Name: time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

हम मूल्यवान चर्चाओं के लिए टेंपल बायोइंजीनियरिंग के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं । हम 3 डी प्रिंटिंग के साथ मदद के लिए आइडिया हब (कॉलेज ऑफ इंजीनियरिंग, टेंपल यूनिवर्सिटी) से सेल छंटाई और टोनी बोहेम के साथ उनकी सहायता के लिए फ्लो साइटोमेट्री कोर (लुईस काट्ज स्कूल ऑफ मेडिसिन) में डेविड एम्ब्रोस को धन्यवाद देते हैं। हम भी हमारे धन संसाधनों का शुक्रिया अदा करते हैं: अमेरिकन कैंसर सोसायटी रिसर्च स्कॉलर ग्रांट १३४४१५-आरएसजी-20-034-01-सीएसएम, अब कैंसर को जीतें/युवा अन्वेषक पुरस्कार, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, R00 CA172360 और R01 CA230777, सभी बीजी के लिए ।

1. स्फेरॉइड एम्बेडिंग (अवधि 1 दिन) को अनुकूलित करने के लिए एक स्पेरोइड इमेजिंग डिवाइस (एसआईडी) का निर्माण
<ol><li>3डी प्रिंटर(चित्रा 1A, बी और सप्लीमेंट्री फाइल 1)का उपयोग करके स्पेसर बनाएं।</li>
	<l...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Noone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+cell+spheroid+assay+to+assess+invasion+in+a+3D+setting.">A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).</li><li>T&#246;nisen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP4+receptor+promotes+invadopodia+and+invasion+in+human+breast+cancer.">EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer.</a> European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).</li><li>Bayarmagnai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia-mediated+ECM+degradation+is+enhanced+in+the+G1+phase+of+the+cell+cycle.">Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle.</a> Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Boutin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+imaging+and+nuclear+segmentation+analysis+protocol+for+cleared+3D+culture+models.">A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models.</a> Science Reports. 8, 11135 (2018).</li><li>Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+spheroid+formation+recorded+with+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).</li><li>Marcello, M., Richards, R., Mason, D., S&#233;e, V., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cell+invasion+using+a+multicellular+spheroid+model+and+light-sheet+microscopy.">Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy.</a> Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li></ol>

3 डी मुद्रित स्पेसर को पीडीएमएस की 1-मिमी मोटी चादरें बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया था जिसका उपयोग प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक पीडीएमएस के विभिन्न आकारों को आसानी से बनाने के लिए किया जा सकता ...

