Name: time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

Nous tenons à remercier les membres de Temple Bioengineering pour leurs précieuses discussions. Nous remercions David Ambrose au noyau de cytométrie de flux (Lewis Katz School of Medicine) pour son aide au tri cellulaire et Tony Boehm du IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) pour son aide dans l’impression 3D. Nous remercions également nos ressources de financement : American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 et R01 CA230777, tous à BG.

1. Fabrication d’un dispositif d’imagerie sphéroïde (SID) pour optimiser l’intégration sphéroïde (Durée 1 jour)
<ol><li>Créez l’espaceur à l’aide d’une imprimante 3D(figure 1A, B et fichier supplémentaire 1).</li>
	<li>Pesez un rapport de 10:1 (wt/wt) de polymère de base : crosslinker dans une tasse en plastique [par exemple, 20 g de polymère de base éthylbenzene et 2 g de crosslinker de résine de silicone pour créer le polydimethylsiloxane (PDMS)...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Noone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+cell+spheroid+assay+to+assess+invasion+in+a+3D+setting.">A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).</li><li>T&#246;nisen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP4+receptor+promotes+invadopodia+and+invasion+in+human+breast+cancer.">EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer.</a> European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).</li><li>Bayarmagnai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia-mediated+ECM+degradation+is+enhanced+in+the+G1+phase+of+the+cell+cycle.">Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle.</a> Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Boutin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+imaging+and+nuclear+segmentation+analysis+protocol+for+cleared+3D+culture+models.">A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models.</a> Science Reports. 8, 11135 (2018).</li><li>Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+spheroid+formation+recorded+with+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).</li><li>Marcello, M., Richards, R., Mason, D., S&#233;e, V., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cell+invasion+using+a+multicellular+spheroid+model+and+light-sheet+microscopy.">Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy.</a> Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li></ol>

L’espaceur imprimé en 3D a été conçu pour créer des feuilles de PDMS de 1 mm d’épaisseur qui peuvent ensuite être utilisées pour créer facilement diverses formes de PDMS, comme l’exigent les applications expérimentales. En raison de la simplicité de sa fabrication et de la liberté de modifier la conception, cette méthode de moulage PDMS a été choisie pour la conception initiale du SID. Si un volume élevé de DIS est nécessaire, la production peut être rendue plus efficace en créant un moule impri...

