Name: time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00
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우리는 귀중한 토론을 위해 템플 생명 공학의 회원들에게 감사드립니다. 우리는 3D 프린팅에 도움을 위해 아이디어 허브 (공학 대학, 템플 대학)에서 세포 분류와 토니 Boehm에 대한 그의 도움에 대한 흐름 세포 측정 코어 (루이스 카츠 의과 대학)에서 데이비드 암브로스 감사합니다. 우리는 또한 우리의 자금 자원에 감사: 미국 암 학회 연구 학자 보조금 134415-RSG-20-034-01-CSM, 지금 암 정복 / 젊은 조사자 상, 건강의 국립 연구소, R00 CA172360 및 R01 CA230777, 모두 BG에.

1. 스페로이드 임베딩을 최적화하기 위해 스페로이드 이미징 장치(SID)의 제조(기간 1일)
<ol><li>3D프린터(그림 1A, B 및 보충 파일 1)를사용하여 스페이서를 만듭니다.</li>
	<li>플라스틱 컵에 10:1(wt/wt) 염기 폴리머:크로스링커의 무게를 내밀면 플라스틱 컵에 [예를 들어, 20 g의 에틸벤젠 베이스 폴리머와 실리콘 수지 크로스링커 2 g)를 생성하여 폴리디메틸실록산(PDMS)...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Noone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+cell+spheroid+assay+to+assess+invasion+in+a+3D+setting.">A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).</li><li>T&#246;nisen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP4+receptor+promotes+invadopodia+and+invasion+in+human+breast+cancer.">EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer.</a> European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).</li><li>Bayarmagnai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia-mediated+ECM+degradation+is+enhanced+in+the+G1+phase+of+the+cell+cycle.">Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle.</a> Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Boutin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+imaging+and+nuclear+segmentation+analysis+protocol+for+cleared+3D+culture+models.">A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models.</a> Science Reports. 8, 11135 (2018).</li><li>Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+spheroid+formation+recorded+with+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).</li><li>Marcello, M., Richards, R., Mason, D., S&#233;e, V., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cell+invasion+using+a+multicellular+spheroid+model+and+light-sheet+microscopy.">Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy.</a> Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li></ol>

3D 프린팅 스페이서는 실험 응용 프로그램에서 요구하는 대로 PDMS의 다양한 모양을 쉽게 만드는 데 사용할 수 있는 1mm 두께의 PDMS 시트를 생성하도록 설계되었습니다. 제작의 단순성과 디자인을 변경할 수 있는 자유로 인해 이 PDMS 주조 방법은 SID의 초기 설계를 위해 선택되었습니다. 대량의 SI가 필요한 경우 이미 세 개의 간격 구멍이 있는 PDMS 디스크가 포함된 3D 프렌팅 금형을 만들고 공정을 한 ?...

