألواح. فحص الجزء العلوي من القالب للتأكد من أن المسافة دافق مع لوحات الزجاج واستخدام ماصة المتاح مع ما يقرب من سنتيمترين قطع من طرف ببطء ولكن باستمرار إضافة خليط PDMS إلى الزاوية اليسرى العليا من القالب. عندما تم شغل القالب كله، ضع القالب في غرفة فراغ لإزالة أي فقاعات الهواء التي تشكلت، قبل علاج PDMS لمدة ساعة واحدة في 100 درجة مئوية.في نهاية الحضانة، ضع القالب في درجة حرارة الغرفة. عندما يكون باردا لمسة، وإزالة مقاطع الموثق ولوحات الزجاج من المسافة التي تحتوي على PDMS الشفاء واستخدام شفرة حلاقة لقطع من خلال الختم الذي تم إنشاؤه على جميع الجوانب الأربعة للقالب بين المسافة والصحن الزجاجي. سحب بعيدا العفن للكشف عن ورقة PDMS في المسافة واستخدام ملاقط لتقشر بعناية ورقة PDMS قبالة من الفضاء.ضع الورقة على حصيرة قطع واستخدم لكمة خزعة لكمة من قرص PDMS قطره 17.5 ملليمتر ، ثم لكمة ثلاثة موزعة بالتساوي 5.5 ملليمتر ثقوب في القرص. استخدم الشريط لإزالة أي جزيئات الغبار من كل إدراج والتمسك إدراج تنظيفها على قطعة من الشريط على الوجهين. التفاف الشريط حول غطاء طبق بيتري 10 سنتيمترا ووضع الغطاء في آلة البلازما جنبا إلى جنب مع فتح 35 ملليمتر الأطباق أسفل الزجاج.قم بتنشيط الزاويات والزجاج مع دقيقة واحدة من المعالجة بالبلازما عند 300 ملليتورات واستخدم ملاقط لتعلق بسرعة الجانب المعالج من كل إدراج بالجزء الزجاجي من طبق قاع زجاجي معالج لكل إدراج. عندما تم تطبيق جميع إدراج، واستخدام الاصبع المؤشر والإبهام لتطبيق الضغط حتى على كل إدراج أثناء تدوير الطبق لإرفاق بشكل آمن إدراج إلى الأطباق. عندما تم تأمين جميع إدراج، احتضان أجهزة التصوير الزي الناتجة لمدة 20 دقيقة في 60 درجة مئوية، قبل إجراء جولة ثانية من العلاج البلازما كما هو موضح.بعد العلاج الثاني، إضافة 35 ميكرولترات من حل طلاء الطازجة أعدت لكل ثقب إدراج. بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وإزالة الحل طلاء وشطف الجهاز ثلاث مرات مع الماء المقطر. بعد الغسيل الأخير، أضف 35 ميكرولترات من محلول الربط المتبادل لكل حفرة لاحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.في نهاية الحضانة ، شطف الجهاز ثلاث مرات بالماء المقطر كما هو موضح ، قبل ملء كل جهاز بنسبة 70 ٪ من الإيثانول لاحتضان لمدة 30 دقيقة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. في نهاية التعقيم ، شطف الأجهزة ثلاث مرات بالماء المقطر وإضافة 2.5 ملليلتر من محلول التخزين إلى كل جهاز. لتضمين الـ spheroids في الكولاجين، اغسل الأجهزة ثلاث مرات بثلاثة ملليلترات من PBS لكل غسل.بعد الغسيل الأخير، والسماح للأجهزة لتجف تماما، قبل إضافة واحد spheroid في 30 ميكرولترات من الكلية الطازجة أعدت حل واحد في حفرة واحدة من إدراج وبدء جهاز توقيت. بعد التأكد من وجود spheroid في الحفرة، إضافة spheroids إلى الثقوب الأخرى اثنين كما هو موضح. استخدام تلميح ماصات ميكرولتر 10 إلى أحدث أي spheroids التي تقع بالقرب من حدود PDMS أو لفصل spheroids إذا تم توزيع متعددة spheroids وإيقاف المؤقت.لمركز الزفيرويد عموديا في طبقة الكولاجين، بعد البذر، الوجه الجهاز رأسا على عقب واحتضان الجهاز في 37 درجة حتى الكولاجين البلمرة، وعكس اتجاه الجهاز كل دقيقتين لما مجموعه 30 دقيقة، ثم إضافة 2.5 ملليلتر من المتوسط لكل جهاز والحصول على صورة من spheroids في نقطة ساعة الصفر. إن استخدام جهاز الصورة الزنجي يسهل عملية التضمين الفعال وتسجيل الفاصل الزمني لغزو الخلايا السرطانية داخل الكولاجين أو عن طريق التصوير الطولي. في حين تم تصوير هذا الزفيودي طوليا على مدى ستة أيام تتطلب التعبير مستقرة من البروتينات الفلورية السيتوبلازمية و / أو النووية، ويمكن إجراء تصوير طولي مماثل على مدى فترة زمنية أقصر باستخدام وضع العلامات صبغ.يمكن أيضا أن تكون ثابتة وsoidoids. على سبيل المثال، تم تسمية هذه الزفيرويدات المناعية للكادهرين الظهارية، الكوركتين، وF-actin. في هذه الصور، يمكن ملاحظة توضيح خطوة بخطوة لإجراء معالجة الصور باستخدام ماكرو فيجي لقياس مساحة الزفير مع مرور الوقت.تأكد من الاستغناء عن واحد كروي في كل ثقب من جهاز التصوير spheroid ووضعها في مركز الثقب في كل من الاتجاهات س ص و Z. يمكن بسهولة تعديل تصميم الجهاز عن طريق تغيير حجم وترتيب الثقوب ، وإدراج ، والأطباق أسفل الزجاج لاستيعاب إنتاجية أعلى spheroid.

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

التحليل الكمي الالتهام الذاتي باستخدام المجهر مضان المتقدم 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

التحليل السريع واستكشاف الإسفار الميكروسكوب الصور

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

على طريقة تجميع خلية فعالة ومرنة ل3D كروي الإنتاج

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

تحليل وظيفة خلايا بيتا باستخدام تصوير الكالسيوم القرار خلية واحدة في الجزيرات الزرد

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

ديناميات القلة من مستقبلات سطح الخلية في الخلايا الحية من قبل المجهر الداخلي الكلي انعكاس الشامل مع عدد وتحليل السطوع

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

تلطيخ وتصوير عالي الدقة لنماذج عضوية وكروية ثلاثية الأبعاد

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...