Name: time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

Vi vil gerne takke medlemmer af Temple Bioengineering for værdifulde diskussioner. Vi takker David Ambrose på flow cytometry kerne (Lewis Katz School of Medicine) for hans hjælp med celle sortering og Tony Boehm fra IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) for at få hjælp med 3D-udskrivning. Vi takker også vores finansiering ressourcer: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 og R01 CA230777, alle til BG.

1. Fremstilling af en sfæroid imaging enhed (SID) for at optimere sfæroid indlejring (Varighed 1 dag)
<ol><li>Opret afstandsstykket ved hjælp af en 3D-printer(Figur 1A, B og supplerende fil 1).</li>
	<li>Der afvejes et forhold på 10:1 (wt/wt) af basispolymeren:crosslinker i en plastikkop [f.eks. 20 g ethylbenzenbasepolymer og 2 g silikoneharpiks crosslinker for at skabe polydimethylsiloxan (PDMS)].</li>
	<li>Bland PDMS-opløsningen grundigt i plastikkoppen ved hjælp a...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Noone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+cell+spheroid+assay+to+assess+invasion+in+a+3D+setting.">A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).</li><li>T&#246;nisen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP4+receptor+promotes+invadopodia+and+invasion+in+human+breast+cancer.">EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer.</a> European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).</li><li>Bayarmagnai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia-mediated+ECM+degradation+is+enhanced+in+the+G1+phase+of+the+cell+cycle.">Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle.</a> Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Boutin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+imaging+and+nuclear+segmentation+analysis+protocol+for+cleared+3D+culture+models.">A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models.</a> Science Reports. 8, 11135 (2018).</li><li>Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+spheroid+formation+recorded+with+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).</li><li>Marcello, M., Richards, R., Mason, D., S&#233;e, V., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cell+invasion+using+a+multicellular+spheroid+model+and+light-sheet+microscopy.">Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy.</a> Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li></ol>

Den 3D-printede afstandsstykke er designet til at skabe 1 mm tykke ark PDMS, som derefter kan bruges til nemt at oprette forskellige former for PDMS, som krævet af forsøgsprogrammerne. På grund af enkelheden i dens fremstilling og friheden til at ændre designet blev denne metode til PDMS-støbning valgt til det oprindelige design af SID. Hvis der kræves stor mængde SID'er, kan produktionen gøres mere effektiv ved at oprette en 3D-printet form, som allerede indeholder PDMS-diske med tre lige store huller, og reduce...

