Name: time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

Vi vil gjerne takke medlemmer av Temple Bioengineering for verdifulle diskusjoner. Vi takker David Ambrose ved flytcytometrikjernen (Lewis Katz School of Medicine) for hans hjelp med cellesortering og Tony Boehm fra IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) for hjelp med 3D-utskriften. Vi takker også våre finansieringsressurser: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 og R01 CA230777, alt til BG.

1. Fabrikasjon av en Spheroid Imaging Device (SID) for å optimalisere sfæroid innebygging (Varighet 1 dag)
<ol><li>Opprett avstandsbryteren ved hjelp av en 3D-skriver (figur 1A, B og tilleggsfil 1).</li>
	<li>Vei ut et 10:1 (wt/wt) forhold mellom basepolymer:crosslinker i en plastkopp [f.eks. 20 g etylbenzenbasepolymer og 2 g silikonharpikskrysslinker for å lage polydimetylsiloxane (PDMS)].</li>
	<li>Bland PDMS-løsningen grundig i plastkoppen ved hjelp av en engangspip...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Noone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+cell+spheroid+assay+to+assess+invasion+in+a+3D+setting.">A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).</li><li>T&#246;nisen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP4+receptor+promotes+invadopodia+and+invasion+in+human+breast+cancer.">EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer.</a> European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).</li><li>Bayarmagnai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia-mediated+ECM+degradation+is+enhanced+in+the+G1+phase+of+the+cell+cycle.">Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle.</a> Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Boutin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+imaging+and+nuclear+segmentation+analysis+protocol+for+cleared+3D+culture+models.">A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models.</a> Science Reports. 8, 11135 (2018).</li><li>Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+spheroid+formation+recorded+with+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).</li><li>Marcello, M., Richards, R., Mason, D., S&#233;e, V., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cell+invasion+using+a+multicellular+spheroid+model+and+light-sheet+microscopy.">Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy.</a> Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li></ol>

3D-utskrevne avstandssnitt ble designet for å lage 1 mm tykke ark med PDMS som deretter enkelt kan brukes til å lage ulike former for PDMS, som kreves av eksperimentelle applikasjoner. På grunn av enkelheten i fabrikasjonen og friheten til å endre designen, ble denne metoden for PDMS-støping valgt for den første utformingen av SID. Hvis det kreves høyt volum av SIDer, kan produksjonen gjøres mer effektiv ved å opprette en 3D-trykt form, som allerede inneholder PDMS-disker med tre like avstandshull, og redusere p...