Pendant la progression du cancer, les cellules cancéreuses peuvent acquérir un phénotype motile et invasif, leur permettant d’échapper à la masse tumorale et d’envahir les tissus environnants1. Finalement, ces cellules cancéreuses invasives peuvent atteindre et se développer à l’intérieur des organes secondaires, un processus appelé métastase du cancer1. La métastase cause plus de 90 % des décès liés au cancer2. L’une des raisons en est que, bien que les tumeurs localisées soient cliniquement gérables, il n’existe aucune méthode efficace pour l’élimination des cellules cancéreuses invasives une fois que la propagation métastatique s’est produite. Par conséquent, l’émergence de cellules cancéreuses invasives et la transition d’une maladie localisée à une maladie invasive posent un défi clinique majeur. Déterminer comment les cellules cancéreuses initient et soutiennent un comportement invasif peut mener au développement de nouvelles thérapies puissantes.
Le modèle sphéroïde 3D est une plate-forme idéale pour étudier le comportement motile des cellules cancéreuses dans des conditions contrôlées, mais physiologiquement pertinentes3. En effet, dans cet essai, les sphéroïdes des cellules cancéreuses sont intégrés à l’intérieur de la matrice extracellulaire (ECM), par exemple le collagène I, qui imite une tumeur simplifiée. Ensuite, l’imagerie est utilisée pour visualiser l’invasion des cellules cancéreuses du sphéroïde dans la matrice de collagène. Toutefois, de multiples défis limitent cette procédure.
Le premier défi se produit à l’étape d’intégration, où la matrice liquide de collagène peut se propager à travers la surface du plat, provoquant le sphéroïde de toucher le fond du plat. Par conséquent, les cellules du sphéroïde se sont propagées à la surface bidimensionnelle (2D), brisant la morphologie sphéroïde tridimensionnelle (3D). Augmenter le volume de collagène est une solution efficace, mais coûteuse. Pour empêcher les cellules de se propager sur la surface 2D, tout en maintenant un volume minimal de collagène, nous avons développé un dispositif d’imagerie sphéroïde (SID) en délimité un 1 mm d’épaisseur, polydimethylsiloxane 3 trous (PDMS) insert sur un plat de fond en verre.
Le deuxième défi de l’analyse sphéroïde est l’étiquetage des cellules cancéreuses dans les sphéroïdes, qui est limitée par la faible pénétration des anticorps et des colorants fluorescents, un effet qui augmente avec la taille des sphéroïdes. Alors que la solution idéale pour l’étiquetage des cellules est l’établissement de lignées cellulaires exprimant de façon stable les protéines fluorescentes, cette option est principalement limitée aux lignées cellulaires immortalisées et est limitée par la disponibilité de chimères protéiques fluorescentes. Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour la coloration d’immunofluorescence des sphéroïdes fixes, aussi bien que l’utilisation efficace d’un colorant cytoplasmique pour étiqueter des cellules immédiatement avant d’intégrer le sphéroïde.
Le troisième défi de l’analyse sphéroïde est l’absence de macros fidjiennes simples pour la quantification semi-automatisée de l’invasion cellulaire au fil du temps. Pour relever ce défi, nous décrivons une méthodologie simple pour analyser la zone sphéroïde au fil du temps. Nous montrons les avantages de ce protocole en utilisant les lignées cellulaires 4T1 et 67NR comme exemples.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 N NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>60-014-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>SH30028.LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>T1048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti cortactin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33333</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti E-cadherin antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>1 to 100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine atelocollagen I solution (Nutragen)</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>501050ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red CMTPX Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable container</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td>Plastic cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht nuclear stain</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>S25371A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish (glass bottom dish)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6385-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>655204-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model

L’invasion des cellules cancéreuses de la tumeur primaire dans les tissus sains adjacents est une étape tôt dans la métastase. Les cellules cancéreuses invasives posent un défi clinique majeur parce qu’il n’existe aucune méthode efficace pour leur élimination une fois leur diffusion en cours. Une meilleure compréhension des mécanismes régulant l’invasion des cellules cancéreuses peut conduire au développement de nouvelles thérapies puissantes. En raison de leur ressemblance physiologique avec les tumeurs, sphéroïdes intégrés dans le collagène, j’ai été largement utilisé par les chercheurs pour étudier les mécanismes régissant l’invasion des cellules cancéreuses dans la matrice extracellulaire (ECM). Toutefois, cet essai est limité par (1) un manque de contrôle sur l’intégration des sphéroïdes dans l’ECM; (2) coût élevé du collagène I et des plats de fond en verre, (3) étiquetage immunofluorescent peu fiable, en raison de la pénétration inefficace des anticorps et des colorants fluorescents et (4) du traitement et de la quantification d’images fastidieux des données. Pour relever ces défis, nous avons optimisé le protocole sphéroïde tridimensionnel (3D) pour l’image des cellules cancéreuses étiquetées fluorescentes intégrées au collagène I, soit à l’aide de vidéos en accéléré, soit d’une imagerie longitudinale, et nous analysons l’invasion des cellules cancéreuses. Tout d’abord, nous décrivons la fabrication d’un dispositif d’imagerie sphéroïde (SID) pour intégrer les sphéroïdes de manière fiable et dans un volume minimal de collagène I, réduisant le coût d’essai. Ensuite, nous délimélisons les étapes pour l’étiquetage robuste de fluorescence des sphéroïdes vivants et fixes. Enfin, nous offrons une macro Fidji facile à utiliser pour le traitement d’images et la quantification des données. Au total, cette méthodologie simple fournit une plate-forme fiable et abordable pour surveiller l’invasion des cellules cancéreuses dans le collagène I. En outre, ce protocole peut être facilement modifié pour répondre aux besoins des utilisateurs.

