Name: time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00
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Vorremmo ringraziare i membri di Temple Bioengineering per le preziose discussioni. Ringraziamo David Ambrose al flow cytometry core (Lewis Katz School of Medicine) per la sua assistenza allo smistamento cellulare e Tony Boehm dell'IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) per l'aiuto con la stampa 3D. Ringraziamo anche le nostre risorse di finanziamento: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 e R01 CA230777, tutto a BG.

1. Fabbricazione di un dispositivo di imaging sferoide (SID) per ottimizzare l'incorporamento di sferoidi (durata 1 giorno)
<ol><li>Creare il distanziale utilizzando una stampante 3D (Figura 1A, B e File supplementare 1).</li>
	<li>Pesare un rapporto 10:1 (wt/wt) di polimero di base:crosslinker in una tazza di plastica [ad esempio, 20 g di polimero di base etilbenzene e 2 g di crosslinker in resina siliconica per creare polidimetilsiloxano (PDMS)].</li>
	<li>Mescolare accu...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Noone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+cell+spheroid+assay+to+assess+invasion+in+a+3D+setting.">A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).</li><li>T&#246;nisen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP4+receptor+promotes+invadopodia+and+invasion+in+human+breast+cancer.">EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer.</a> European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).</li><li>Bayarmagnai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia-mediated+ECM+degradation+is+enhanced+in+the+G1+phase+of+the+cell+cycle.">Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle.</a> Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Boutin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+imaging+and+nuclear+segmentation+analysis+protocol+for+cleared+3D+culture+models.">A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models.</a> Science Reports. 8, 11135 (2018).</li><li>Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+spheroid+formation+recorded+with+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).</li><li>Marcello, M., Richards, R., Mason, D., S&#233;e, V., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cell+invasion+using+a+multicellular+spheroid+model+and+light-sheet+microscopy.">Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy.</a> Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li></ol>

Il distanziale stampato in 3D è stato progettato per creare fogli di PDMS spessi 1 mm che possono quindi essere utilizzati per creare facilmente varie forme di PDMS, come richiesto dalle applicazioni sperimentali. Grazie alla semplicità della sua fabbricazione e alla libertà di alterare il design, questo metodo di fusione PDMS è stato scelto per la progettazione iniziale del SID. Se è richiesto un elevato volume di SID, la produzione può essere resa più efficiente creando uno stampo stampato in 3D, che contiene gi...