암 진행 중, 암세포는 연약하고 침습적인 표현형을 취득하여 종양 질량을 탈출하고 주변 조직1로침입할 수 있다. 결국, 이러한 침습성 암세포는 이차 기관 내부에 도달하고 성장할 수 있으며, 암 전이1이라고불리는 과정이다. 전이는 암 관련 사망의 90% 이상을 유발합니다2. 이에 대한 한 가지 이유는 국소화된 종양이 임상적으로 관리가 가능하지만, 일단 전이성 확산이 발생하자 침습적인 암세포의 제거를 위한 효율적인 방법이 존재하지 않는다는 것이다. 따라서 침습적인 암세포의 출현과 국소화된 질환으로의 전환은 주요 임상적 과제를 제기하고 있다. 암세포가 어떻게 침략적인 행동을 시작하고 유지하는지 결정하는 것은 새로운 강력한 치료의 발달로 이끌어 낼 수 있습니다.
3D 스페로이드 모델은 통제하에 암세포의 운동성 거동을 조사하기 에 이상적인 플랫폼이지만 생리적으로 관련된 조건3. 실제로, 이 분석에서, 암세포의 스페로이드는 단순화된 종양을 모방하는 콜라겐 I를, 예를 들면 세포외 매트릭스 (ECM) 안에 내재되어 있습니다. 이어서, 이미징은 스페로이드에서 콜라겐 매트릭스로 암세포의 침입을 시각화하는 데 사용된다. 그러나 여러 가지 과제는 이 절차를 제한합니다.
첫 번째 과제는 액체 콜라겐 매트릭스가 접시 표면에 퍼져 스페로이드가 접시의 바닥을 만질 수있는 포함 단계에서 발생합니다. 따라서, 스페로이드로부터의 세포는 2차원(2D) 표면에 퍼지며, 3차원(3D) 스페로이드 형태를 파괴한다. 콜라겐의 양을 늘리는 것은 효율적이지만 비용이 많이 드는 솔루션입니다. 2D 표면에 세포가 퍼지는 것을 방지하기 위해, 콜라겐의 최소 볼륨을 유지하면서, 우리는 유리 바닥 접시에 삽입 1mm 두께, 3 홀 폴리 디메틸실록산 (PDMS)을 경계하여 스페로이드 이미징 장치 (SID)를 개발했다.
스페로이드 분석법의 두 번째 과제는 스페로이드에 암세포의 라벨링으로, 항체와 형광염의 침투가 불량하여 제한되며, 이는 스페로이드 크기로 증가하는 효과이다. 세포 라벨링에 이상적인 해결책은 형광 단백질을 안정적으로 표현하는 세포주 설립이지만,이 옵션은 대부분 불멸의 세포주로 제한되며 형광 단백질 키메라의 가용성에 의해 제한됩니다. 여기서, 우리는 고정 스페로이드의 면역 형광 염색에 대한 최적화 된 프로토콜뿐만 아니라, 스페로이드를 포함하기 직전에 세포염염료를 라벨링하는 세포염염의 효율적인 사용을 설명합니다.
스페로이드 분석의 세 번째 도전은 시간이 지남에 따라 세포 침공의 반 자동 정량화에 대한 간단한 피지 매크로의 부족이다. 이 문제를 해결하기 위해 시간이 지남에 따라 스페로이드 영역을 분석하는 간단한 방법론을 설명합니다. 우리는 4T1 및 67NR 세포주를 예로 사용하여이 프로토콜의 장점을 설명합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 N NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>60-014-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>SH30028.LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>T1048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti cortactin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33333</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti E-cadherin antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>1 to 100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine atelocollagen I solution (Nutragen)</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>501050ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red CMTPX Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable container</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td>Plastic cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht nuclear stain</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>S25371A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish (glass bottom dish)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6385-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>655204-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model

1차 종양에서 인접한 건강한 조직으로암세포의 침입은 전이의 초기 단계이다. 침략적인 암세포는 그들의 보급이 진행되는 후에 그들의 제거를 위한 능률적인 방법이 없기 때문에 중요한 임상 도전을 제기합니다. 암 세포 침략을 통제하는 기계장치의 더 나은 이해는 새로운 강력한 치료의 발달로 이끌어 낼 수 있습니다. 종양에 그들의 생리적 유사성 때문에, 콜라겐에 내장된 spheroids 나는 세포외 매트릭스로 암 세포 침략을 관장하는 기계장치를 연구하기 위하여 연구원에 의해 광범위하게 이용되었습니다 (ECM). 그러나, 이러한 분석은 (1) ECM에 스페로이드를 포함시키는 것에 대한 통제의 부족에 의해 제한됩니다. (2) 콜라겐 I 및 유리 바닥 접시의 높은 비용, (3) 신뢰할 수 없는 면역 형광 라벨링, 항체및 형광 염료의 비효율적인 침투및 (4) 시간이 많이 소요되는 이미지 처리 및 데이터의 정량화로 인해. 이러한 과제를 해결하기 위해, 우리는 시간 경과 비디오 또는 세로 이미징을 사용하여 콜라겐 I에 내장 된 형광 라벨 암 세포를 이미지하고 암세포 침공을 분석하기 위해 3차원 (3D) 스페로이드 프로토콜을 최적화했습니다. 먼저, 스페로이드 이미징 장치(SID)의 제조를 사용하여 스페로이드를 안정적으로 그리고 최소한의 콜라겐 I 부피로 조립하여 분석 비용을 절감하는 방법을 설명합니다. 다음으로, 우리는 라이브 및 고정 스페로이드의 강력한 형광 라벨링을위한 단계를 설명합니다. 마지막으로 이미지 처리 및 데이터 정량화를 위해 사용하기 쉬운 피지 매크로를 제공합니다. 전부, 이 간단한 방법론은 콜라겐 I에 있는 암 세포 침략을 감시하는 믿을 수 있고 적당한 플랫폼을 제공합니다. 또한 이 프로토콜은 사용자의 요구에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다.

