Name: time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00
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我们要感谢圣殿生物工程的成员进行了宝贵的讨论。我们感谢大卫安布罗斯在流细胞学核心（刘易斯卡茨医学院）的帮助细胞分拣和托尼博姆从IDES中心（工程学院，坦普尔大学）的3D打印的帮助。我们也感谢我们的资助资源：美国癌症协会研究学者格兰特134415-RSG-20-034-01-CSM，征服癌症现在/青年研究员奖，国家卫生研究院，R00 CA172360和R01 CA230777，所有BG。

1. 制造球形成像设备 （SID）， 以优化球形嵌入 （持续时间 1 天）
<ol><li>使用 3D 打印机创建间隔器（图 1A、B和补充文件 1）。</li>
	<li>称出基聚合物的 10：1（wt/wt）比：塑料杯中的交叉链接器 [例如，20 克乙基苯基聚合物和 2 克硅树脂交叉连结剂，以创建聚二甲基硅氧烷 （PDMS）]。</li>
	<li>使用一次性移液器在塑料杯中彻底混合 PDMS 解决方案。</li>
	<li>将塑料杯...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Noone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+cell+spheroid+assay+to+assess+invasion+in+a+3D+setting.">A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).</li><li>T&#246;nisen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP4+receptor+promotes+invadopodia+and+invasion+in+human+breast+cancer.">EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer.</a> European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).</li><li>Bayarmagnai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia-mediated+ECM+degradation+is+enhanced+in+the+G1+phase+of+the+cell+cycle.">Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle.</a> Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Boutin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+imaging+and+nuclear+segmentation+analysis+protocol+for+cleared+3D+culture+models.">A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models.</a> Science Reports. 8, 11135 (2018).</li><li>Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+spheroid+formation+recorded+with+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).</li><li>Marcello, M., Richards, R., Mason, D., S&#233;e, V., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cell+invasion+using+a+multicellular+spheroid+model+and+light-sheet+microscopy.">Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy.</a> Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li></ol>

3D 打印间隔器设计用于创建 1 毫米厚的 PDMS 纸张，然后可以按照实验应用的要求轻松创建各种形状的 PDMS。由于其制造的简单性和改变设计的自由度，这种 PDMS 铸造方法被选为小岛屿发展中国家的初始设计。如果需要大量 SID，则可以通过创建 3D 打印模具来提高生产效率，该模具已经包含带三个相同间隔孔的 PDMS 磁盘，并将工艺简化为一步。这将消除冲出每个磁盘以及随后的三个孔的需要，并减少...

在癌症进展过程中，癌细胞可以获得一种移动和侵入性表型，使它们能够逃离肿瘤质量并侵入周围的组织1。最终，这些侵入性癌细胞可以在继发性器官内到达并生长，这个过程称为癌症转移1。转移导致超过90%的癌症相关死亡2.原因之一是，虽然局部肿瘤在临床上是可控的，但一旦发生转移性扩散，就不存在消除侵入性癌细胞的有效方法。因此，侵入性癌细胞的出现和从局部性疾病向侵入性疾病的过渡是一项重大的临床挑战。确定癌细胞如何启动和维持侵入行为可能导致新的有效疗法的发展。
3D球形模型是研究受控癌细胞的移动行为的理想平台，但生理相关条件3。事实上，在这个测定中，癌细胞的球体嵌入细胞外基质（ECM），例如胶原蛋白I，它模仿了简化的肿瘤。然后，成像用于可视化癌细胞从球体侵入胶原蛋白基质。但是，多个挑战限制了此过程。
第一个挑战发生在嵌入步骤，液体胶原蛋白矩阵可以扩散到盘面，导致球体接触菜的底部。因此，球体中的细胞扩散到二维（2D）表面，打破了三维（3D）球形形态。增加胶原蛋白的体积是一种高效但成本高昂的解决方案。为了防止细胞在二维表面扩散，同时保持最小的胶原蛋白体积，我们开发了一个球形成像设备 （SID），将一个 1 毫米厚的 3 孔聚二甲基硅烷 （PDMS） 插入玻璃底盘。
球形测定的第二个挑战是球形中癌细胞的标签，由于抗体和荧光染料的渗透率低，这种效应会随着球形尺寸的增加而增加。虽然标记细胞的理想解决方案是建立稳定表达荧光蛋白的细胞系，但这一选择大多局限于不朽的细胞系，并受荧光蛋白幻想的可用性的限制。在这里，我们描述了一个优化的协议，用于固定球体的免疫荧光染色，以及在嵌入球体之前，有效地使用细胞质染料给细胞贴上标签。
球形测定的第三个挑战是缺乏简单的斐济宏，无法随着时间的推移对细胞入侵进行半自动量化。为了应对这一挑战，我们描述了一个简单的方法来分析球形区域随着时间的推移。我们以 4T1 和 67NR 细胞线为例说明了此协议的优点。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 N NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>60-014-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>SH30028.LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>T1048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti cortactin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33333</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti E-cadherin antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>1 to 100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine atelocollagen I solution (Nutragen)</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>501050ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red CMTPX Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable container</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td>Plastic cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht nuclear stain</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>S25371A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish (glass bottom dish)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6385-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>655204-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model

