Name: time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

ברצוננו להודות לחברי טמפל ביו-הנדסה על דיונים חשובים. אנו מודים לדיוויד אמברוז בליבת הזרימה (בית הספר לרפואה של לואיס כץ) על עזרתו במיון תאים ולטוני בוהם ממרכז הרעיונות (המכללה להנדסה, אוניברסיטת טמפל) על העזרה בהדפסה בתלת מימד. אנו מודים גם למשאבי המימון שלנו: חוקר מחקר האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן גרנט 134415-RSG-20-034-01-CSM, לכבוש סרטן עכשיו / פרס החוקר הצעיר, המכונים הלאומיים לבריאות, R00 CA172360 ו R01 CA230777, כל BG.

1. ייצור של התקן הדמיה ספירואידית (SID) כדי לייעל הטמעת ספרואיד (משך יום אחד)
<ol><li>צור את המרווח באמצעות מדפסת תלת-ממד(איור 1A, B וקובץ משלים 1).</li>
	<li>לשקול יחס של 10:1 (wt/wt) של פולימר בסיס:crosslinker ב פלסטיק [למשל, 20 גרם של פולימר בסיס אתילבנזן ו 2 גרם של סיליקון שרסין crosslinker כדי ל...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Noone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+cell+spheroid+assay+to+assess+invasion+in+a+3D+setting.">A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).</li><li>T&#246;nisen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP4+receptor+promotes+invadopodia+and+invasion+in+human+breast+cancer.">EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer.</a> European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).</li><li>Bayarmagnai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia-mediated+ECM+degradation+is+enhanced+in+the+G1+phase+of+the+cell+cycle.">Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle.</a> Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Boutin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+imaging+and+nuclear+segmentation+analysis+protocol+for+cleared+3D+culture+models.">A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models.</a> Science Reports. 8, 11135 (2018).</li><li>Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+spheroid+formation+recorded+with+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).</li><li>Marcello, M., Richards, R., Mason, D., S&#233;e, V., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cell+invasion+using+a+multicellular+spheroid+model+and+light-sheet+microscopy.">Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy.</a> Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li></ol>

מרווח ההדפסה בתלת-ממד תוכנן ליצור יריעות בעובי 1 מ"מ של PDMS שניתן להשתמש בהן כדי ליצור בקלות צורות שונות של PDMS, כנדרש על-ידי היישומים הניסיוניים. בשל הפשטות של הייצור שלה ואת החופש לשנות את העיצוב, שיטה זו של הליהוק PDMS נבחרה עבור העיצוב הראשוני של SID. אם נדרש נפח גבוה של מזהי אבטחה, ניתן לייעל א?...