Under kræft progression, kræftceller kan erhverve en broget og invasiv fænotype, gør det muligt for dem at undslippe tumor masse og invadere i de omkringliggende væv1. Til sidst, disse invasive kræftceller kan nå og vokse inde sekundære organer, en proces kaldet kræft metastase1. Metastase forårsager mere end 90% af kræftrelaterede dødsfald2. En af grundene til dette er, at mens lokaliserede tumorer er klinisk håndterbare, ingen effektive metoder findes til eliminering af invasive kræftceller, når metastatisk spredning har fundet sted. Derfor udgør fremkomsten af invasive kræftceller og overgangen fra en lokaliseret til en invasiv sygdom en stor klinisk udfordring. Bestemmelse af, hvordan kræftceller indlede og opretholde en invasiv adfærd kan føre til udvikling af nye potente behandlinger.
3D-sfæroidmodellen er en ideel platform til at undersøge kræftcellernes bevægelige adfærd under kontrollerede, men fysiologisk relevante forhold3. Faktisk, i denne analyse, sfæroider af kræftceller er indlejret inde i ekstracellulære matrix (ECM), for eksempel kollagen I, som efterligner en forenklet tumor. Derefter bruges billeddannelse til at visualisere invasionen af kræftceller fra kugleformet ind i kollagenmatrixen. Flere udfordringer begrænser dog denne procedure.
Den første udfordring opstår ved indlejringstrinnet, hvor den flydende kollagenmatrix kan sprede sig over skåloverfladen, hvilket får kugleformet til at røre bunden af skålen. Derfor spredes celler fra kugleformet på den todimensionale (2D) overflade og bryder den tredimensionale (3D) sfæroide morfologi. At øge mængden af kollagen er en effektiv, men dyr løsning. For at forhindre celler i at sprede sig på 2D-overfladen, samtidig med at vi opretholdt et minimalt volumen kollagen, udviklede vi en sfæroid billedenhed (SID) ved at afgrænse en 1 mm tyk, 3-hullers polydimethylsiloxan (PDMS) indsætte på en glasbundsskål.
Den anden udfordring af sfæroid assay er mærkning af kræftceller i sfæroider, som er begrænset af den dårlige penetration af antistoffer og fluorescerende farvestoffer, en effekt, der stiger med sfæroid størrelse. Mens den ideelle løsning til mærkning af celler er etablering af cellelinjer, der stabilt udtrykker fluorescerende protein (r), er denne mulighed for det meste begrænset til udødeliggjorte cellelinjer og er begrænset af tilgængeligheden af fluorescerende protein kimærer. Her beskriver vi en optimeret protokol for immunfluorescensfarvning af faste sfæroider samt effektiv brug af et cytoplasmisk farvestof til at mærke celler umiddelbart før indlejring af kugleformet.
Den tredje udfordring af sfæroid assay er manglen på enkle Fiji makroer til semi-automatiseret kvantificering af celle invasion over tid. For at løse denne udfordring beskriver vi en simpel metode til at analysere sfæroidområdet over tid. Vi illustrerer fordelene ved denne protokol ved hjælp af 4T1- og 67NR-cellelinjerne som eksempler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 N NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>60-014-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>SH30028.LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>T1048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti cortactin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33333</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti E-cadherin antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>1 to 100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine atelocollagen I solution (Nutragen)</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>501050ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red CMTPX Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable container</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td>Plastic cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht nuclear stain</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>S25371A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish (glass bottom dish)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6385-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>655204-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model

Invasionen af kræftceller fra den primære tumor i de tilstødende sunde væv er et tidligt skridt i metastaser. Invasive kræftceller udgør en stor klinisk udfordring, fordi der ikke findes nogen effektiv metode til deres eliminering, når deres udbredelse er i gang. En bedre forståelse af de mekanismer, der regulerer kræft celle invasion kan føre til udvikling af nye potente behandlinger. På grund af deres fysiologiske lighed med tumorer, sfæroider indlejret i kollagen jeg har været flittigt udnyttet af forskere til at studere de mekanismer, der styrer kræft celle invasion i den ekstracellulære matrix (ECM). Denne analyse er imidlertid begrænset af (1) manglende kontrol over indlejringen af sfæroider i ECM; (2) høje omkostninger til kollagen I- og glasbundsretter, 3) upålidelig immunfluorescerende mærkning på grund af ineffektiv indtrængen af antistoffer og fluorescerende farvestoffer og 4) tidskrævende billedbehandling og kvantificering af dataene. For at løse disse udfordringer optimerede vi den tredimensionelle (3D) sfæroide protokol til at billedet fluorescerende mærket kræftceller indlejret i kollagen I, enten ved hjælp af time-lapse videoer eller langsgående billeddannelse, og analysere kræft celle invasion. For det første beskriver vi fremstillingen af en sfæroid billedbehandling enhed (SID) til at integrere sfæroider pålideligt og i en minimal kollagen jeg volumen, hvilket reducerer analysen omkostninger. Dernæst afgrænser vi trinene for robust fluorescensmærkning af levende og faste sfæroider. Endelig tilbyder vi en brugervenlig Fiji-makro til billedbehandling og datakvantificering. Alt i alt giver denne enkle metode en pålidelig og overkommelig platform til at overvåge kræftcelleinvasion i kollagen I. Desuden kan denne protokol let ændres, så den passer til brugernes behov.

