Name: time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

We willen de leden van Temple Bioengineering bedanken voor waardevolle discussies. We danken David Ambrose van de flow cytometrie kern (Lewis Katz School of Medicine) voor zijn hulp bij celsortering en Tony Boehm van de IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) voor hulp bij het 3D printen. We danken ook onze financieringsmiddelen: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 en R01 CA230777, allemaal aan BG.

1. Fabricage van een Spheroid Imaging Device (SID) om spheroid embedding te optimaliseren (Duur 1 dag)
<ol><li>Maak de afstandsruimte met een 3D-printer (figuur 1A, B en Aanvullend Bestand 1).</li>
	<li>Weeg een verhouding van 10:1 (wt/wt) van basepolymeer:crosslinker in een plastic beker af [bijv. 20 g ethylbenzeen basepolymeer en 2 g siliconenhars crosslinker om polydimethylsiloxaan (PDMS) te maken].</li>
	<li>Meng de PDMS-oplossing grondig in de plastic beker met behulp...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Noone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+cell+spheroid+assay+to+assess+invasion+in+a+3D+setting.">A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).</li><li>T&#246;nisen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP4+receptor+promotes+invadopodia+and+invasion+in+human+breast+cancer.">EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer.</a> European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).</li><li>Bayarmagnai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia-mediated+ECM+degradation+is+enhanced+in+the+G1+phase+of+the+cell+cycle.">Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle.</a> Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Boutin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+imaging+and+nuclear+segmentation+analysis+protocol+for+cleared+3D+culture+models.">A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models.</a> Science Reports. 8, 11135 (2018).</li><li>Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+spheroid+formation+recorded+with+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).</li><li>Marcello, M., Richards, R., Mason, D., S&#233;e, V., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cell+invasion+using+a+multicellular+spheroid+model+and+light-sheet+microscopy.">Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy.</a> Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li></ol>

De 3D-geprinte afstandhouder is ontworpen om 1 mm dikke vellen PDMS te maken die vervolgens kunnen worden gebruikt om eenvoudig verschillende vormen van PDMS te maken, zoals vereist door de experimentele toepassingen. Vanwege de eenvoud van de fabricage en de vrijheid om het ontwerp te veranderen, werd deze methode van PDMS-gieten gekozen voor het oorspronkelijke ontwerp van de SID. Als er een hoog volume SIDs nodig is, kan de productie efficiënter worden gemaakt door een 3D-geprinte mal te maken, die al PDMS-schijven m...