Durante la progressione del cancro, le cellule tumorali possono acquisire un fenotipo mobile e invasivo, consentendo loro di sfuggire alla massa tumorale e invadere nei tessuticircostanti 1. Alla fine, queste cellule tumorali invasive possono raggiungere e crescere all'interno degli organi secondari, un processo chiamato metastasitumorale 1. La metastasi causa più del 90% dei decessi correlati al cancro2. Una ragione di ciò è che, mentre i tumori localizzati sono clinicamente gestibili, non esistono metodi efficienti per l'eliminazione delle cellule tumorali invasive una volta che si è verificata la diffusione metastatica. Pertanto, l'emergere di cellule tumorali invasive e il passaggio da una malattia localizzata a una malattia invasiva sta ponendo una grande sfida clinica. Determinare come le cellule tumorali avviano e sostengono un comportamento invasivo può portare allo sviluppo di nuove terapie potenti.
Il modello sferoide 3D è una piattaforma ideale per indagare il comportamento mobile delle cellule tumorali in condizioni controllate, ma fisiologicamente rilevanti3. Infatti, in questo saggio, gli sferoidi delle cellule tumorali sono incorporati all'interno della matrice extracellulare (ECM), ad esempio collagene I, che imita un tumore semplificato. Quindi, l'imaging viene utilizzato per visualizzare l'invasione delle cellule tumorali dallo sferoide nella matrice di collagene. Tuttavia, più sfide limitano questa procedura.
La prima sfida si verifica nella fase di incorporamento, dove la matrice di collagene liquido può diffondersi sulla superficie del piatto, facendo toccare lo sferoide sul fondo del piatto. Di conseguenza, le cellule dello sferoide si diffondono sulla superficie bidimensionale (2D), rompendo la morfologia tridimensionale (3D) dello sferoide. Aumentare il volume del collagene è una soluzione efficiente, ma costosa. Per evitare che le cellule si diffondano sulla superficie 2D, pur mantenendo un volume minimo di collagene, abbiamo sviluppato un dispositivo di imaging sferoide (SID) delimitando un inserto in polidimetilossano a 3 fori (PDMS) spesso 1 mm su un piatto inferiore di vetro.
La seconda sfida del saggio sferoide è l'etichettatura delle cellule tumorali negli sferoidi, che è limitata dalla scarsa penetrazione di anticorpi e coloranti fluorescenti, un effetto che aumenta con le dimensioni dello sferoide. Mentre la soluzione ideale per etichettare le cellule è la creazione di linee cellulari che esprimono stabilmente proteine fluorescenti, questa opzione è per lo più limitata alle linee cellulari immortalate ed è limitata dalla disponibilità di chimere proteiche fluorescenti. Qui descriviamo un protocollo ottimizzato per la colorazione immunofluorescenza di sferoidi fissi, nonché l'uso efficiente di un colorante citoplasmatico per etichettare le cellule immediatamente prima di incorporare lo sferoide.
La terza sfida del saggio sferoide è la mancanza di semplici macro delle Fiji per la quantificazione semi-automatizzata dell'invasione cellulare nel tempo. Per affrontare questa sfida, descriviamo una semplice metodologia per analizzare l'area dello sferoide nel tempo. Illustriamo i vantaggi di questo protocollo utilizzando le linee cellulari 4T1 e 67NR come esempi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 N NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>60-014-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>SH30028.LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>T1048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti cortactin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33333</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti E-cadherin antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>1 to 100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine atelocollagen I solution (Nutragen)</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>501050ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red CMTPX Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable container</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td>Plastic cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht nuclear stain</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>S25371A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish (glass bottom dish)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6385-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>655204-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model

L'invasione delle cellule tumorali dal tumore primario nei tessuti sani adiacenti è un primo passo nella metastasi. Le cellule tumorali invasive rappresentano una sfida clinica importante perché non esiste un metodo efficiente per la loro eliminazione una volta avviata la loro diffusione. Una migliore comprensione dei meccanismi che regolano l'invasione delle cellule tumorali può portare allo sviluppo di nuove terapie potenti. A causa della loro fisiologica somiglianza con i tumori, gli sferoidi incorporati nel collagene sono stati ampiamente utilizzati dai ricercatori per studiare i meccanismi che regolano l'invasione delle cellule tumorali nella matrice extracellulare (ECM). Tuttavia, questo saggio è limitato da (1) una mancanza di controllo sull'incorporamento degli sferoidi nell'ECM; (2) costo elevato del collagene I e delle stoviglie di fondo in vetro, (3) etichettatura immunofluorescente inaffidabile, a causa dell'inefficiente penetrazione di anticorpi e coloranti fluorescenti e (4) elaborazione delle immagini dispendiosa in termini di tempo e quantificazione dei dati. Per affrontare queste sfide, abbiamo ottimizzato il protocollo sferoide tridimensionale (3D) per immaginire cellule tumorali etichettate fluorescentmente incorporate nel collagene I, utilizzando video time-lapse o imaging longitudinale, e analizzare l'invasione delle cellule tumorali. In primo luogo, descriviamo la fabbricazione di un dispositivo di imaging sferoide (SID) per incorporare sferoidi in modo affidabile e in un volume minimo di collagene I, riducendo il costo del saggio. Successivamente, delimitiamo i passaggi per l'etichettatura a fluorescenza robusta di sferoidi vivi e fissi. Infine, offriamo una macro Fiji facile da usare per l'elaborazione delle immagini e la quantificazione dei dati. Complessivamente, questa semplice metodologia fornisce una piattaforma affidabile e conveniente per monitorare l'invasione delle cellule tumorali nel collagene I. Inoltre, questo protocollo può essere facilmente modificato per soddisfare le esigenze degli utenti.