कैंसर की प्रगति के दौरान, कैंसर की कोशिकाएं एक गतिशील और आक्रामक फेनोटाइप प्राप्त कर सकती हैं, जिससे वे ट्यूमर द्रव्यमान से बचने और आसपास के ऊतकों में आक्रमण करने में सक्षम हो सकते हैं1। अंततः, ये आक्रामक कैंसर कोशिकाएं माध्यमिक अंगों के अंदर पहुंच और विकसित हो सकती हैं, एक प्रक्रिया जिसे कैंसर मेटास्टेसिस 1 कहाजाताहै। मेटास्टेसिस कैंसर से संबंधित मौतों के ९०% से अधिक का कारण बनता है2। इसका एक कारण यह है कि, जबकि स्थानीयकृत ट्यूमर चिकित्सकीय रूप से प्रबंधनीय हैं, एक बार मेटास्टैटिक प्रसार होने के बाद आक्रामक कैंसर कोशिकाओं के उन्मूलन के लिए कोई कुशल तरीके मौजूद नहीं हैं। इसलिए, आक्रामक कैंसर कोशिकाओं का उद्भव और एक स्थानीयकृत से एक आक्रामक बीमारी में संक्रमण एक प्रमुख नैदानिक चुनौती प्रस्तुत कर रहा है। यह निर्धारित करना कि कैंसर की कोशिकाएं कैसे शुरू करती हैं और एक आक्रामक व्यवहार को बनाए रखती हैं, जिससे उपन्यास शक्तिशाली उपचारों का विकास हो सकता है।
3 डी स्फेरोइड मॉडल नियंत्रित, अभी तक शारीरिक रूप से प्रासंगिक स्थितियों3के तहत कैंसर कोशिकाओं के गतिशील व्यवहार की जांच करने के लिए एक आदर्श मंच है। दरअसल, इस परख में, कैंसर कोशिकाओं के गोलाकार एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) के अंदर एम्बेडेड होते हैं, उदाहरण के लिए कोलेजन I, जो एक सरलीकृत ट्यूमर की नकल करता है। फिर, इमेजिंग का उपयोग कोलेजन मैट्रिक्स में गोलाकार से कैंसर कोशिकाओं के आक्रमण की कल्पना करने के लिए किया जाता है। हालांकि, कई चुनौतियां इस प्रक्रिया को सीमित करते हैं।
पहली चुनौती एम्बेडिंग चरण पर होती है, जहां तरल कोलेजन मैट्रिक्स डिश की सतह में फैल सकता है, जिससे स्फेरॉइड डिश के नीचे को छू सकता है। नतीजतन, स्फेरॉइड से कोशिकाएं त्रि-आयामी (3 डी) स्फेरॉइड आकृति विज्ञान को तोड़ते हुए दो आयामी (2D) सतह पर फैलती हैं। कोलेजन की मात्रा बढ़ाना एक कुशल, लेकिन महंगा समाधान है। कोशिकाओं को 2D सतह पर फैलने से रोकने के लिए, कोलेजन की न्यूनतम मात्रा को बनाए रखते हुए, हमने एक ग्लास बॉटम डिश पर 1 मिमी मोटी, 3-होल पॉलीडिमेथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) को डालने के द्वारा एक गोलाकार इमेजिंग डिवाइस (एसआईडी) विकसित किया।
स्पेरोइड परख की दूसरी चुनौती गोलाकारों में कैंसर कोशिकाओं की लेबलिंग है, जो एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट रंगों के खराब प्रवेश से सीमित है, एक प्रभाव जो गोलाकार आकार के साथ बढ़ता है। जबकि लेबलिंग कोशिकाओं के लिए आदर्श समाधान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एस) को व्यक्त करने वाली सेल लाइनों की स्थापना है, यह विकल्प ज्यादातर अमर कोशिका लाइनों तक सीमित है और फ्लोरोसेंट प्रोटीन कल्पना की उपलब्धता से सीमित है। यहां, हम फिक्स्ड स्फेरॉइड के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, साथ ही गोलाकार को एम्बेड करने से तुरंत पहले कोशिकाओं को लेबल करने के लिए साइटोप्लाज्मिक डाई का कुशल उपयोग करते हैं।
स्पेरोइड परख की तीसरी चुनौती समय के साथ सेल आक्रमण के अर्ध-स्वचालित मात्राकरण के लिए सरल फिजी मैक्रो की कमी है। इस चुनौती से निपटने के लिए, हम समय के साथ गोलाकार क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए एक सरल पद्धति का वर्णन करते हैं। हम उदाहरण के रूप में 4T1 और 67NR सेल लाइनों का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल के फायदों का वर्णन करते हैं।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 N NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>60-014-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>SH30028.LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>T1048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti cortactin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33333</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti E-cadherin antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>1 to 100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine atelocollagen I solution (Nutragen)</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>501050ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red CMTPX Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable container</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td>Plastic cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht nuclear stain</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>S25371A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish (glass bottom dish)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6385-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>655204-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model

