Name: time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00
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Wir danken den Mitgliedern von Temple Bioengineering für wertvolle Diskussionen. Wir danken David Ambrose vom Flow Cytometry Core (Lewis Katz School of Medicine) für seine Unterstützung bei der Zellsortierung und Tony Boehm vom IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) für die Hilfe beim 3D-Druck. Wir danken auch unseren Fördergeldern: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 und R01 CA230777, alle an BG.

1. Herstellung eines Spheroid Imaging Device (SID) zur Optimierung der Sphäroideinbettung (Dauer 1 Tag)
<ol><li>Erstellen Sie den Abstandsraum mit einem 3D-Drucker(Abbildung 1A, B und Zusatzdatei 1).</li>
	<li>Ein 10:1 (Wt/Wt)-Verhältnis von Basispolymer:Verkreuzer in einem Kunststoffbecher [z.B. 20 g Ethylbenzol-Basispolymer und 2 g Silikonharzverlinker zur Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS)] wiegen.</li>
	<li>Mischen Sie die PDMS-Lösung im Kunststoffbecher mit...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Noone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+cell+spheroid+assay+to+assess+invasion+in+a+3D+setting.">A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).</li><li>T&#246;nisen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP4+receptor+promotes+invadopodia+and+invasion+in+human+breast+cancer.">EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer.</a> European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).</li><li>Bayarmagnai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia-mediated+ECM+degradation+is+enhanced+in+the+G1+phase+of+the+cell+cycle.">Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle.</a> Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Boutin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+imaging+and+nuclear+segmentation+analysis+protocol+for+cleared+3D+culture+models.">A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models.</a> Science Reports. 8, 11135 (2018).</li><li>Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+spheroid+formation+recorded+with+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).</li><li>Marcello, M., Richards, R., Mason, D., S&#233;e, V., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cell+invasion+using+a+multicellular+spheroid+model+and+light-sheet+microscopy.">Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy.</a> Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li></ol>

Der 3D-gedruckte Abstandsraum wurde entwickelt, um 1 mm dicke Blätter von PDMS zu erstellen, die dann verwendet werden können, um einfach verschiedene Formen von PDMS zu erstellen, wie es von den experimentellen Anwendungen gefordert wird. Aufgrund der Einfachheit der Fertigung und der Freiheit, das Design zu ändern, wurde diese Methode des PDMS-Castings für das ursprüngliche Design der SID gewählt. Wenn ein hohes SID-Volumen erforderlich ist, kann die Produktion effizienter gestaltet werden, indem eine 3D-gedruckt...