Under kreftprogresjon kan kreftceller skaffe seg en motil og invasiv fenotype, slik at de kan unnslippe tumormassen og invadere inn i det omkringliggendevevet 1. Til slutt kan disse invasive kreftcellene nå og vokse inne i sekundære organer, en prosess som kalles kreftmetastase1. Metastase forårsaker mer enn 90% av kreftrelaterte dødsfall2. En grunn til dette er at mens lokaliserte svulster er klinisk håndterbare, finnes det ingen effektive metoder for eliminering av invasive kreftceller når metastatisk spredning har oppstått. Derfor utgjør fremveksten av invasive kreftceller og overgangen fra en lokalisert til en invasiv sykdom en stor klinisk utfordring. Å bestemme hvordan kreftceller initierer og opprettholder en invasiv atferd kan føre til utvikling av nye potente terapier.
3D-sfæroidmodellen er en ideell plattform for å undersøke motile oppførsel av kreftceller under kontrollerte, men fysiologisk relevante forhold3. Faktisk, i denne analysen, er sfæroider av kreftceller innebygd i ekstracellulær matrise (ECM), for eksempel kollagen I, som etterligner en forenklet svulst. Deretter brukes avbildning til å visualisere invasjonen av kreftceller fra sfæroiden til kollagenmatrisen. Flere utfordringer begrenser imidlertid denne prosedyren.
Den første utfordringen oppstår ved innebyggingstrinnet, hvor den flytende kollagenmatrisen kan spre seg over paraboloverflaten, noe som får sfæroiden til å berøre bunnen av parabolen. Følgelig spredte celler fra sfæroid på den todimensjonale (2D) overflaten, og brøt den tredimensjonale (3D) sfæroidmorfologien. Å øke volumet av kollagen er en effektiv, men kostbar løsning. For å hindre at celler sprer seg på 2D-overflaten, samtidig som vi opprettholder et minimalt volum kollagen, utviklet vi en spheroid bildeenhet (SID) ved å avgrense en 1 mm tykk, 3-hulls polydimetylsiloxane (PDMS) innsats på en glassbunnsrett.
Den andre utfordringen med sfæroidanalysen er merking av kreftceller i sfæroider, som er begrenset av dårlig penetrasjon av antistoffer og fluorescerende fargestoffer, en effekt som øker med sfæroidstørrelse. Mens den ideelle løsningen for merking av celler er etableringen av cellelinjer stabilt uttrykker fluorescerende protein(er), er dette alternativet for det meste begrenset til udødeliggjorte cellelinjer og er begrenset av tilgjengeligheten av fluorescerende protein chimeras. Her beskriver vi en optimalisert protokoll for immunofluorescence farging av faste sfæroider, samt effektiv bruk av et cytoplasmatisk fargestoff for å merke celler umiddelbart før du bygger inn sfæroid.
Den tredje utfordringen med spheroid analysen er mangelen på enkle Fiji-makroer for halvautomatisk kvantifisering av celleinvasjon over tid. For å løse denne utfordringen beskriver vi en enkel metodikk for å analysere spheroidområdet over tid. Vi illustrerer fordelene med denne protokollen ved hjelp av 4T1- og 67NR-cellelinjene som eksempler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 N NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>60-014-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>SH30028.LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>T1048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti cortactin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33333</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti E-cadherin antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>1 to 100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine atelocollagen I solution (Nutragen)</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>501050ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red CMTPX Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable container</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td>Plastic cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht nuclear stain</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>S25371A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish (glass bottom dish)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6385-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>655204-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model

Invasjonen av kreftceller fra den primære svulsten inn i det tilstøtende sunne vevet er et tidlig skritt i metastase. Invasive kreftceller utgjør en stor klinisk utfordring fordi det ikke finnes noen effektiv metode for eliminering når spredningen er i gang. En bedre forståelse av mekanismene som regulerer kreftcelleinvasjon kan føre til utvikling av nye potente terapier. På grunn av deres fysiologiske likhet med svulster, sfæroider innebygd i kollagen har jeg blitt mye brukt av forskere for å studere mekanismene som styrer kreftcelleinvasjon i den ekstracellulære matrisen (ECM). Denne analysen er imidlertid begrenset av (1) mangel på kontroll over innebygging av sfæroider i ECM; (2) høye kostnader for kollagen I og glass bunnretter, (3) upålitelig immunofluorescent merking, på grunn av ineffektiv penetrasjon av antistoffer og fluorescerende fargestoffer og (4) tidkrevende bildebehandling og kvantifisering av dataene. For å løse disse utfordringene optimaliserte vi den tredimensjonale (3D) sfæroidprotokollen til bilde fluorescerende merkede kreftceller innebygd i kollagen I, enten ved hjelp av time-lapse videoer eller langsgående bildebehandling, og analysere kreftcelleinvasjon. Først beskriver vi fabrikasjonen av en sfæroid bildeenhet (SID) for å bygge inn sfæroider pålitelig og i et minimalt kollagen I-volum, noe som reduserer analysekostnaden. Deretter avgrenser vi trinnene for robust fluorescensmerking av levende og faste sfæroider. Til slutt tilbyr vi en brukervennlig Fiji-makro for bildebehandling og datakvantifisering. Til sammen gir denne enkle metodikken en pålitelig og rimelig plattform for å overvåke kreftcelleinvasjon i kollagen I. Videre kan denne protokollen enkelt endres for å passe brukernes behov.