Grazie alla sua biocompatibilità, PDMS è ampiamente utilizzato per la microfabbricazione di pozzi confinanti, francobolli e stampi, che ha rivoluzionato il micropatterning e i dispositivi microfluidici. Nel metodo qui descritto, viene utilizzato per creare SID, pozzi personalizzabili che ottimizzano l'incorporamento dello sferoide e la procedura di imaging. La figura 1 illustra i principali componenti utilizzati nella fabbricazione dei SID. Per lanciare lo stampo PDMS, viene stampato 3D un...

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Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

Presentato qui è un protocollo per la fabbricazione di un dispositivo di imaging sferoide. Questo dispositivo consente l'imaging a fluorescenza dinamica o longitudinale degli sferoidi delle cellule tumorali. Il protocollo offre anche una semplice procedura di elaborazione delle immagini per l'analisi dell'invasione delle cellule tumorali.

Imaging a fluorescenza risolta nel tempo e analisi dell'invasione delle cellule tumorali nel modello sferoide 3D

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

Questo protocollo può essere utilizzato per studiare i meccanismi che regolano l'invasione delle cellule tumorali nella matrice extracellulare in tempo reale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza un semplice dispositivo di imaging sferoide, che rende il test di invasione dello sferoide più facile da configurare e migliora la sua efficienza e costo. Mentre dimostriamo usando il saggio di invasione sferoide per modellare il carcinoma mammario, questo saggio è un modello eccellente per l'invasione di qualsiasi tumore solido nel tessuto sano circostante.Dopo la stampa 3D del distanziale, pesare un rapporto 10:1 tra polimero di base e cross-linker in una tazza di plastica e utilizzare una pipetta monouso per mescolare accuratamente la soluzione PDMS risultante nella tazza. Posizionare la tazza in una camera a vuoto e rilasciare rapidamente la pressione del vuoto per rimuovere l'aria intrappolata sulla superficie della miscela e dissipare le bolle d'aria rimanenti. Incubare il distanziale stampato in 3D a 100 gradi Celsius per cinque minuti per aumentarne la flessibilità e pulire due lastre di vetro con isopropanolo al 100%.Posizionare il distanziale in modo che sia a filo tra le due piastre pulite e posizionare due grandi clip del legante sul bordo inferiore e una sull'angolo superiore per sigillare lo stampo sui bordi esterni delle piastre. Ispezionare la parte superiore dello stampo per assicurarsi che il distanziale sia a filo con le piastre di vetro e utilizzare una pipetta monouso con circa due centimetri tagliati dalla punta per aggiungere lentamente ma continuamente la miscela PDMS all'angolo in alto a sinistra dello stampo. Una volta riempito l'intero stampo, posizionare lo stampo nella camera a vuoto per rimuovere eventuali bolle d'aria che si sono formate, prima di polimerizzarlo per un'ora a 100 gradi Celsius.Alla fine dell'incubazione, posizionare lo stampo a temperatura ambiente. Quando è fresco al tatto, rimuovere le clip del legante e le lastre di vetro dal distanziale contenente il PDMS polimerizzato e utilizzare una lama di rasoio per tagliare la guarnizione che è stata creata su tutti e quattro i lati dello stampo tra il distanziale e la piastra di vetro. Smontare lo stampo per rivelare il foglio PDMS nel distanziale e utilizzare le pinzette per rimuovere con cura il foglio PDMS dal distanziale.Posizionare il foglio su un tappetino da taglio e utilizzare un punzone di biopsia per perforare un disco PDMS di 17,5 millimetri di diametro, quindi perforare tre fori di 5,5 millimetri distribuiti uniformemente nel disco. Utilizzare il nastro adesivo per rimuovere eventuali particelle di polvere da ogni inserto e attaccare gli inserti puliti su un pezzo di nastro a doppia parte. Avvolgere il nastro intorno al coperchio di una piastra di Petri di 10 centimetri e posizionare il coperchio