प्राथमिक ट्यूमर से आसन्न स्वस्थ ऊतकों में कैंसर की कोशिकाओं पर आक्रमण मेटास्टेसिस में एक प्रारंभिक कदम है। आक्रामक कैंसर कोशिकाओं को एक प्रमुख नैदानिक चुनौती है क्योंकि कोई कुशल विधि उनके उंमूलन के लिए मौजूद एक बार उनके प्रसार चल रहा है मुद्रा । कैंसर सेल आक्रमण को विनियमित तंत्र की एक बेहतर समझ उपन्यास शक्तिशाली चिकित्सा के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । ट्यूमर के लिए उनकी शारीरिक समानता के कारण, कोलेजन में एम्बेडेड स्फेरॉइड मुझे शोधकर्ताओं द्वारा एक्सेसेलर मैट्रिक्स (ईसीएम) में कैंसर सेल आक्रमण को नियंत्रित करने वाले तंत्रों का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। हालांकि, यह परख (1) ईसीएम में गोलाकार के एम्बेडिंग पर नियंत्रण की कमी से सीमित है; (2) कोलेजन I और ग्लास बॉटम डिश की उच्च लागत, (3) अविश्वसनीय इम्यूनोफ्लोर्सेंट लेबलिंग, एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट रंगों की अक्षम पैठ के कारण और (4) समय लेने वाली छवि प्रसंस्करण और डेटा की मात्राकरण। इन चुनौतियों का समाधान करने के लिए, हमने तीन आयामी (3 डी) स्फेरॉइड प्रोटोकॉल को कोलेजन I में एम्बेडेड कैंसर कोशिकाओं को लेबल करने के लिए अनुकूलित किया, या तो समय-चूक वीडियो या देशांतर इमेजिंग का उपयोग करके, और कैंसर सेल आक्रमण का विश्लेषण करें। सबसे पहले, हम परख लागत को कम करने, मज़बूती से और एक न्यूनतम कोलेजन I मात्रा में स्फेरॉइड को एम्बेड करने के लिए एक गोलाय इमेजिंग डिवाइस (एसआईडी) के निर्माण का वर्णन करते हैं। इसके बाद, हम लाइव और फिक्स्ड स्फेरॉइड के मजबूत फ्लोरेसेंस लेबलिंग के लिए कदम चित्रित करते हैं। अंत में, हम छवि प्रसंस्करण और डेटा क्वांटिफिकेशन के लिए एक आसान-से-उपयोग फिजी मैक्रो प्रदान करते हैं। कुल मिलाकर, यह सरल पद्धति कोलेजन I में कैंसर सेल आक्रमण की निगरानी के लिए एक विश्वसनीय और किफायती मंच प्रदान करती है। इसके अलावा, उपयोगकर्ताओं की जरूरतों को पूरा करने के लिए इस प्रोटोकॉल को आसानी से संशोधित किया जा सकता है।

इसकी जैव अनुकूलता के कारण, पीडीएमएस का व्यापक रूप से कुओं, टिकटों और मोल्डों को सीमित करने के माइक्रोफैब्रिकेशन के लिए उपयोग किया जाता है, जिसने माइक्रोपैटर्निंग और माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में क्रां...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

यहां प्रस्तुत एक गोलाकार इमेजिंग डिवाइस के निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल है। यह डिवाइस कैंसर सेल स्फेरॉइड के गतिशील या देशांतर फ्लोरेसेंस इमेजिंग को सक्षम बनाता है। प्रोटोकॉल कैंसर सेल आक्रमण के विश्लेषण के लिए एक सरल छवि प्रसंस्करण प्रक्रिया भी प्रदान करता है।