På grunn av sin biokompatibilitet er PDMS mye brukt til mikrofabrikasjon av begrensende brønner, frimerker og former, som revolusjonerte mikrobryttering og mikrofluidiske enheter. I metoden som er beskrevet her, brukes den til å lage SIDer, tilpassbare brønner som optimaliserer sfæroid innebygging og bildebehandlingsprosedyre. Figur 1 illustrerer de viktigste komponentene som brukes i fabrikasjonen av SIDer. For å kaste PDMS-formen er en 1 mm tykk avstandss avstandssmør 3D-trykt (<str...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

Presentert her er en protokoll for fabrikasjon av en sfæroid bildeenhet. Denne enheten muliggjør dynamisk eller langsgående fluorescensavbildning av kreftcellesfæroider. Protokollen tilbyr også en enkel bildebehandlingsprosedyre for analyse av kreftcelleinvasjon.

Tid-løst fluorescens imaging og analyse av kreft celle invasjon i 3D sfæroid modell

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

Denne protokollen kan brukes til å studere mekanismene som styrer invasjonen av kreftceller i den ekstracellulære matrisen i sanntid. Den største fordelen med denne teknikken er at den bruker en enkel sfæroid bildeenhet, noe som gjør spheroid invasjonsanalysen lettere å sette opp og forbedrer effektiviteten og kostnaden. Mens vi demonstrerer ved hjelp av spheroid invasjonsanalyse for å modellere mammary karsinom, er denne analysen en utmerket modell for invasjonen av en solid svulst i det omkringliggende sunne vevet.Etter 3D-utskrift av avstandsspennen, kan du vekte ut et 10:1-forhold mellom basepolymer og krysskobling i en plastkopp og bruke en engangspipette til å blande den resulterende PDMS-løsningen grundig i koppen. Plasser koppen i et vakuumkammer og slipp raskt vakuumtrykket for å fjerne luft som er fanget på overflaten av blandingen og for å spre de gjenværende luftboblene. Inkuber 3D-trykt avstandss avstandss 100 grader Celsius i fem minutter for å øke fleksibiliteten og rengjøre to glassplater med 100% isopropanol.Plasser avstandsspylet slik at det skylles mellom de to rengjorte platene og legg to store bindemiddelklemmer på nedre kant og en på øverste hjørne for å forsegle formen på ytterkantene av platene. Inspiser den øverste delen av formen for å sikre at avstandsspylet er i flukt med glassplatene og bruk en engangspipette med ca. to centimeter kuttet fra spissen for å sakte, men kontinuerlig legge PDMS-blandingen til øverste venstre hjørne av formen. Når hele formen er fylt, legg formen i vakuumkammeret for å fjerne eventuelle luftbobler som har dannet seg, før du herder PDMS i en time ved 100 grader Celsius.På slutten av inkubasjonen, plasser formen ved romtemperatur. Når det er kult å ta på, fjern bindemiddelklemmene og glassplatene fra avstandssedemeren som inneholder de herdede PDMS og bruker et barberblad til å skjære gjennom forseglingen som ble opprettet på alle fire sidene av formen mellom avstandsslyset og glassplaten. Trekk fra hverandre formen for å avsløre PDMS-arket i avstandsskjørtet og bruk pinsett til å forsiktig skrelle PDMS-arket av avstandssrommet.Plasser arket på en skjærematte og bruk en biopsipunch for å slå ut en PDMS-plate med 17,5 millimeter diameter, og slå deretter tre jevnt fordelte 5,5 millimeter hull inn i platen. Bruk tape for å fjerne støvpartikler fra hver innsats og stikke de rengjorte innsatsene på et stykke dobbeltsidig tape. Pakk båndet rundt lokket på en 10 centimeter petriskål og legg lokket i en plasmamaskin sammen med åpne 35 millimeter glassbunnsretter.Aktiver innsatser og glass med ett minutt plasmabehandling på 300 millitorrs og bruk pinsett for raskt å feste den behandlede siden av hvert innlegg til glassdelen av en behandlet glassbunnsrett per innsats. Når alle innsatsene er påført, bruk pekefingeren og tommelen til å legge jevnt press på hver innsats mens du roterer parabolen for å feste innsatsene sikkert til oppvasken. Når alle innsatsene er