생체 적합성으로 인해 PDMS는 마이크로 패턴 및 미세 유체 장치에 혁명을 일으킨 유정, 우표 및 금형을 제한하는 미세 제조에 널리 사용됩니다. 여기에 설명된 방법에서, 스페로이드 임베딩 및 이미징 절차를 최적화하는 맞춤형 웰인 SID를 만드는 데 사용됩니다. 도 1은 SI의 제조에 사용되는 주요 구성 요소를 보여 줍니다. PDMS 금형을 캐스팅하기 위해 1mm 두께의 스페이서가 3D<s...

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Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

여기에 제시된 스페로이드 이미징 장치의 제조를 위한 프로토콜이 있습니다. 이 장치는 암 세포 스페로이드의 동적 또는 세로 형광 이미징을 가능하게합니다. 이 프로토콜은 또한 암세포 침입의 분석을 위한 간단한 화상 처리 절차를 제공합니다.

3D 스페로이드 모델에서 암세포 침입의 시간 해결 형광 화상 진찰 및 분석

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

이 프로토콜은 실시간으로 세포 외 매트릭스로 암세포의 침입을 지배하는 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 스페로이드 침입 분석법을 쉽게 설정하고 효율성과 비용을 향상시키는 간단한 스페로이드 이미징 장치를 사용한다는 것입니다. 우리는 유방 암종을 모델링하기 위해 스페로이드 침입 분석기를 사용하여 시연하는 동안,이 분석은 주변 의 건강한 조직에 어떤 고형 종양의 침입을위한 훌륭한 모델입니다.스페이서의 3D 프린팅 후, 플라스틱 컵에서 크로스 링커에 기본 폴리머의 10:1 비율을 밖으로 무게와 철저하게 컵에 결과 PDMS 솔루션을 혼합 일회용 파이펫을 사용합니다. 컵을 진공 챔버에 넣고 진공 압력을 신속하게 방출하여 혼합물 표면에 갇힌 공기를 제거하고 나머지 기포를 방출합니다. 3D 프린팅 스페이서를 섭씨 100도에서 5분간 배양하여 유연성을 높이고 100%의 이소프로파놀로 두 개의 유리 판을 청소합니다.스페이서를 두 개의 청소된 플레이트 사이에 플러시하고 두 개의 큰 바인더 클립을 아래쪽 가장자리에 놓고 상단 모서리에 두 개의 큰 바인더 클립을 배치하여 금형을 플레이트의 바깥쪽 가장자리에 밀봉합니다. 금형의 상단 부분을 검사하여 스페이서가 유리 판으로 플러시되도록 하고 팁에서 약 2센티미터 잘라낸 일회용 파이펫을 사용하여 천천히 하지만 지속적으로 PDMS 혼합물을 금형의 왼쪽 상단 모서리에 추가합니다. 전체 금형이 채워지면 금형을 진공 챔버에 넣고 형성된 기포를 제거한 후 100°C에서 1시간 동안 PDMS를 경화합니다.인큐베이션의 끝에, 실온에서 금형을 배치합니다. 터치가 식으면 경화 PDMS를 포함하는 스페이서에서 바인더 클립과 유리 판을 제거하고 면도날을 사용하여 스페이서와 유리 판 사이의 금형의 네 면 모두에 생성된 씰을 잘라냅니다. 금형을 분리하여 스페이서에 PDMS 시트를 표시하고 핀셋을 사용하여 스페이서에서 PDMS 시트를 조심스럽게 벗깁니다.시트를 커팅 매트에 놓고 생검 펀치를 사용하여 17.5밀리미터 직경의 PDMS 디스크를 펀치한 다음 5.5mm 구멍을 고르게 분산하여 디스크에 펀치합니다. 테이프를 사용하여 각 인서트에서 먼지 입자를 제거하고 청소된 인서트를 양면 테이프 조각에 고정합니다. 테이프를 10센티미터 페트리 접시 뚜껑에 감싸고 뚜껑을 플라즈마 기계에 넣고 35mm 유리 바닥 접시를 엽니다.300밀리터에서 1분간의 플라즈마 처리로 인서트와 유리를 활성화하고 핀셋을 사용하여 각 인서트의 처리된 측면을 인서트당 1개의 처리된 유리 부분의 유리 부분에 신속하게 부착합니다. 모든 인서트가 적용된 경우 포인터 손가락과 엄지 손가락을 사용하여 접시를 회전시키면서 각 인서에 압력을 가하여 접시에 인서트를 단단히 부착합니다. 