3डी स्फेरॉइड मॉडल में कैंसर सेल आक्रमण का समय-हल फ्लोरेसेंस इमेजिंग और विश्लेषण

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

इस प्रोटोकॉल का उपयोग वास्तविक समय में एक्सपेरिअल मैट्रिक्स में कैंसर कोशिकाओं के आक्रमण को नियंत्रित करने वाले तंत्रों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह एक साधारण स्फेरॉइड इमेजिंग डिवाइस का उपयोग करता है, जो स्फेरॉयड आक्रमण परख को स्थापित करना और इसकी दक्षता और लागत में सुधार करना आसान बनाता है। जब तक हम मॉडल स्तन कार्सिनोमा के लिए गोलाकार आक्रमण परख का उपयोग कर प्रदर्शित करते हैं, तो यह परख आसपास के स्वस्थ ऊतकों में किसी भी ठोस ट्यूमर के आक्रमण के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है।स्पेसर की 3डी प्रिंटिंग के बाद, एक प्लास्टिक कप में क्रॉस-लिंकर के लिए बेस पॉलिमर के 10:1 अनुपात का वजन करें और कप में परिणामी पीडीएमएस समाधान को अच्छी तरह से मिलाने के लिए डिस्पोजेबल पिपेट का उपयोग करें। कप को वैक्यूम कक्ष में रखें और मिश्रण की सतह पर फंसी किसी भी हवा को हटाने और शेष हवा के बुलबुले को नष्ट करने के लिए जल्दी से वैक्यूम दबाव जारी करें। अपने लचीलेपन को बढ़ाने और 100% आइसोप्रोपैनॉल के साथ दो ग्लास प्लेटों को साफ करने के लिए पांच मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर 3डी मुद्रित स्पेसर को इनक्यूबेट करें।स्पेसर रखें ताकि यह दो साफ प्लेटों के बीच फ्लश हो और प्लेटों के बाहरी किनारों पर मोल्ड को सील करने के लिए नीचे किनारे पर दो बड़े बाइंडर क्लिप रखें और एक शीर्ष कोने पर रखें। मोल्ड के शीर्ष भाग का निरीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि स्पेसर ग्लास प्लेटों के साथ फ्लश हो और टिप से लगभग दो सेंटीमीटर कटौती के साथ एक डिस्पोजेबल पिपेट का उपयोग धीरे-धीरे लेकिन लगातार मोल्ड के शीर्ष बाएं कोने में पीडीएमएस मिश्रण जोड़ें। जब पूरा मोल्ड भर गया है, तो मोल्ड को 100 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए पीडीएमएस के इलाज से पहले, बनने वाले किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए वैक्यूम कक्ष में रखें।इनक्यूबेशन के अंत में, मोल्ड को कमरे के तापमान पर रखें। जब यह स्पर्श करने के लिए अच्छा है, तो ठीक पीडीएमएस युक्त स्पेसर से बाइंडर क्लिप और ग्लास प्लेटों को हटा दें और स्पेसर और ग्लास प्लेट के बीच मोल्ड के सभी चार किनारों पर बनाई गई सील के माध्यम से काटने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें। स्पेसर में पीडीएमएस शीट को प्रकट करने के लिए मोल्ड को अलग करें और स्पेसर के पीडीएमएस शीट को ध्यान से छीलने के लिए चिमटी का उपयोग करें।शीट को काटने की चटाई पर रखें और 17.5 मिलीमीटर व्यास पीडीएमएस डिस्क को पंच करने के लिए बायोप्सी पंच का उपयोग करें, फिर डिस्क में तीन समान रूप से वितरित 5.5 मिलीमीटर छेद पंच करें। प्रत्येक डालें से किसी भी धूल कणों को हटाने के लिए टेप का उपयोग करें और दो तरफा टेप के एक टुकड़े पर साफ आवेषण छड़ी। एक 10 सेंटीमीटर पेट्री डिश के ढक्कन के चारों ओर टेप लपेटें और खुले ३५ मिलीमीटर ग्लास नीचे व्यंजनों के साथ एक प्लाज्मा मशीन में ढक्कन जगह है ।300 मिलीटर पर प्लाज्मा उपचार के एक मिनट के साथ आवेषण और ग्लास को सक्रिय करें और चिमटी का उपयोग प्रत्येक डालने के उपचार पक्ष को प्रति सम्मिलित ग्लास बॉटम डिश के ग्लास भाग में जल्दी से संलग्न करने के लिए करें। जब सभी आवेषण लागू किए गए हों, तो प्रत्येक डालें पर दबाव लागू करने के लिए सूचक उंगली और अंगूठे का उपयोग करें, जबकि पकवान को सुरक्षित रूप से व्यंजनों में सम्मिलित करने के लिए घुमाते हैं। जब सभी आवेषण सुरक्षित किए गए हैं, तो प्लाज्मा उपचार के दूसरे दौर को प्रदर्शित करने से पहले, 60 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए परिणामी स्फेरॉयड इमेजिंग उपकरणों को इनक्यूबेट करें।दूसरे उपचार के बाद, प्रत्येक डालने वाले छेद में ताजा तैयार कोटिंग समाधान के 35 माइक्रोलीटर जोड़ें। कमरे के तापमान पर एक घंटे के बाद, कोटिंग समाधान को हटा दें और डिवाइस को आसुत पानी से तीन बार कुल्ला करें। अंतिम धोने के बाद, कमरे के तापमान पर 30 मिनट की इनक्यूबेशन के लिए प्रत्येक छेद के लिए क्रॉस-लिंकिंग समाधान के 35 माइक्रोलीटर जोड़ें।इनक्यूबेशन के अंत में, यूवी लाइट के तहत 30 मिनट की इनक्यूबेशन के लिए 70% इथेनॉल के साथ प्रत्येक डिवाइस को भरने से पहले, प्रदर्शन के अनुसार आसुत पानी के साथ तीन बार डिवाइस को कुल्ला। नसबंदी के अंत में, उपकरणों को आसुत पानी के साथ तीन बार कुल्ला करें और प्रत्येक डिवाइस में 2.5 मिलीलीटर भंडारण समाधान जोड़ें। कोलेजन में स्फेरॉइड को एम्बेड करने के लिए, उपकरणों को तीन बार पीबीएस प्रति वॉश के तीन मिलीलीटर के साथ धोएं।पिछले धोने के बाद, उपकरणों को पूरी तरह से सूखने दें, हौसले से तैयार कॉलेज एक समाधान के 30 माइक्रोलीटर में एक गोलाकार जोड़ने से पहले डालने के एक छेद में और एक टाइमर शुरू करें। छेद में गोलाकार की उपस्थिति की पुष्टि करने के बाद, प्रदर्शन के रूप में अन्य दो छेद में गोलाकार जोड़ें। पीडीएमएस सीमा के करीब स्थित किसी भी स्फेरॉइड को हाल ही में करने के लिए 10 माइक्रोलिटर पिपेट टिप का उपयोग करें, या यदि कई स्फेरॉइड तिरस्कृत होते हैं और टाइमर को रोकते हैं तो स्पेरोइड को अलग करें।कोलेजन परत में स्पेरोइड को लंबवत रूप से केंद्रित करने के लिए, सीडिंग के बाद, डिवाइस को उल्टा करें और डिवाइस को 37 डिग्री पर तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि कोलेजन पॉलीमरेज न हो जाए, कुल 30 मिनट के लिए हर दो मिनट में डिवाइस ओरिएंटेशन को उलट न दें, फिर प्रति डिवाइस 2.5 मिलीलीटर जोड़ें और शून्य घंटे के समय बिंदु पर स्फेरॉइड की छवि प्राप्त करें। एक गोलाकार छवि डिवाइस का उपयोग करने से कोलेजन के भीतर या देशांतर इमेजिंग के माध्यम से कैंसर सेल आक्रमण की कुशल एम्बेडिंग और समय-चूक रिकॉर्डिंग की सुविधा होती है। हालांकि इस स्फेरॉइड को छह दिनों के दौरान देशांतर रूप से चित्रित किया गया था, जिसमें साइटोप्लाज्मिक और/या परमाणु फ्लोरोसेंट प्रोटीन की स्थिर अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है, तो डाई लेबलिंग का उपयोग करके कम समय अवधि में इसी तरह की देशांतर इमेजिंग की जा सकती है ।स्फेरॉइड को भी ठीक किया जा सकता है और इम्यूनोलबेल्ड किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इन स्फेरॉइड को एपिथेलियल-कैडेरिन, कोर्टेक्टिन और एफ-ऐक्टिन के लिए इम्यूनोलेबल किया गया था। इन छवियों में, समय के साथ गोलाकार के क्षेत्र को मापने के लिए फिजी मैक्रो का उपयोग करके छवि प्रसंस्करण प्रक्रिया का एक कदम-दर-चरण चित्रण देखा जा सकता है।स्पेरोइड इमेजिंग डिवाइस के प्रत्येक छेद में एक भी स्फेरोइड बांटना सुनिश्चित करें और एक्सवाई और जेड दोनों दिशाओं में छेद के केंद्र में गोलाकार को स्थान दें। डिवाइस डिजाइन को आसानी से एक उच्च गोलाकार थ्रूपुट को समायोजित करने के लिए छेद, आवेषण और ग्लास बॉटम व्यंजनों के आकार और व्यवस्था को बदलकर संशोधित किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