במהלך התקדמות הסרטן, תאים סרטניים יכולים לרכוש מוטיל פנוטיפ פולשני, המאפשר להם לברוח מסת הגידול לפלוש לתוך הרקמות שמסביב1. בסופו של דבר, תאים סרטניים פולשניים אלה יכולים להגיע ולגדול בתוך איברים משניים, תהליך הנקרא גרורות סרטן1. גרורות גורמות ליותר מ -90% ממקרי המוות הקשורים לסרטן2. אחת הסיבות לכך היא שבעוד שגידולים מקומיים ניתנים לניהול קליני, לא קיימות שיטות יעילות לחיסול תאים סרטניים פולשניים לאחר שהתרחשה התפשטות גרורתית. לכן, הופעתם של תאים סרטניים פולשניים והמעבר ממחלה מקומית למחלה פולשנית מהווים אתגר קליני גדול. קביעת האופן שבו תאים סרטניים ליזום ולקיים התנהגות פולשנית עלול להוביל להתפתחות של טיפולים חזקים הרומן.
מודל ספרואיד 3D הוא פלטפורמה אידיאלית לחקור את ההתנהגות המוטיב של תאים סרטניים תחת מבוקר, עדיין תנאים רלוונטייםמבחינה פיזיולוגית 3. ואכן, במהלך מבחנים אלה, ספירואידים של תאים סרטניים מוטבעים בתוך מטריצה חוץ תאית (ECM), למשל קולגן I, המחקה גידול פשוט יותר. לאחר מכן, ההדמיה משמשת כדי לדמיין את הפלישה של תאים סרטניים מהספרואיד לתוך מטריצת הקולגן. עם זאת, אתגרים מרובים מגבילים הליך זה.
האתגר הראשון מתרחש בשלב ההטבעה, שבו מטריצת הקולגן הנוזלי יכולה להתפשט על פני משטח הכלים, מה שגורם לספרואיד לגעת בתחתית המנה. כתוצאה מכך, תאים מהספרואיד מתפשטים על פני השטח הדו-ממדיים (דו-ממדיים), ושוברים את המורפולוגיה הכדורית התלת מימדית (3D). הגדלת נפח הקולגן היא פתרון יעיל אך יקר. כדי למנוע מהתאים להתפשט על פני השטח הדו-ממדיים, תוך שמירה על נפח מינימלי של קולגן, פיתחנו מכשיר הדמיה כדורי (SID) על ידי תוחם פולידימתילסילוקסן (PDMS) בעובי 1 מ"מ, בעל 3 חורים, מוכנס לתבנית תחתונה מזכוכית.
האתגר השני של מבחני הכדוריד הוא תיוג של תאים סרטניים בספרואידים, המוגבל על ידי חדירה לקויה של נוגדנים וצבעים פלואורסצנטיים, השפעה הגדלה עם גודל הכדורואיד. בעוד שהפתרון האידיאלי לתיוג תאים הוא הקמת קווי תאים המבטאים ביציבות חלבונים פלואורסצנטיים, אפשרות זו מוגבלת בעיקר לקווי תאים מונצחים ומוגבלת על ידי הזמינות של כימרות חלבון פלואורסצנטיות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול אופטימיזציה עבור כתמי immunofluorescence של ספרואידים קבועים, כמו גם את השימוש היעיל של צבע ציטופלסמי לתייג תאים מיד לפני הטמעת הכדורואיד.
האתגר השלישי של מבחני הכדוריד הוא היעדר פקודות מאקרו פשוטות של פיג'י לכימות אוטומטי למחצה של פלישת תאים לאורך זמן. כדי להתמודד עם אתגר זה, אנו מתארים מתודולוגיה פשוטה לניתוח אזור הכדורואיד לאורך זמן. אנו ממחישים את היתרונות של פרוטוקול זה באמצעות קווי התאים 4T1 ו- 67NR כדוגמאות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 N NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>60-014-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>SH30028.LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>T1048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti cortactin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33333</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti E-cadherin antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>1 to 100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine atelocollagen I solution (Nutragen)</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>501050ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red CMTPX Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable container</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td>Plastic cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht nuclear stain</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>S25371A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish (glass bottom dish)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6385-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>655204-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model

הפלישה של תאים סרטניים מן הגידול העיקרי לתוך הרקמות הבריאות הסמוכות הוא צעד מוקדם גרורות. תאים סרטניים פולשניים מהווים אתגר קליני גדול כי אין שיטה יעילה לחיסול שלהם פעם ההפצה שלהם מתבצעת. הבנה טובה יותר של המנגנונים המסדירים פלישת תאים סרטניים עלולה להוביל להתפתחות טיפולים חדשניים וחזקים. בשל הדמיון הפיזיולוגי שלהם לגידולים, ספרואידים מוטבע קולגן אני כבר מנוצל בהרחבה על ידי חוקרים כדי ללמוד את המנגנונים החלים פלישת תאים סרטניים לתוך המטריצה חוץ תאית (ECM). עם זאת, מבחנה זו מוגבלת על ידי (1) חוסר שליטה על הטמעת ספרואידים לתוך ECM; (2) עלות גבוהה של קולגן I ומנות תחתונות זכוכית, (3) תיוג אימונופלואורסצנטי לא אמין, בשל חדירה לא יעילה של נוגדנים וצבעים פלואורסצנטיים ו-(4) עיבוד תמונה וזמן רב וכימות הנתונים. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, אנחנו אופטימיזציה פרוטוקול כדורי תלת מימדי (3D) כדי תמונה פלואורסצנטית שכותרתו תאים סרטניים מוטבע קולגן אני, או באמצעות קטעי וידאו לשגות בזמן או הדמיה אורך, ולנתח פלישת תאים סרטניים. ראשית, אנו מתארים את הייצור של מכשיר הדמיה ספרואידית (SID) כדי להטמיע ספירואידים באופן אמין ובנפח קולגן I מינימלי, מה שמפחית את עלות ההסמכה. לאחר מכן, אנו מתווים את השלבים לתיוג פלואורסצנטי חזק של ספרואידים חיים וקבועים. לבסוף, אנו מציעים מאקרו פיג'י קל לשימוש לעיבוד תמונה וכימות נתונים. בסך הכל, מתודולוגיה פשוטה זו מספקת פלטפורמה אמינה ובמחיר סביר כדי לפקח על פלישת תאים סרטן קולגן I. יתר על כן, פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות כדי להתאים לצרכים של המשתמשים.