En raison de sa biocompatibilité, PDMS est largement utilisé pour la microfabrication de puits de sécation, timbres et moules, qui a révolutionné le micropatterning et les dispositifs microfluidiques. Dans la méthode décrite ici, il est utilisé pour créer des SID, des puits personnalisables qui optimisent l’intégration sphéroïde et la procédure d’imagerie. La figure 1 illustre les principaux composants utilisés dans la fabrication des DS. Pour moulage du moule PDMS, un espa...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

Présenté ici est un protocole pour la fabrication d’un dispositif d’imagerie sphéroïde. Ce dispositif permet l’imagerie dynamique ou longitudinale de fluorescence des sphéroïdes de cellules cancéreuses. Le protocole offre également une procédure simple de traitement d’image pour l’analyse de l’invasion des cellules cancéreuses.

Imagerie et analyse de fluorescence résolues dans le temps de l’invasion des cellules cancéreuses dans le modèle sphéroïde 3D

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

Ce protocole peut être utilisé pour étudier les mécanismes régissant l’invasion des cellules cancéreuses dans la matrice extracellulaire en temps réel. Le principal avantage de cette technique est qu’il utilise un dispositif d’imagerie sphéroïde simple, ce qui rend l’essai d’invasion sphéroïde plus facile à mettre en place et améliore son efficacité et son coût. Tandis que nous démontrons utilisant l’essai d’invasion sphéroïde pour modéliser le carcinome mammaire, cet essai est un excellent modèle pour l’invasion de n’importe quelle tumeur pleine dans le tissu sain environnant.Après l’impression 3D de l’espaceur, weight out un rapport de 10:1 de polymère de base à cross-linker dans une tasse en plastique et utiliser une pipette jetable pour bien mélanger la solution PDMS résultant dans la tasse. Placez la tasse dans une chambre à vide et relâchez rapidement la pression du vide pour éliminer tout air emprisonné à la surface du mélange et dissiper les bulles d’air restantes. Incuber l’espaceur imprimé 3D à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes pour augmenter sa flexibilité et nettoyer deux plaques de verre avec 100% isopropanol.Placez l’espaceur de sorte qu’il soit rincé entre les deux plaques nettoyées et placez deux gros agrafes de liant sur le bord inférieur et un sur le coin supérieur pour sceller le moule sur les bords extérieurs des plaques. Inspecter la partie supérieure du moule pour s’assurer que l’espaceur est rincé avec les plaques de verre et utiliser une pipette jetable avec environ deux centimètres coupés de la pointe à ajouter lentement mais continuellement le mélange PDMS dans le coin supérieur gauche du moule. Lorsque le moule entier a été rempli, placez le moule dans la chambre à vide pour enlever les bulles d’air qui se sont formées, avant de guérir le PDMS pendant une heure à 100 degrés Celsius.À la fin de l’incubation, placez le moule à température ambiante. Quand il est frais au toucher, retirez les agrafes de liant et les plaques de verre de l’espaceur contenant le PDMS durci et utilisez une lame de rasoir pour couper à travers le joint qui a été créé sur les quatre côtés du moule entre l’espaceur et la plaque de verre. Démonter le moule pour révéler la feuille PDMS dans l’espaceur et utiliser des pinces à épiler pour peler soigneusement la feuille PDMS hors de l’espaceur.Placez la feuille sur un tapis de coupe et utilisez un poinçon de biopsie pour percer un disque PDMS de 17,5 millimètres de diamètre, puis perforez trois trous uniformément répartis de 5,5 millimètres dans le disque. Utilisez du ruban adhésif pour enlever les particules de poussière de chaque insert et collez les inserts nettoyés sur un morceau de ruban adhésif à double face. Enroulez la bande autour du couvercle d’une boîte de Petri de 10 centimètres et placez le couvercle dans une machine à plasma avec des plats ouverts en verre de 35 millimètres.Activez les inserts et le verre avec une minute de traitement au plasma à 300 millitorrs et utilisez des pinces à épiler pour fixer rapidement le côté traité de chaque insert à la partie vitrée d’un plat de fond en verre traité par insert. Lorsque tous les inserts ont été appliqués, utilisez le doigt pointeur et le pouce pour appliquer une pression même sur chaque insert tout en tournant le plat pour fixer solidement les inserts à la vaisselle. Lorsque tous les inserts ont été sécurisés, incuber les dispositifs d’imagerie sphéroïde qui en résultent pendant 20 minutes à 60 degrés Celsius, avant d’effectuer une deuxième série de traitement plasmatique comme démontré.Après le deuxième traitement, ajouter 35 microlitres de solution de revêtement fraîchement préparée à chaque trou d’insertion. Après une heure à température ambiante, retirer la solution de revêtement et rincer l’appareil trois fois à l’eau distillée. Après le dernier lavage, ajouter 35 microlitres de solution de liaison croisée à chaque trou pour une incubation de 30 minutes à température ambiante.