SiRNA अभिकर्मक के बाद समय चूक सूत्रीविभाजन की इमेजिंग

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

स्टोर संचालित जीवित कोशिकाओं में कैल्शियम प्रविष्टि प्रतिदीप्ति आधारित मापन संवर्धित सेल कैंसर से कंकाल की मांसपेशी फाइबर

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

3D उन्नत प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर भोजी के मात्रात्मक विश्लेषण

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Apoptotic सेल क्लीयरेंस की इमेजिंग के दौरान जीते<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

प्रतिदीप्ति का प्रयोग mRNA अणुओं के दृश्य और विश्लेषण<em&gt; स्वस्थानी</emमें&gt; संकरण<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

तेजी से विश्लेषण और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों का अन्वेषण

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

3 डी उपगोल उत्पादन के लिए एक कुशल और लचीला सेल एकत्रीकरण विधि

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Zebrafish टाप में एकल-कक्ष रिज़ॉल्यूशन कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करके बीटा-कक्ष फ़ंक्शन का विश्लेषण

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा लिविंग सेल में सेल सरफेस रिसेप्टर्स की ओलिगोमेराइजेशन गतिशीलता संख्या और चमक विश्लेषण के साथ संयुक्त

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

त्रि-आयामी ऑर्गनॉइड और स्फेरॉइड मॉडल की धुंधला और उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...