בשל תאימות ביולוגית שלה, PDMS נמצא בשימוש נרחב עבור microfabrication של ברים מוגבלים, בולים ותבניות, אשר מהפכה micropatterning והתקנים microfluidic. בשיטה המתוארת כאן, הוא משמש ליצירת מזהי SD, בארות להתאמה אישית כי לייעל הטמעה ספרואידית הליך הדמיה. איור 1 מדגים את הרכיבים העיקריים המשמשים לייצור מז...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

מוצג כאן הוא פרוטוקול לייצור של מכשיר הדמיה ספרואידי. מכשיר זה מאפשר הדמיה פלואורסצנטית דינמית או אורך של ספירואידים תאים סרטניים. הפרוטוקול מציע גם הליך עיבוד תמונה פשוט לניתוח פלישת תאים סרטן.

הדמיית פלואורסצנטיות שנפתרה בזמן וניתוח של פלישת תאים סרטן במודל ספרואיד 3D

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד את המנגנונים המסדירים את הפלישה של תאים סרטניים לתוך המטריצה חוץ תאית בזמן אמת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת במכשיר הדמיה ספרואידי פשוט, מה שהופך את הפלישה הספרואידית לקלות יותר להקים ומשפר את יעילותה ועלותה. בעוד אנו מדגימים באמצעות מבחני הפלישה ספרואידית מודל קרצינומה mammary, זה assay הוא מודל מצוין לפלישה של כל גידול מוצק לתוך הרקמה הבריאה שמסביב.לאחר הדפסה תלת-ממדית של המרווח, משקלל יחס של 10:1 של פולימר בסיס לקישור צולב בספינת פלסטיק והשתמש בפיפט חד פעמי כדי לערבב ביסודיות את פתרון ה- PDMS שנוצר בסל. מניחים את ה לתוך תא ואקום במהירות לשחרר את לחץ ואקום כדי להסיר את כל האוויר לכוד על פני השטח של התערובת כדי לפזר את בועות האוויר הנותרות. דגירה מרווח מודפס 3D ב 100 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי להגדיל את הגמישות שלה לנקות שתי צלחות זכוכית עם 100% איזופרופנול.מניחים את המרווח כך שהוא סומק בין שתי הצלחות שנוקו ומניחים שני קליפי קלסר גדולים בקצה התחתון ואחד על הפינה העליונה כדי לאטום את התבנית על הקצוות החיצוניים של הצלחות. בדוק את החלק העליון של התבנית כדי לוודא כי המרווח הוא סומק עם לוחות הזכוכית ולהשתמש פיפטה חד פעמית עם כ 2 ס"מ לחתוך מהקצה לאט אבל ברציפות להוסיף את תערובת PDMS לפינה השמאלית העליונה של התבנית. כאשר התבנית כולה כבר מלא, למקם את התבנית לתוך תא ואקום כדי להסיר את כל בועות האוויר שנוצרו, לפני ריפוי PDMS במשך שעה אחת ב 100 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, מניחים את התבנית בטמפרטורת החדר. כאשר הוא קריר למגע, להסיר את קליפי קלסר ולוחות זכוכית מן מרווח המכיל PDMS נרפא ולהשתמש סכין גילוח לחתוך דרך החותם שנוצר על כל ארבעת הצדדים של התבנית בין מרווח צלחת זכוכית. לפרק את התבנית כדי לחשוף את גיליון PDMS במרווח ולהשתמש פינצטה לקלף בזהירות את גיליון PDMS את המרווח.מניחים את הסדין על מחצלת חיתוך ומשתמשים בניקוב ביופסיה כדי להכניס לדיסק דיסק PDMS בקוטר 17.5 מ"מ, ולאחר מכן מכניסים לדיסק שלושה חורים בהפצה שווה של 5.5 מ"מ. השתמש בסרט הדבקה כדי להסיר את כל חלקיקי האבק מכל הכנס ולתקוע את מוסיף ניקה על פיסת סרט דו צדדי. עוטפים את הסרט סביב המכסה של צלחת פטרי 10 ס"מ ומניחים את המכסה לתוך מכונת פלזמה יחד עם פתוח 35 מילימטר זכוכית התחתון מנות.הפעל את מוסיף וזכוכית עם דקה אחת של טיפול פלזמה ב 300 מיליטורים ולהשתמש פינצטה לחבר במהירות את הצד המטופל של כל הכנס לחלק הזכוכית של צלחת אחת זכוכית תחתונה מטופלים לכל הכנס. כאשר כל התוספות הוחלו, השתמש באצבע ובאגודל המצביע כדי להפעיל לחץ שווה על כל הכנס תוך סיבוב המנה כדי לחבר את התוספות בצורה מאובטחת לכלים. כאשר כל התוספות אובטחו, דגירה את התקני הדמיה ספירואיד וכתוצאה מכך במשך 20 דקות ב 60 מעלות צלזיוס, לפני ביצוע סיבוב שני של טיפול פלזמה כפי שהוכח.