癌细胞从原发性肿瘤侵入相邻的健康组织是转移的早期步骤。侵入性癌细胞构成重大临床挑战，因为一旦其传播开始，就不存在有效的消除方法。更好地了解调节癌细胞入侵的机制可能导致新疗法的发展。由于它们与肿瘤的生理相似性，嵌入胶原蛋白中的球形已被研究人员广泛利用，以研究癌细胞侵入细胞外基质（ECM）的机制。然而，这种检测受到（1）对球体嵌入ECM缺乏控制的限制：（2） 胶原蛋白 I 和玻璃底盘成本高，（3） 由于抗体和荧光染料的低效渗透以及 （4） 耗时的图像处理和数据量化，不可靠的免疫荧光标签。为了应对这些挑战，我们优化了三维 （3D） 球形协议，使用延时视频或纵向成像对嵌入胶原蛋白 I 中的荧光标记癌细胞进行成像，并分析癌细胞入侵情况。首先，我们描述了球形成像设备 （SID） 的制造，以可靠和最小的胶原蛋白 I 体积嵌入球体，从而降低了检测成本。接下来，我们为活体和固定球体的强荧光标记描述步骤。最后，我们提供了一个易于使用的斐济宏图像处理和数据量化。总之，这种简单的方法提供了一个可靠和负担得起的平台，以监测胶原蛋白I的癌细胞入侵。此外，此协议可以轻松修改，以满足用户的需求。

由于其生物相容性，PDMS 被广泛用于限制井、邮票和模具的微压造，从而彻底改变了微模式和微流体设备。在此处描述的方法中，它用于创建 SID，可定制的井，可优化球形嵌入和成像过程。图 1说明了用于制造 SID 的主要组件。为了铸造 PDMS 模具，一个 1 毫米厚的隔板是 3D 打印（图 1A，B），放置在两个玻璃板之间，用大夹子密封。在板之?...

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Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