På grund af sin biokompatibilitet anvendes PDMS i vid udstrækning til mikrofabrikation af begrænsende brønde, frimærker og forme, som revolutionerede mikromaling og mikrofluidiske enheder. I den metode, der er beskrevet her, bruges den til at oprette SID'er, der kan tilpasses brønde, der optimerer sfæroidintegrering og billedbehandlingsprocedure. Figur 1 illustrerer de vigtigste komponenter, der anvendes ved fremstillingen af SID'erne. For at kaste PDMS-formen er en 1 mm tyk afstandss...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

Præsenteret her er en protokol for fremstilling af en sfæroid billedbehandling enhed. Denne enhed muliggør dynamisk eller langsgående fluorescens imaging af kræft celle sfæroider. Protokollen tilbyder også en simpel billedbehandling procedure for analyse af kræft celle invasion.

Tidsløst fluorescensbilleddannelse og analyse af kræftcelleinvasion i 3D-kugleformet model

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

Denne protokol kan bruges til at studere de mekanismer, der styrer invasionen af kræftceller i den ekstracellulære matrix i realtid. Den største fordel ved denne teknik er, at den bruger en simpel sfæroid billedbehandling enhed, hvilket gør sfæroid invasion assay lettere at oprette og forbedrer dens effektivitet og omkostninger. Mens vi demonstrerer ved hjælp af sfæroid invasion assay til model mammary carcinoma, denne analyse er en glimrende model for invasionen af enhver solid tumor i det omgivende sunde væv.Efter 3D-udskrivning af afstandsstykket, vægt ud en 10:1 forholdet mellem base polymer til cross-linker i en plastik kop og bruge en engangs pipette til grundigt at blande den resulterende PDMS løsning i koppen. Placer koppen i et vakuumkammer, og slip hurtigt vakuumtrykket for at fjerne al luft, der er fanget på overfladen af blandingen, og for at sprede de resterende luftbobler. Inkuber den 3D-printede afstandsstykke ved 100 grader Celsius i fem minutter for at øge fleksibiliteten og rengøre to glasplader med 100% isopropanol.Placer afstandsstykket, så det flugter mellem de to rensede plader og placerer to store bindemiddelklemmer på den nederste kant og et på øverste hjørne for at forsegle formen på pladernes udvendige kanter. Undersøg den øverste del af formen for at sikre, at afstandsstykket flugter med glaspladerne og bruger en engangspipette med ca. to centimeter skåret fra spidsen til langsomt, men kontinuerligt at tilføje PDMS-blandingen til øverste venstre hjørne af formen. Når hele formen er fyldt, skal du placere formen i vakuumkammeret for at fjerne eventuelle luftbobler, der er dannet, før du hærder PDMS i en time ved 100 grader Celsius.I slutningen af inkubationen skal du placere formen ved stuetemperatur. Når det er køligt at røre ved, skal du fjerne bindemiddelklemmer og glasplader fra afstandsstykket, der indeholder det hærdede PDMS, og bruge et barberblad til at skære gennem forseglingen, der blev oprettet på alle fire sider af formen mellem afstandsstykket og glaspladen. Træk formen fra hinanden for at afsløre PDMS-arket i afstandsstykket og brug pincet til omhyggeligt at skrælle PDMS-arket af afstandsstykket.Placer arket på en skæremåtte og bruge en biopsi punch til punch en 17,5 millimeter diameter PDMS disk, derefter punch tre jævnt fordelt 5,5 millimeter huller i disken. Brug tape til at fjerne støvpartikler fra hvert skær og sæt de rensede skær på et stykke dobbeltsidet tape. Pak båndet rundt om låget på en 10 centimeter petriskål og læg låget i en plasmamaskine sammen med åbne 35 millimeter glasbundsretter.Aktiver indsatser og glas med et minuts plasmabehandling ved 300 millitorrs og brug pincet til hurtigt at fastgøre den behandlede side af hvert indlæg til glasdelen af en behandlet glasbundsskål pr. Skær. Når alle indsatserne er påført, skal du bruge pegefingeren og tommelfingeren til at lægge jævnt tryk på hvert skær, mens du roterer skålen for sikkert at fastgøre indsatsen til opvasken. Når alle indsatserne er sikret, inkuberes de resulterende sfæroide billedbehandlingsanordninger