Tijdens kankerprogressie kunnen kankercellen een beweeglijk en invasief fenotype krijgen, waardoor ze aan de tumormassa kunnen ontsnappen en in de omliggende weefsels kunnen binnendringen1. Uiteindelijk kunnen deze invasieve kankercellen secundaire organen bereiken en groeien, een proces dat kankermetastasen1wordt genoemd. Uitzaaiingen veroorzaakt meer dan 90% van de kankergerelateerde sterfgevallen2. Een reden hiervoor is dat, hoewel gelokaliseerde tumoren klinisch beheersbaar zijn, er geen efficiënte methoden bestaan voor de eliminatie van invasieve kankercellen zodra gemetastaseerde verspreiding heeft plaatsgevonden. Daarom vormt de opkomst van invasieve kankercellen en de overgang van een gelokaliseerde naar een invasieve ziekte een grote klinische uitdaging. Het bepalen hoe kankercellen een invasief gedrag initiëren en ondersteunen, kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe krachtige therapieën.
Het 3D-sferoïdemodel is een ideaal platform om het beweeglijke gedrag van kankercellen onder gecontroleerde, maar fysiologisch relevante aandoeningen te onderzoeken3. Inderdaad, in deze test zijn sferoïden van kankercellen ingebed in extracellulaire matrix (ECM), bijvoorbeeld collageen I, dat een vereenvoudigde tumor nabootst. Vervolgens wordt beeldvorming gebruikt om de invasie van kankercellen van het sferoïde in de collageenmatrix te visualiseren. Meerdere uitdagingen beperken deze procedure echter.
De eerste uitdaging vindt plaats bij de insluitstap, waar de vloeibare collageenmatrix zich over het oppervlak van de schotel kan verspreiden, waardoor de sferoïde de onderkant van de schaal raakt. Bijgevolg verspreidden cellen van de sferoïde zich op het tweedimensionale (2D) oppervlak en braken de driedimensionale (3D) sferoïde morfologie. Het verhogen van het volume collageen is een efficiënte, maar kostbare oplossing. Om te voorkomen dat cellen zich op het 2D-oppervlak verspreiden, met behoud van een minimaal collageenvolume, ontwikkelden we een sferoïde beeldvormingsapparaat (SID) door een 1 mm dikke, 3-gaats polydimethylsiloxaan (PDMS) insert op een glazen bodemschaal te verbinden.
De tweede uitdaging van de sferoïdetest is het labelen van kankercellen in sferoïden, die wordt beperkt door de slechte penetratie van antilichamen en fluorescerende kleurstoffen, een effect dat toeneemt met de grootte van de sferoïden. Hoewel de ideale oplossing voor het labelen van cellen de instelling is van cellijnen die fluorescerend eiwit(en) stabiel uitdrukken, is deze optie meestal beperkt tot vereeuwigde cellijnen en wordt beperkt door de beschikbaarheid van fluorescerende eiwit chimera's. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor immunofluorescentiekleuring van vaste sferoïden, evenals het efficiënte gebruik van een cytoplasmatische kleurstof om cellen onmiddellijk voor het insluiten van de sferoïde te labelen.
De derde uitdaging van de sferoïde test is het ontbreken van eenvoudige Fiji-macro's voor semi-geautomatiseerde kwantificering van celinvasie in de loop van de tijd. Om deze uitdaging aan te pakken, beschrijven we een eenvoudige methodologie om het sferoïde gebied in de loop van de tijd te analyseren. We illustreren de voordelen van dit protocol aan de hand van de 4T1- en 67NR-cellijnen als voorbeelden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 N NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>60-014-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>SH30028.LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>T1048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti cortactin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33333</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti E-cadherin antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>1 to 100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine atelocollagen I solution (Nutragen)</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>501050ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red CMTPX Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable container</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td>Plastic cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht nuclear stain</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>S25371A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish (glass bottom dish)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6385-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>655204-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model

De invasie van kankercellen van de primaire tumor in de aangrenzende gezonde weefsels is een vroege stap in uitzaaiingen. Invasieve kankercellen vormen een grote klinische uitdaging omdat er geen efficiënte methode bestaat voor hun eliminatie zodra hun verspreiding aan de gang is. Een beter begrip van de mechanismen die de invasie van kankercellen reguleren, kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe krachtige therapieën. Vanwege hun fysiologische gelijkenis met tumoren, sferoïden ingebed in collageen ben ik uitgebreid gebruikt door onderzoekers om de mechanismen voor kankercelinvasie in de extracellulaire matrix (ECM) te bestuderen. Deze bepaling wordt echter beperkt door (1) een gebrek aan controle over de inbedding van sferoïden in het ECM; (2) hoge kosten van collageen I en glazen bodemschotels, (3) onbetrouwbare immunofluorescente etikettering, als gevolg van de inefficiënte penetratie van antilichamen en fluorescerende kleurstoffen en (4) tijdrovende beeldverwerking en kwantificering van de gegevens. Om deze uitdagingen aan te pakken, hebben we het driedimensionale (3D) sferoïde protocol geoptimaliseerd om fluorescerend gelabelde kankercellen die zijn ingebed in collageen I in beeld te brengen, hetzij met behulp van time-lapse video's of longitudinale beeldvorming, en de invasie van kankercellen te analyseren. Ten eerste beschrijven we de fabricage van een sferoïde imaging device (SID) om sferoïden betrouwbaar en in een minimaal collageen I-volume in te sluiten, waardoor de assaykosten worden verlaagd. Vervolgens definiëren we de stappen voor robuuste fluorescentieetikettering van levende en vaste sferoïden. Tot slot bieden we een gebruiksvriendelijke Fiji-macro voor beeldverwerking en gegevenskwantificering. Al met al biedt deze eenvoudige methodologie een betrouwbaar en betaalbaar platform om de invasie van kankercellen in collageen I te monitoren. Bovendien kan dit protocol eenvoudig worden aangepast aan de behoeften van de gebruikers.