in una macchina al plasma insieme a piatti di fondo in vetro aperti da 35 millimetri.Attivare gli inserti e il vetro con un minuto di trattamento al plasma a 300 millitorrs e utilizzare una pinzetta per attaccare rapidamente il lato trattato di ogni inserto alla parte in vetro di un piatto inferiore in vetro trattato per inserto. Una volta applicati tutti gli inserti, utilizzare il dito e il pollice del puntatore per applicare una pressione uniforme su ogni inserto ruotando il piatto per fissare saldamente gli inserti alle stoviglie. Una volta fissati tutti gli inserti, incubare i dispositivi di imaging sferoide risultanti per 20 minuti a 60 gradi Celsius, prima di eseguire un secondo ciclo di trattamento al plasma come dimostrato.Dopo il secondo trattamento, aggiungere 35 microlitri di soluzione di rivestimento appena preparata ad ogni foro di inserto. Dopo un'ora a temperatura ambiente, rimuovere la soluzione di rivestimento e risciacquare il dispositivo tre volte con acqua distillata. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 35 microlitri di soluzione di cross-linking ad ogni foro per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente.Al termine dell'incubazione, sciacquare il dispositivo tre volte con acqua distillata come dimostrato, prima di riempire ogni dispositivo con 70%etanolo per un'incubazione di 30 minuti sotto la luce UV. Al termine della sterilizzazione, sciacquare i dispositivi tre volte con acqua distillata e aggiungere 2,5 millilitri di soluzione di stoccaggio a ciascun dispositivo. Per incorporare gli sferoidi nel collagene, lavare i dispositivi tre volte con tre millilitri di PBS per lavaggio.Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare asciugare completamente i dispositivi, prima di aggiungere uno sferoide in 30 microlitri di college appena preparato una soluzione in un unico foro dell'inserto e avviare un timer. Dopo aver confermato la presenza dello sferoide nel foro, aggiungere sferoidi agli altri due fori come dimostrato. Utilizzare una punta di pipetta da 10 microliter per recentizzare tutti gli sferoidi che si trovano vicino al bordo pdms o per separare gli sferoidi se vengono dispensati più sferoidi e arrestare il timer.Per centrare verticalmente lo sferoide nello strato di collagene, dopo la semina, capovolgere il dispositivo e incubare il dispositivo a 37 gradi fino a quando il collagene non si polimerizza, invertendo l'orientamento del dispositivo ogni due minuti per un totale di 30 minuti, quindi aggiungere 2,5 millilitri di mezzo per dispositivo e acquisire un'immagine degli sferoidi nel momento dell'ora zero. L'uso di un dispositivo di immagine sferoide facilita l'efficiente incorporamento e la registrazione time-lapse dell'invasione delle cellule tumorali all'interno del collagene o tramite l'imaging longitudinale. Mentre questo sferoide è stato immaginato longitudinalmente nel corso di sei giorni richiedendo l'espressione stabile di proteine fluorescenti citoplasmatiche e / o nucleari, un imaging longitudinale simile può essere eseguito in un periodo di tempo più breve utilizzando l'etichettatura della tintura.Gli sferoidi possono anche essere fissati e immunoetichettati. Ad esempio, questi sferoidi sono stati immunoetichettati per epiteliale-cadherina, cortattatina e F-actina. In queste immagini, è possibile osservare un'illustrazione passo-passo della procedura di elaborazione delle immagini utilizzando la macro Fiji per misurare l'area dello sferoide nel tempo.Assicurarsi di erogare un singolo sferoide in ogni foro del dispositivo di imaging sferoide e di posizionare lo sferoide al centro del foro sia in direzione XY che Z. Il design del dispositivo può essere facilmente modificato modificando le dimensioni e la disposizione dei fori, degli inserti e delle stoviglie inferiori in vetro per adattarsi a una maggiore produttività dello sferoide.

Research

JoVE Journal

Biology

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