i 20 minutter ved 60 grader Celsius, før de udfører en anden runde plasmabehandling som påvist.Efter den anden behandling tilsættes 35 mikroliter frisklavet belægningsopløsning til hvert skærhul. Efter en time ved stuetemperatur fjernes belægningsopløsningen og skylles enheden tre gange med destilleret vand. Efter den sidste vask tilsættes 35 mikroliter krydsledende opløsning til hvert hul for en 30-minutters inkubation ved stuetemperatur.Ved afslutningen af inkubationen skylles enheden tre gange med destilleret vand som påvist, før hver enhed fyldes med 70% ethanol for en 30-minutters inkubation under UV-lys. Ved afslutningen af steriliseringen skylles enhederne tre gange med destilleret vand og tilsæt 2,5 milliliter opbevaringsopløsning til hver enhed. For at integrere spheroiderne i kollagen vaskes enhederne tre gange med tre milliliter PBS pr. vask.Efter den sidste vask, lad enhederne tørre helt, før du tilføjer en sfæroid i 30 mikroliter frisklavet college en opløsning i et hul i indsatsen og starter en timer. Efter at have bekræftet tilstedeværelsen af kugleformet i hullet, tilsæt sfæroider til de to andre huller som demonstreret. Brug en 10 mikroliter pipette spids til nyere eventuelle spheroids, der er placeret tæt på PDMS grænsen, eller at adskille spheroids hvis flere sfæroider er udleveret og stoppe timeren.For lodret at centrere kugleformet i kollagenlaget, efter såning, skal du vende enheden på hovedet og inkubere enheden ved 37 grader, indtil kollagen polymeriserer, vende enhedens retning hvert andet minut i alt 30 minutter og derefter tilføje 2,5 milliliter medium pr. Enhed og erhverve et billede af spheroids på nul timers tidspunktet. Ved hjælp af en sfæroid billedenhed letter effektiv indlejring og time-lapse optagelse af kræft celle invasion i kollagen eller via langsgående billeddannelse. Mens denne sfæroid blev afbildet langsgående i løbet af seks dage, der kræver stabilt udtryk for cytoplasmiske og / eller nukleare fluorescerende proteiner, kan lignende langsgående billeddannelse udføres over en kortere periode ved hjælp af farvemærkning.Spheroids kan også fastsættes og immunolabeled. For eksempel blev disse sfæroider immunolabeled for epitel-cadherin, cortactin og F-actin. I disse billeder kan der observeres en trinvis illustration af billedbehandlingsproceduren ved hjælp af Fiji-makroen til at måle området af kugleformet over tid.Sørg for at dispensere en enkelt sfæroid i hvert hul i kugleformet billedbehandling enhed og til at placere kugleformet i midten af hullet i både XY og Z retninger. Enhedens design kan nemt ændres ved at ændre størrelsen og arrangementet af huller, skær og glasbundsretter for at imødekomme en højere sfærisk gennemløb.

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-baserede Måling af Store betjente Calcium indtastning i levende celler: fra kulturperler kræftcellen til at Skeletmuskel Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Kvantitativ analyse af Autophagy hjælp Advanced 3D fluorescensmikroskopi

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Levende Imaging af Apoptotisk Cell Clearance under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse af mRNA molekyler under anvendelse Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Hurtig analyse og udforskningen af ​​fluorescensmikroskopi Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

En effektiv og fleksibel Cell Sammenlægning Metode til 3D Sfæroide Production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Analyse af Beta-celle funktion ved hjælp af encellede opløsning Calcium Imaging i zebrafisk Holme

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Oligomerization dynamik af celleoverflade receptorer i levende celler ved total intern refleksion Fluorescens mikroskopi kombineret med tal og lysstyrke analyse

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Farvning og billeddannelse i høj opløsning af tredimensionelle organoid- og sfæroidmodeller

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...