这里介绍了一个制造球形成像设备的协议。该设备可对癌细胞球体进行动态或纵向荧光成像。该协议还提供了一个简单的图像处理程序，用于分析癌细胞入侵。

3D球形模型中癌细胞入侵的时限解荧光成像和分析

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

该方案可用于实时研究癌细胞侵入细胞外基质的机制。该技术的主要优点是，它使用一个简单的球形成像设备，这使得球形入侵检测更容易设置和提高其效率和成本。虽然我们演示使用球状入侵检测来模拟乳腺癌，但这种检测是将任何实体肿瘤侵入周围健康组织的绝佳模型。隔间3D打印后，将基聚合物与塑料杯中的交叉链接器的10：1比重，并使用一次性移液器彻底混合杯中产生的PDMS溶液。将杯子放入真空室，快速释放真空压力，以清除困在混合物表面的任何空气，并消散剩余的气泡。在 100 摄氏度下孵化 3D 打印间隔器 5 分钟，以提高其灵活性，并清洁两个玻璃板，使用 100% 异丙酚。将隔板放置在两个清洁的板之间，并在底部边缘放置两个大粘合器夹，将一个夹子放在上角，将模具密封在板的外部边缘。检查模具的顶部，以确保垫片与玻璃板齐平，并使用一次性移液器，从尖端切到缓慢但持续地将 PDMS 混合物添加到模具左上角。当整个模具被填充后，将模具放入真空室以去除已形成的任何气泡，然后在 100 摄氏度下固化 PDMS 一小时。在孵化结束时，将霉菌放置在室温下。触摸冷却后，从装有固化 PDMS 的垫片中取出活页夹和玻璃板，并使用剃须刀刀片切开模具四面在隔板和玻璃板之间创建的密封件。拆开模具以显示隔板中的 PDMS 板材，并使用钳子小心地将 PDMS 板从垫片上剥离。将纸张放在切割垫上，使用活检冲孔冲出直径为 17.5 毫米的 PDMS 光盘，然后将三个均匀分布的 5.5 毫米孔打入光盘。使用胶带去除每个插入物中的任何灰尘颗粒，并将清洁的插入物粘在一块双面胶带上。将胶带包裹在 10 厘米的 Petri 盘盖上，并将盖子与打开的 35 毫米玻璃底盘一起放入等离子机中。在 300 毫托器处用一分钟的血浆处理激活插入物和玻璃，并使用钳子将每个插入物的处理侧快速连接到每个插入的经过处理的玻璃底盘的玻璃部分。应用完所有插件后，使用指尖和拇指对每个插入器施加均匀压力，同时旋转盘以将插件牢固地连接到菜肴上。当所有插入物都已固定后，在 60 摄氏度下孵育由此产生的球形成像设备 20 分钟，然后进行第二轮血浆处理。如图所示。第二次处理后，在每个插入孔中加入 35 微升新鲜制备的涂层溶液。在室温下一小时后，取出涂层溶液，用蒸馏水冲洗设备三次。上次清洗后，在每个孔中加入 35 微升的交叉连接溶液，在室温下进行 30 分钟的孵化。在孵化结束时，按照演示的蒸馏水冲洗设备三次，然后向每个设备灌装 70% 乙醇，在紫外线下孵育 30 分钟。灭菌结束时，用蒸馏水冲洗设备三次，为每个设备添加 2.5 毫升的存储溶液。要将球体嵌入胶原蛋白中，每次洗涤三毫升 PBS 会清洗设备三次。最后一次清洗后，让设备完全干燥，然后在30微升新鲜制备的学院中加入一个球形，将一个溶液插入一个孔中，然后启动计时器。在确认孔中球体的存在后，如所示，在其他两个孔中添加球形。使用 10 微升移液器尖端来接近 PDMS 边界的任何球形，或在分配多个球体并停止定时器时分隔球体。将球体垂直地围绕胶原蛋白层中枢，播种后，将设备倒置并孵育在 37 度，直到胶原蛋白聚合，每两分钟倒置一次设备方向，总共 30 分钟，然后每个设备添加 2.5 毫升中等值，并在零小时时间点获取球体图像。使用球形图像设备可促进胶原蛋白内或通过纵向成像对癌细胞入侵进行有效的嵌入和延时记录。虽然这个球体在六天内被纵向成像，需要细胞质和/或核荧光蛋白的稳定表达，但使用染料标签可以在更短的时间内进行类似的纵向成像。球状物也可以固定和免疫带。例如，这些球形被免疫接种为上皮卡德林，皮质素和F-actin。在这些图像中，可以观察到使用斐济宏测量球体区域的图像处理过程的分步图。请务必将单个球体分配到球形成像设备的每个孔中，并将球体放置在孔的中心，同时朝 XY 和 Z 方向。通过更改孔、插入物和玻璃底盘的大小和排列，可轻松修改设备设计，以适应更高的球形吞吐量。

Research

JoVE Journal

Biology

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科研

生物学

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