Vanwege de biocompatibiliteit wordt PDMS veel gebruikt voor microfabrication van het beperken van putten, stempels en mallen, wat een revolutie teweegbracht in micropatterning en microfluïdische apparaten. In de hier beschreven methode wordt het gebruikt om SIDs te maken, aanpasbare putten die de insluit- en beeldvormingsprocedure van sferoïden optimaliseren. Figuur 1 illustreert de belangrijkste componenten die worden gebruikt bij de fabricage van de SIDs. Om de PDMS-mal te gieten, wordt ...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de fabricage van een sferoïde beeldvormingsapparaat. Dit apparaat maakt dynamische of longitudinale fluorescentiebeeldvorming van kankercelsferoïden mogelijk. Het protocol biedt ook een eenvoudige beeldverwerkingsprocedure voor de analyse van kankercelinvasie.

Time-Resolved Fluorescentie Beeldvorming en analyse van kankercelinvasie in het 3D Spheroid Model

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

Dit protocol kan worden gebruikt om de mechanismen voor de invasie van kankercellen in de extracellulaire matrix in realtime te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudig sferoïde beeldvormingsapparaat gebruikt, waardoor de sferoïde invasietest gemakkelijker is in te stellen en de efficiëntie en kosten ervan verbetert. Terwijl we demonstreren met behulp van de sferoïde invasietest om mammacarcinoom te modelleren, is deze test een uitstekend model voor de invasie van een solide tumor in het omringende gezonde weefsel.Na 3D-printen van de afstandsmeter, weegt u een verhouding van 10:1 van basispolymeer tot kruis-linker in een plastic beker en gebruikt u een wegwerppipet om de resulterende PDMS-oplossing grondig in de beker te mengen. Plaats de beker in een vacuümkamer en laat snel de vacuümdruk los om alle lucht te verwijderen die aan het oppervlak van het mengsel is opgesloten en om de resterende luchtbellen te verwijderen. Incubeer de 3D-geprinte afstandsruimte gedurende vijf minuten op 100 graden Celsius om de flexibiliteit te vergroten en twee glasplaten schoon te maken met 100% isopropanol.Plaats de afstandcrère zo dat deze vlak tussen de twee gereinigde platen staat en plaats twee grote bindclips aan de onderrand en één op de bovenhoek om de mal op de buitenranden van de platen af te dichten. Inspecteer het bovenste deel van de mal om ervoor te zorgen dat de afstandsbalk gelijk is met de glasplaten en gebruik een wegwerppipet met ongeveer twee centimeter uit de punt gesneden om het PDMS-mengsel langzaam maar continu toe te voegen aan de linkerbovenhoek van de mal. Wanneer de hele mal is gevuld, plaatst u de mal in de vacuümkamer om eventuele gevormde luchtbellen te verwijderen, voordat u het PDMS een uur lang uithard bij 100 graden Celsius.Plaats de mal aan het einde van de incubatie op kamertemperatuur. Wanneer het koel is om aan te raken, verwijdert u de bindmiddelclips en glasplaten van de afstandhouder met het uitgeharde PDMS en gebruikt u een scheermesje om door de afdichting te snijden die aan alle vier de zijden van de mal tussen de afstandhouder en de glasplaat is gemaakt. Trek de mal uit elkaar om het PDMS-blad in de afstandsregelaar te onthullen en gebruik een pincet om het PDMS-blad voorzichtig van de afstandsregelaar te pellen.Plaats het vel op een snijmat en gebruik een biopsiepons om een PDMS-schijf met een diameter van 17,5 millimeter uit te ponsen en vervolgens drie gelijkmatig verdeelde gaten van 5,5 millimeter in de schijf te ponsen. Gebruik tape om stofdeeltjes van elk inzetstuk te verwijderen en plak de gereinigde inzetstukken op een stuk dubbelzijdige tape. Wikkel de tape om het deksel van een Petri-schaal van 10 centimeter en plaats het deksel in een plasmamachine samen met open 35 millimeter glazen bodemschotels.Activeer de inzetstukken en het glas met één minuut plasmabehandeling bij 300 millitorrs en gebruik een pincet om de behandelde kant van elk inzetstuk snel aan het glazen deel van één behandelde glazen bodemschaal per inzetstuk te bevestigen. Wanneer alle inzetstukken zijn aangebracht, gebruikt u de aanwijzervinger en duim om gelijkmatige druk uit te oefenen op elke insert terwijl u de schotel draait om de inzetstukken stevig aan de schotels te bevestigen. Wanneer alle inserts