모든 인서트가 확보되면, 입증된 바와 같이 2차 플라즈마 처리를 수행하기 전에 결과 스페로이드 이미징 장치를 섭씨 60도에서 20분 동안 배양한다.두 번째 처리 후, 각 삽입 구멍에 갓 준비 된 코팅 용액 35 마이크로 리터를 추가합니다. 실온에서 1 시간 후, 코팅 용액을 제거하고 증류수로 장치를 세 번 헹구는다. 마지막 세척 후, 실온에서 30 분 배양에 대한 각 구멍에 교차 연결 솔루션의 35 마이크로 리터를 추가합니다.인큐베이션이 끝나면, 각 장치를 UV 빛 아래에서 30분 동안 70%에탄올로 채우기 전에 입증된 대로 증류수로 장치를 세 번 헹구는 다. 멸균이 끝나면 증류수로 장치를 세 번 헹구고 각 장치에 2.5 밀리리터의 저장 솔루션을 추가합니다. 콜라겐에 스페로이드를 포함하려면 세척당 PBS 3밀리리터로 장치를 세 번 세척합니다.마지막 세척 후, 장치가 완전히 건조 할 수 있도록, 삽입의 한 구멍에 갓 준비 된 대학 하나의 솔루션의 30 마이크로 리터에 하나의 스페로이드를 추가하고 타이머를 시작하기 전에. 구멍에 스페로이드의 존재를 확인한 후, 입증된 대로 다른 두 구멍에 스페로이드를 추가합니다. 10 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 PDMS 테두리 근처에 있는 모든 스페로이드를 다시 중앙에 배치하거나 여러 스페로이드를 분배하고 타이머를 중지하는 경우 스페로이드를 분리합니다.콜라겐 층에서 스페로이드를 수직으로 중심으로, 시드 후, 장치를 거꾸로 뒤집어 콜라겐이 중합화될 때까지 장치를 37도에서 배양하고, 총 30분 동안 2분마다 장치 방향을 반전한 다음, 장치당 2.5 밀리리터의 매체를 추가하고 0시간 지점에서 스퍼로이드 의 이미지를 획득한다. 스페로이드 이미지 장치를 사용하면 콜라겐 내 또는 세로 이미징을 통해 암세포 침입의 효율적인 포함 및 시간 경과 기록을 용이하게 합니다. 이 스페로이드는 세포질 및/또는 핵 형광 단백질의 안정적인 발현을 요구하는 6일 동안 세로로 이미지되었지만, 유사한 세로 화상 진찰은 염료 라벨링을 사용하여 짧은 기간 동안 수행될 수 있다.스페로이드는 또한 고정및 면역 표지될 수 있습니다. 예를 들어, 이러한 스페로이드는 상피-카데린, 코타틴 및 F-액틴용 면역 라벨을 부착했다. 이러한 이미지에서, 시간이 지남에 따라 스페로이드의 영역을 측정하기 위해 피지 매크로를 사용하여 이미지 처리 절차의 단계별 그림을 관찰할 수 있다.스페로이드 이미징 장치의 각 구멍에 단일 스페로이드를 분배하고 XY 및 Z 방향 모두에서 구멍의 중앙에 스페로이드를 배치해야합니다. 장치 설계는 더 높은 스페로이드 처리량을 수용하기 위해 구멍, 인서트 및 유리 바닥 접시의 크기와 배열을 변경하여 쉽게 수정할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

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연구

생물학

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Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

3D 회전 타원체 생산을위한 효율적이고 유연한 셀 집계 방법

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Zebrafish 독도에서 단일 셀 해상도 칼슘 이미징 사용 하 여 베타 세포 기능 분석

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

3차원 오가노이드 및 스페로이드 모델의 염색 및 고해상도 이미징

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...