Während der Krebsprogression können Krebszellen einen motilen und invasiven Phänotyp erwerben, der es ihnen ermöglicht, der Tumormasse zu entkommen und in das umgebende Gewebe einzudringen1. Schließlich können diese invasiven Krebszellen in sekundären Organen erreichen und wachsen, ein Prozess namens Krebsmetastasierung1. Metastasen verursachen mehr als 90% der krebsbedingten Todesfälle2. Ein Grund dafür ist, dass, während lokalisierte Tumoren klinisch überschaubar sind, keine effizienten Methoden zur Eliminierung invasiver Krebszellen existieren, sobald eine metastasierende Ausbreitung stattgefunden hat. Daher stellt das Auftreten invasiver Krebszellen und der Übergang von einer lokalisierten zu einer invasiven Krankheit eine große klinische Herausforderung dar. Die Bestimmung, wie Krebszellen ein invasives Verhalten initiieren und aufrecht erhalten, kann zur Entwicklung neuartiger potenter Therapien führen.
Das 3D-Sphäroidmodell ist eine ideale Plattform, um das motile Verhalten von Krebszellen unter kontrollierten, aber physiologisch relevanten Bedingungen zu untersuchen3. Tatsächlich werden in diesem Test Sphäroide von Krebszellen in die extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettet, zum Beispiel Kollagen I, das einen vereinfachten Tumor imitiert. Dann wird die Bildgebung verwendet, um die Invasion von Krebszellen aus dem Sphäroid in die Kollagenmatrix zu visualisieren. Mehrere Herausforderungen schränken dieses Verfahren jedoch ein.
Die erste Herausforderung tritt bei der Einbettungsstufe auf, wo sich die flüssige Kollagenmatrix über die Telleroberfläche ausbreiten kann, wodurch das Sphäroid den Boden der Schale berührt. Folglich breiten sich Zellen aus dem Sphäroid auf der zweidimensionalen (2D) Oberfläche aus und brechen die dreidimensionale (3D) Sphäroidmorphologie. Die Erhöhung des Kollagenvolumens ist eine effiziente, aber kostspielige Lösung. Um zu verhindern, dass sich Zellen auf der 2D-Oberfläche ausbreiten und gleichzeitig ein minimales Kollagenvolumen beibehält, haben wir ein Sphäroid-Bildgebungsgerät (SID) entwickelt, indem wir einen 1 mm dicken 3-Loch-Polydimethylsiloxan (PDMS)-Einsatz auf eine Glasbodenschale begrenzt haben.
Die zweite Herausforderung des Sphäroid-Assays ist die Kennzeichnung von Krebszellen in Sphäroiden, die durch das schlechte Eindringen von Antikörpern und fluoreszierenden Farbstoffen begrenzt wird, ein Effekt, der mit der Sphäroidgröße zunimmt. Während die ideale Lösung für die Kennzeichnung von Zellen die Etablierung von Zelllinien ist, die fluoreszierende Proteine stabil ausdrücken, ist diese Option meist auf verewigte Zelllinien beschränkt und durch die Verfügbarkeit von fluoreszierenden Proteinchimären begrenzt. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Immunfluoreszenzfärbung von festen Sphäroiden sowie die effiziente Verwendung eines zytoplasmatischen Farbstoffs zur Kennzeichnung von Zellen unmittelbar vor dem Einbetten des Sphäroids.
Die dritte Herausforderung des Sphäroid-Assays ist das Fehlen einfacher Fidschi-Makros für die halbautomatische Quantifizierung der Zellinvasion im Laufe der Zeit. Um dieser Herausforderung zu begegnen, beschreiben wir eine einfache Methode, um den Sphäroidbereich im Laufe der Zeit zu analysieren. Wir veranschaulichen die Vorteile dieses Protokolls anhand der Zelllinien 4T1 und 67NR als Beispiele.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 N NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>60-014-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>SH30028.LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>T1048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti cortactin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33333</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti E-cadherin antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>1 to 100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine atelocollagen I solution (Nutragen)</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>501050ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red CMTPX Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable container</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td>Plastic cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht nuclear stain</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>S25371A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish (glass bottom dish)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6385-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>655204-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model

Die Invasion von Krebszellen aus dem Primärtumor in das angrenzende gesunde Gewebe ist ein früher Schritt in der Metastasierung. Invasive Krebszellen stellen eine große klinische Herausforderung dar, da es keine effiziente Methode für ihre Eliminierung gibt, sobald ihre Verbreitung im Gange ist. Ein besseres Verständnis der Mechanismen zur Regulierung der Krebszellinvasion kann zur Entwicklung neuartiger potenter Therapien führen. Aufgrund ihrer physiologischen Ähnlichkeit mit Tumoren, Sphäroide in Kollagen eingebettet I wurden ausgiebig von Forschern verwendet, um die Mechanismen für die Invasion von Krebszellen in die extrazelluläre Matrix (ECM) zu untersuchen. Dieser Test wird jedoch durch (1) einen Mangel an Kontrolle über die Einbettung von Spheroiden in das ECM begrenzt; (2) hohe Kosten für Kollagen-I- und Glasbodenschalen, (3) unzuverlässige immunfluoreszierende Kennzeichnung aufgrund des ineffizienten Eindringens von Antikörpern und Fluoreszenzfarbstoffen und (4) zeitaufwändige Bildverarbeitung und Quantifizierung der Daten. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir das dreidimensionale (3D) Sphäroidprotokoll optimiert, um fluoreszierend markierte Krebszellen, die in Kollagen I eingebettet sind, entweder mithilfe von Zeitraffervideos oder Längsbildgebung abzubilden und die Invasion von Krebszellen zu analysieren. Zunächst beschreiben wir die Herstellung eines Sphäroid-Bildgebungsgeräts (SID), um Sphäroide zuverlässig und in ein minimales Kollagen-I-Volumen einzubetten, wodurch die Assay-Kosten gesenkt werden. Als Nächstes zeichnen wir die Schritte zur robusten Fluoreszenzkennzeichnung von lebenden und festen Sphäroiden ab. Schließlich bieten wir ein einfach zu bedienendes Fidschi-Makro für die Bildverarbeitung und Datenquantifizierung. Insgesamt bietet diese einfache Methode eine zuverlässige und erschwingliche Plattform, um die Krebszellinvasion in Kollagen I zu überwachen. Darüber hinaus kann dieses Protokoll leicht an die Bedürfnisse der Benutzer angepasst werden.