À la fin de l’incubation, rincer l’appareil trois fois à l’eau distillée comme démontré, avant de remplir chaque appareil de 70 % d’éthanol pour une incubation de 30 minutes sous lumière UV. À la fin de la stérilisation, rincer les appareils trois fois à l’eau distillée et ajouter 2,5 millilitres de solution de stockage à chaque appareil. Pour intégrer les sphéroïdes dans le collagène, lavez les appareils trois fois avec trois millilitres de PBS par lavage.Après le dernier lavage, laissez les appareils sécher complètement, avant d’ajouter un sphéroïde dans 30 microlitres de collège fraîchement préparé une solution dans un trou de l’insert et de commencer une infimes. Après avoir confirmé la présence du sphéroïde dans le trou, ajouter des sphéroïdes aux deux autres trous comme démontré. Utilisez une pointe de pipette de 10 microlitres pour plus récents les sphéroïdes qui sont situés près de la frontière PDMS, ou pour séparer les sphéroïdes si plusieurs sphéroïdes sont distribués et arrêter la infimeur.Pour centrer verticalement le sphéroïde dans la couche de collagène, après l’ensemencement, retourner l’appareil à l’envers et incuber l’appareil à 37 degrés jusqu’à ce que le collagène polymérise, inversant l’orientation de l’appareil toutes les deux minutes pour un total de 30 minutes, puis ajouter 2,5 millilitres de milieu par appareil et acquérir une image des sphéroïdes au point de temps zéro heure. L’utilisation d’un dispositif d’image sphéroïde facilite l’intégration efficace et l’enregistrement en accéléré de l’invasion des cellules cancéreuses dans le collagène ou par imagerie longitudinale. Tandis que ce sphéroïde a été image longitudinalement au cours de six jours exigeant l’expression stable des protéines fluorescentes cytoplasmiques et/ou nucléaires, la formation image longitudinale semblable peut être exécutée sur une période plus courte utilisant l’étiquetage de colorant.Les sphéroïdes peuvent également être fixés et immunolabeled. Par exemple, ces sphéroïdes ont été immunolabeled pour epithelial-cadherin, cortactin, et F-actin. Dans ces images, une illustration étape par étape de la procédure de traitement de l’image à l’aide de la macro Fidji pour mesurer la zone du sphéroïde au fil du temps peut être observée.Assurez-vous de distribuer un seul sphéroïde dans chaque trou de l’appareil d’imagerie sphéroïde et de positionner le sphéroïde au centre du trou dans les directions XY et Z. La conception de l’appareil peut facilement être modifiée en changeant la taille et l’agencement des trous, des inserts et des plats de fond en verre pour s’adapter à un débit sphéroïde plus élevé.

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Recherche

Biologie

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Basées sur la fluorescence de mesure de l&#39;entrée du calcium magasin fonctionnant dans des cellules vivantes: à partir de cellules cancéreuses en culture de fibre musculaire squelettique

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Analyse quantitative de l&#39;autophagie en utilisant avancée Fluorescence Microscopy 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Analyse rapide et exploration de microscopie par fluorescence Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Une méthode d&#39;agrégation cellulaire efficace et flexible pour 3D Spheroid production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Analyse de la fonction des cellules bêta à l’aide d’imagerie calcique résolution unicellulaire dans les îlots de poisson-zèbre

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Dynamique d'oligomerisation des récepteurs de surface cellulaire dans les cellules vivantes par microscopie de fluorescence interne totale combinée à l'analyse du nombre et de la luminosité

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Coloration et imagerie haute résolution de modèles organoïdes et sphéroïdes tridimensionnels

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...