zijn vastgezet, moet u de resulterende sferoïde beeldvormingsapparaten gedurende 20 minuten bij 60 graden Celsius incuberen, voordat u een tweede ronde plasmabehandeling uitvoert zoals aangetoond.Voeg na de tweede behandeling 35 microliter vers bereide coatingoplossing toe aan elk inzetgat. Verwijder na een uur op kamertemperatuur de coatingoplossing en spoel het apparaat drie keer af met gedestilleerd water. Voeg na de laatste wasbeurt 35 microliters kruisverglinkende oplossing toe aan elk gat voor een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur.Spoel het apparaat aan het einde van de incubatie drie keer met gedestilleerd water zoals aangetoond, voordat u elk apparaat vult met 70% ethanol gedurende een incubatie van 30 minuten onder UV-licht. Spoel de apparaten aan het einde van de sterilisatie drie keer met gedestilleerd water en voeg aan elk apparaat 2,5 milliliter opslagoplossing toe. Om de sferoïden in collageen te verankeren, wast u de apparaten drie keer met drie milliliter PBS per wasbeurt.Laat de apparaten na de laatste wasbeurt volledig drogen, voordat u één sferoïde toevoegt in 30 microliters vers bereide college één oplossing in één gat van het inzetstuk en een timer start. Voeg na bevestiging van de aanwezigheid van de sferoïde in het gat sferoïden toe aan de andere twee gaten zoals aangetoond. Gebruik een pipettip van 10 microliter om sferoïden die zich dicht bij de PDMS-rand bevinden te recenter te maken, of om de sferoïden te scheiden als er meerdere sferoïden worden afgegeven en stop de timer.Om de sferoïde verticaal in de collageenlaag te centreren, draait u het apparaat na het zaaien ondersteboven en incubeert u het apparaat op 37 graden totdat het collageen polymeriseert, waarbij de oriëntatie van het apparaat elke twee minuten gedurende in totaal 30 minuten wordt omgekeerd, voeg vervolgens 2,5 milliliter medium per apparaat toe en verkrijg een afbeelding van de sferoïden op het tijdspunt van nul uur. Het gebruik van een sferoïde beeldapparaat vergemakkelijkt de efficiënte inbedding en time-lapse-registratie van kankercelinvasie in het collageen of via longitudinale beeldvorming. Hoewel deze sferoïde in de loop van zes dagen in de lengterichting in beeld werd gegeven en de stabiele expressie van cytoplasmatische en/of nucleaire fluorescerende eiwitten vereist, kan vergelijkbare longitudinale beeldvorming over een kortere periode worden uitgevoerd met behulp van kleurstofetikettering.Sferoïden kunnen ook worden bevestigd en immunolabeld. Deze sferoïden werden bijvoorbeeld immunolabeld voor epitheel-cadherine, cortactine en F-actine. In deze afbeeldingen kan een stapsgewijze illustratie van de beeldverwerkingsprocedure worden waargenomen met behulp van de Fiji-macro om het gebied van de sferoïde in de loop van de tijd te meten.Zorg ervoor dat u één sferoïde in elk gat van het sferoïde beeldvormingsapparaat uitdeelt en de sferoïde in het midden van het gat in zowel XY- als Z-richtingen plaatst. Het apparaatontwerp kan eenvoudig worden gewijzigd door de grootte en opstelling van de gaten, inzetstukken en glazen bodemschotels te wijzigen om een hogere sferoïde doorvoer te huisvesten.

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse Imaging van mitose Na siRNA transfectie

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Kwantitatieve analyse van Autophagy met Advanced 3D Fluorescentiemicroscopie

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Snelle analyse en verkenning van fluorescentiemicroscopie Afbeeldingen

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Een efficiënt en flexibel Cel aggregatie voor 3D Sferoïde Production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Analyse van bèta-cel functie met behulp van de resolutie van de eencellige Calcium Imaging in Zebrafish eilandjes

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Oligomerisatie dynamiek van celoppervlak receptoren in levende cellen door totale inwendige reflectie fluorescentiemicroscopie gecombineerd met cijfer-en helderheids analyse

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Kleuring en beeldvorming met hoge resolutie van driedimensionale organoïde en sferoïde modellen

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...