Aufgrund seiner Biokompatibilität wird PDMS häufig für die Mikrofertigung von Grenzbrunnen, Briefmarken und Formen verwendet, was Mikromusterundung und mikrofluidische Geräte revolutionierte. In der hier beschriebenen Methode wird es verwendet, um SIDs zu erstellen, anpassbare Brunnen, die Sphäroid-Einbettung und Bildgebungsverfahren optimieren. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Komponenten, die bei der Herstellung der SIDs verwendet werden. Um die PDMS-Form zu gießen, wird ein 1-mm di...

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Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

Hier wird ein Protokoll für die Herstellung eines sphäroiden Bildgebungsgeräts vorgestellt. Dieses Gerät ermöglicht eine dynamische oder Längsfluoreszenzbildgebung von Krebszellsphäroiden. Das Protokoll bietet auch ein einfaches Bildverarbeitungsverfahren für die Analyse der Krebszellinvasion.

Zeitaufgelöste Fluoreszenz-Bildgebung und Analyse der Krebszellinvasion im 3D-Sphäroid-Modell

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Invasion von Krebszellen in die extrazelluläre Matrix in Echtzeit regeln. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es ein einfaches Sphäroid-Bildgebungsgerät verwendet, das die Einrichtung des Sphäroid-Invasions-Assays erleichtert und seine Effizienz und Kosten verbessert. Während wir die Verwendung des Sphäroid-Invasions-Assays demonstrieren, um das Mammakarzinom zu modellieren, ist dieser Assay ein ausgezeichnetes Modell für die Invasion eines soliden Tumors in das umgebende gesunde Gewebe.Gewichten Sie nach dem 3D-Druck des Abstandsraums ein Verhältnis von 10:1 von Basispolymer zu Querverlinker in einem Kunststoffbecher und verwenden Sie eine Einwegpipette, um die resultierende PDMS-Lösung im Becher gründlich zu mischen. Legen Sie den Becher in eine Vakuumkammer und lassen Sie schnell den Vakuumdruck los, um die an der Oberfläche des Gemischs eingeschlossene Luft zu entfernen und die verbleibenden Luftblasen abzuleiten. Inkubieren Sie den 3D-gedruckten Abstandsraum bei 100 Grad Celsius für fünf Minuten, um seine Flexibilität zu erhöhen und zwei Glasplatten mit 100% Isopropanol zu reinigen.Platzieren Sie den Abstandsraum so, dass er bündig zwischen den beiden gereinigten Platten ist, und legen Sie zwei große Binderclips am unteren Rand und einen auf die obere Ecke, um die Form auf die Außenkanten der Platten zu versiegeln. Prüfen Sie den oberen Teil der Form, um sicherzustellen, dass der Abstandsabstand mit den Glasplatten bündig ist, und verwenden Sie eine Einwegpipette mit etwa zwei Zentimetern, die von der Spitze geschnitten sind, um die PDMS-Mischung langsam, aber kontinuierlich in die obere linke Ecke der Form zu geben. Wenn die gesamte Form gefüllt ist, legen Sie die Form in die Vakuumkammer, um alle entstandenen Luftblasen zu entfernen, bevor Sie das PDMS für eine Stunde bei 100 Grad Celsius aushärten.Am Ende der Inkubation die Form bei Raumtemperatur platzieren. Wenn es kühl zur Berührung ist, entfernen Sie die Binderclips und Glasplatten aus dem Abstandshalter, der das ausgehärtete PDMS enthält, und verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Dichtung zu durchschneiden, die auf allen vier Seiten der Form zwischen Abstandhalter und Glasplatte entstanden ist. Ziehen Sie die Form auseinander, um das PDMS-Blatt im Abstandsraum zu enthüllen, und verwenden Sie eine Pinzette, um das PDMS-Blatt vorsichtig vom Abstandsraum zu schälen.Legen Sie das Blech auf eine Schneidmatte und stanzen Sie mit einem Biopsies-Punch eine PDMS-Scheibe mit einem Durchmesser von 17,5 Millimetern aus und schlagen Sie dann drei gleichmäßig verteilte 5,5-Millimeter-Löcher in die Scheibe. Verwenden Sie Klebeband, um Staubpartikel von jedem Einsatz zu entfernen und kleben Sie die gereinigten Einsätze auf ein Stück doppelseitiges Band. Wickeln Sie das Klebeband um den Deckel einer 10 Zentimeter petri Schale und legen Sie den Deckel in eine Plasmamaschine zusammen mit offenen 35-Millimeter-Glasbodenschalen.Aktivieren Sie die Einsätze und das Glas mit einer Minute Plasmabehandlung bei 300 Millitorrn und befestigen Sie die behandelte Seite jedes Einsatzes schnell am Glasteil einer behandelten Glasbodenschale pro Einsatz. Wenn alle Einsätze aufgebracht wurden, verwenden Sie den Zeigefinger und daumen, um gleichmäßigen Druck auf jeden Einsatz auszuüben, während Sie die Schale drehen, um die Einsätze sicher an den Tellern zu befestigen. Wenn alle Einsätze gesichert sind, inkubieren Sie die resultierenden Sphäroid-Bildgebungsgeräte für 20 Minuten bei 60 Grad Celsius, bevor Sie eine zweite Runde der Plasmabehandlung durchführen, wie gezeigt.Nach der zweiten Behandlung 35 Mikroliter frisch zubereitete Beschichtungslösung zu jedem Insert-Loch hinzufügen. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur die Beschichtungslösung entfernen und das Gerät dreimal mit destilliertem Wasser abspülen. Nach der letzten Wäsche 35 Mikroliter Vernetzungslösung zu jedem Loch für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen.Am Ende der Inkubation spülen Sie das Gerät dreimal mit destilliertem Wasser, bevor Sie jedes Gerät für eine 30-minütige Inkubation unter UV-Licht mit 70 % Ethanol füllen. Am Ende der Sterilisation spülen Sie die Geräte dreimal mit destilliertem Wasser ab und fügen Sie jedem Gerät 2,5 Milliliter Speicherlösung hinzu. Um die Sphäroide in Kollagen einzubetten, waschen Sie die Geräte dreimal mit drei MilliliterPBS pro Waschgang.Nach der letzten Wäsche, lassen Sie die Geräte vollständig trocknen, bevor Sie ein Sphäroid in 30 Mikroliter frisch zubereitetcollege eine Lösung in ein Loch des Einsatzes und starten Sie einen Timer. Nachdem Sie das Vorhandensein des Sphäroids in der Bohrung bestätigt haben, fügen Sie sphäroide zu den anderen beiden Löchern hinzu, wie gezeigt. Verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Pipettenspitze, um alle Sphäroide, die sich in der Nähe des PDMS-Rahmens befinden, zu neueren zu trennen oder die Sphäroide zu trennen, wenn mehrere Sphäroide ausgegeben werden, und stoppen Sie den Timer.Um das Sphäroid in der Kollagenschicht vertikal zu zentrieren, kippen Sie das Gerät nach dem Aussaat auf den Kopf und inkubieren Sie das Gerät bei 37 Grad, bis das Kollagen polymerisiert, wodurch die Geräteausrichtung alle zwei Minuten für insgesamt 30 Minuten umkehrt wird, fügen Sie dann 2,5 Milliliter Medium pro Gerät hinzu und erfassen Sie ein Bild der Sphäroide zum Nullstundenzeitpunkt. Die Verwendung eines Sphäroid-Bildgeräts erleichtert die effiziente Einbettung und Zeitrafferaufzeichnung der Krebszellinvasion im Kollagen oder über Längsbildgebung. Während dieses Sphäroid im Laufe von sechs Tagen längs abgebildet wurde, was die stabile Expression zytoplasmatischer und/oder nuklearfluoreszierender Proteine erforderte, kann eine ähnliche Längsbildgebung über einen kürzeren Zeitraum mit Farbstoffbeschriftung durchgeführt werden.Sphäroide können auch fixiert und immunmarkiert werden. Zum Beispiel waren diese Sphäroide immunlabeliert für Epithel-Cadherin, Cortactin und F-Actin. In diesen Bildern kann eine Schritt-für-Schritt-Illustration des Bildverarbeitungsverfahrens mit dem Fidschi-Makro beobachtet werden, um die Fläche des Sphäroids im Laufe der Zeit zu messen.Achten Sie darauf, ein einzelnes Sphäroid in jedes Loch des Sphäroid-Bildgebungsgeräts zu geben und das Sphäroid in der Mitte des Lochs in XY- und Z-Richtung zu positionieren. Das Gerätedesign kann leicht geändert werden, indem die Größe und Anordnung der Löcher, Einsätze und Glasbodenschalen geändert werden, um einen höheren Sphäroiddurchsatz aufzunehmen.

Research

JoVE Journal

Biology

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Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

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Forschung

Biologie

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

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Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

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Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

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Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

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Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

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