sikret, inkuber de resulterende sfæroidbildeenhetene i 20 minutter ved 60 grader Celsius, før du utfører en ny runde plasmabehandling som vist.Etter den andre behandlingen, tilsett 35 mikroliter med nylaget beleggløsning til hvert innsatshull. Etter en time ved romtemperatur, fjern beleggoppløsningen og skyll enheten tre ganger med destillert vann. Etter siste vask, tilsett 35 mikroliter krysskoblingsløsning til hvert hull for en 30-minutters inkubasjon ved romtemperatur.På slutten av inkubasjonen, skyll enheten tre ganger med destillert vann som demonstrert, før du fyller hver enhet med 70% etanol for en 30-minutters inkubasjon under UV-lys. På slutten av steriliseringen, skyll enhetene tre ganger med destillert vann og tilsett 2,5 ml lagringsløsning til hver enhet. For å bygge inn sfæroider i kollagen, vask enhetene tre ganger med tre milliliter PBS per vask.Etter den siste vasken, la enhetene tørke helt, før du legger til en sfæroid i 30 mikroliter av nylaget college en løsning i ett hull på innsatsen og starter en timer. Etter å ha bekreftet tilstedeværelsen av sfæroid i hullet, legg sfæroider til de to andre hullene som demonstrert. Bruk en 10 mikroliter pipettespiss til nyere sfæroider som ligger nær PDMS-grensen, eller for å skille sfæroidene hvis flere sfæroider dispenseres og stopper timeren.For å vertikalt sentrere spheroiden i kollagenlaget, snu enheten opp ned og inkubere enheten ved 37 grader til kollagenpolymerer, reversere enhetens orientering hvert andre minutt i totalt 30 minutter, og legg deretter til 2,5 milliliter medium per enhet og få et bilde av sfæroidene på null timers tidspunkt. Ved hjelp av en sfæroid bildeenhet forenkler effektiv innebygging og time-lapse opptak av kreftcelleinvasjon i kollagen eller via langsgående bildebehandling. Mens denne sfæroiden ble avbildet langsgående i løpet av seks dager som krever stabilt uttrykk for cytoplasmatiske og/ eller kjernefysiske fluorescerende proteiner, kan lignende langsgående bildebehandling utføres over en kortere tidsperiode ved hjelp av fargestoffmerking.Sfæroider kan også festes og immunolabeled. For eksempel ble disse sfæroidene immunolabeled for epitel-cadherin, kortactin og F-actin. I disse bildene kan en trinnvis illustrasjon av bildebehandlingsprosedyren ved hjelp av Fiji-makroen til å måle området av sfæroidet over tid observeres.Pass på å føre en enkelt sfæroid inn i hvert hull i spheroid bildeenheten og for å plassere sfæroid i midten av hullet i både XY og Z retninger. Enhetsdesignen kan enkelt endres ved å endre størrelsen og arrangementet av hullene, innsatsene og glassbunnsrettene for å imøtekomme en høyere sfæroid gjennomstrømning.

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-basert Måling av Store-opererte Calcium Entry i levende celler: fra Helstøpt Cancer Cell til Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Kvantitativ analyse av Autophagy med Avansert 3D fluorescens mikroskopi

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Leve Imaging av apoptotiske Cell Lagersalg under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse av mRNA molekyler med fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Rapid Analyse og Utforskning av fluorescens mikros Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

En effektiv og fleksibel Cell Aggregation metode for 3D spheroid Produksjon

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Analyse av Beta-celle-funksjonen bruker encellede oppløsning kalsium Imaging i sebrafisk holmer

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Oligomerisering Dynamics av Cell Surface reseptorer i levende celler av total intern refleksjon fluorescens mikroskopi kombinert med tall og lysstyrke analyse

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Farging og høyoppløselig avbildning av tredimensjonale organoid- og sfæroidmodeller

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...