לאחר הטיפול השני, להוסיף 35 microliters של פתרון ציפוי מוכן טרי לכל חור הכנס. לאחר שעה בטמפרטורת החדר, יש להסיר את תמיסת הציפוי ולשטוף את המכשיר שלוש פעמים במים מזוקקים. לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו 35 מיקרוליטרים של פתרון קישור צולב לכל חור עבור דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, לשטוף את המכשיר שלוש פעמים עם מים מזוקקים כפי שהוכח, לפני מילוי כל מכשיר עם 70% אתנול עבור דגירה של 30 דקות תחת אור UV. בסוף העיקור, לשטוף את המכשירים שלוש פעמים עם מים מזוקקים ולהוסיף 2.5 מיליליטר של פתרון אחסון לכל מכשיר. כדי להטמיע את הכדורואידים בקולגן, לשטוף את המכשירים שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של PBS לכל לשטוף.לאחר הכביסה האחרונה, אפשרו למכשירים להתייבש לחלוטין, לפני הוספת ספרואיד אחד ב-30 מיקרוליטרים של פתרון אחד שהוכן זה עתה לחור אחד של הכנס והתחלת טיימר. לאחר אישור נוכחותו של הכדורואיד בחור, מוסיפים ספרואידים לשני החורים האחרים כפי שהוכח. השתמש קצה פיפטה 10 microliter כדי להחליק את כל spheroids הממוקמים קרוב לגבול PDMS, או להפריד את spheroids אם ספירואידים מרובים מחלקים ולעצור את שעון העצר.כדי למרכז אנכית את הכדוריד בשכבת הקולגן, לאחר הזריעה, הפוך את המכשיר הפוך והדגיר את המכשיר ב-37 מעלות עד שהקולגן יתרבה, היפוך כיוון המכשיר כל שתי דקות למשך 30 דקות בסך הכל, ולאחר מכן הוסף 2.5 מיליליטר של מדיום לכל מכשיר ורכוש תמונה של הכדורואידים בנקודת זמן של אפס שעות. שימוש במכשיר תמונה ספרואידי מקל על הטבעה יעילה והקלטת זמן לשגות של פלישת תאים סרטניים בתוך הקולגן או באמצעות הדמיה אורך. בעוד ספרואיד זה היה בתמונה לאורך שישה ימים הדורשים ביטוי יציב של חלבונים ציטופלזמיים ו / או גרעיניים פלואורסצנטיים, הדמיה אורך דומה יכול להתבצע על פני פרק זמן קצר יותר באמצעות תיוג צבע.ניתן גם לתקן את הכדורים ולקבע אימונולה. לדוגמה, ספירואידים אלה היו immunolabeled עבור אפיתל-cadherin, קורטקטין, ו F-actin. בתמונות אלה, ניתן להבחין באיור שלב אחר שלב של הליך עיבוד התמונה באמצעות המאקרו של פיג'י כדי למדוד את אזור הכדורואיד לאורך זמן.הקפידו לחלק ספרואיד יחיד לכל חור של מכשיר ההדמיה הכדורואידי ולמקם את הכדורואיד במרכז החור בשני הכיוונים XY ו- Z. ניתן לשנות בקלות את עיצוב המכשיר על-ידי שינוי הגודל והסידור של החורים, התוספות והמנות התחתונות מזכוכית כך שיתאימו לתפוקה כדורית גבוהה יותר.

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

שיטת Aggregation Cell יעילה וגמישה עבור הפקת 3D אליפטית

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

ניתוח של תפקוד תאי בטא באמצעות הדמיה הסידן בתא יחיד ברזולוציה איונים דג זברה

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

ליגריזציה דינמיקה של קולטני פני שטח תא בתאי חיים על ידי סך הכל השתקפות פנימית מיקרוסקופ פלואורסצנטית בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

צביעה והדמיה ברזולוציה גבוהה של מודלים תלת מימדיים של אורגנואידים וכדוריים

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...