Name: time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить членов Temple Bioengineering за ценные дискуссии. Мы благодарим Дэвида Амброуза в центре цитометрии потока (Школа медицины Льюиса Каца) за помощь в сортировке клеток и Тони Бёма из IdeaS Hub (Колледж инженерии, Университет Темпл) за помощь в 3D-печати. Мы также благодарим наши ресурсы финансирования: Американское онкологическое общество научно-исследовательский грант 134415-RSG-20-034-01-CSM, Победить рак сейчас / Молодые следователи премии, Национальные институты здравоохранения, R00 CA172360 и R01 CA230777, все для BG.

1. Изготовление устройства для визуализации сфероидов (SID) для оптимизации встраивания сфероидов (длительность 1 день)
<ol><li>Создайте спейсер с помощью 3D-принтера(рисунок 1A, B и дополнительный файл 1).</li>
	<li>Взвесить соотношение базового полимера 10:1 (wt/wt) в пластико?...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Noone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+cell+spheroid+assay+to+assess+invasion+in+a+3D+setting.">A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).</li><li>T&#246;nisen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP4+receptor+promotes+invadopodia+and+invasion+in+human+breast+cancer.">EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer.</a> European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).</li><li>Bayarmagnai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia-mediated+ECM+degradation+is+enhanced+in+the+G1+phase+of+the+cell+cycle.">Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle.</a> Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Boutin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+imaging+and+nuclear+segmentation+analysis+protocol+for+cleared+3D+culture+models.">A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models.</a> Science Reports. 8, 11135 (2018).</li><li>Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+spheroid+formation+recorded+with+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).</li><li>Marcello, M., Richards, R., Mason, D., S&#233;e, V., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cell+invasion+using+a+multicellular+spheroid+model+and+light-sheet+microscopy.">Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy.</a> Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li></ol>

3D печатный спейсер был разработан для создания 1-мм толщиной листов PDMS, которые затем могут быть использованы для легкого создания различных форм PDMS, как того требуют экспериментальные приложения. Благодаря простоте его изготовления и свободе изменять конструкцию, этот метод литья PDMS ?...

Во время прогрессирования рака, раковые клетки могут приобрести пестрый и инвазивный фенотип, что позволяет им избежать опухолевой массы и вторгнуться в окружающиеткани 1. В конце концов, эти инвазивные раковые клетки могут достичь и расти внутри вторичных органов, процесс, называемый метастазированиерака 1. Метастазы вызывает более 90% смертей, связанных с раком2. Одна из причин этого заключается в том, что, хотя локализованные опухоли клинически управляемы, эффективных методов для ликвидации инвазивных раковых клеток после метастатического распространения не существует. Таким образом, появление инвазивных раковых клеток и переход от локализованных к инвазивным заболеваниям создает серьезную клиническую проблему. Определение того, как раковые клетки инициировать и поддерживать инвазивное поведение может привести к разработке новых мощных методов лечения.
3D-модель сфероидов является идеальной платформой для исследования подвижного поведения раковых клеток под контролем, но физиологически релевантных условий3. Действительно, в этом анализе, сфероиды раковых клеток встроены внутри внеклеточной матрицы (ECM), например коллагена I, который имитирует упрощенную опухоль. Затем визуализация используется для визуализации вторжения раковых клеток из сфероида в коллагеновую матрицу. Однако многочисленные проблемы ограничивают эту процедуру.
Первая проблема возникает на этапе встраивания, где жидкий коллаген матрицы может распространяться по поверхности блюда, в результате чего сфероид коснуться нижней части блюда. Следовательно, клетки сфероида распространяются на двумерной (2D) поверхности, нарушая трехмерную (3D) сфероидную морфологию. Увеличение объема коллагена является эффективным, но дорогостоящим решением. Чтобы предотвратить распространение клеток на 2D-поверхности, сохраняя при этом минимальный объем коллагена, мы разработали устройство сфероидной визуализации (SID), охвачив 1 мм толщиной, 3-луночное полидиметилсилоксан (PDMS) вставить на стеклянное дно блюдо.
Второй проблемой сфероидного анализа является маркировка раковых клеток в сфероидах, которая ограничена плохим проникновением антител и флуоресцентных красителей, эффект, который увеличивается с размером сфероида. В то время как идеальным решением для маркировки клеток является создание клеточных линий, стабилизированно выражаюющих флуоресцентный белок (ы), этот вариант в основном ограничивается увековеченными клеточными линиями и ограничен наличием флуоресцентных белковых химер. Здесь мы описываем оптимизированный протокол для иммунофлуоресценции окрашивания фиксированных сфероидов, а также эффективное использование цитоплазмического красителя для обозначения клеток непосредственно перед встраиванием сфероида.
Третьей проблемой сфероидного анализа является отсутствие простых макросов Фиджи для полуавтоматической количественной оценки вторжения клеток с течением времени. Для решения этой задачи мы описываем простую методологию анализа сфероидной области с течением времени. В качестве примеров мы иллюстр работаем с преимуществами этого протокола, используя линии ячеек 4T1 и 67NR.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 N NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>60-014-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>SH30028.LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>T1048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti cortactin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33333</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti E-cadherin antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>1 to 100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine atelocollagen I solution (Nutragen)</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>501050ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red CMTPX Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable container</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td>Plastic cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht nuclear stain</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>S25371A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish (glass bottom dish)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6385-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>655204-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model

Вторжение раковых клеток из первичной опухоли в соседние здоровые ткани является ранним шагом в метастазах. Инвазивные раковые клетки представляют собой серьезную клиническую проблему, поскольку после их распространения не существует эффективного метода их ликвидации. Лучшее понимание механизмов, регулирующих вторжение раковых клеток может привести к разработке новых мощных методов лечения. Из-за их физиологического сходства с опухолями, сфероиды, встроенные в коллаген, я был широко использован исследователями для изучения механизмов, регулирующих вторжение раковых клеток во внеклеточную матрицу (ECM). Однако этот анализ ограничен (1) отсутствием контроля над встраиванием сфероидов в ЭКМ; (2) высокая стоимость коллагена I и стеклянных нижних блюд, (3) ненадежная иммунофлуоресцентная маркировка, из-за неэффективного проникновения антител и флуоресцентных красителей и (4) трудоемкой обработки изображений и количественной оценки данных. Для решения этих проблем мы оптимизировали трехмерный (3D) сфероидный протокол для изображения флуоресцентно помеченных раковых клеток, встроенных в коллаген I, либо используя покадровые видео или продольную визуализацию, и анализируем вторжение раковых клеток. Во-первых, мы описываем изготовление сфероидного устройства визуализации (SID) для надежного встраивания сфероидов в минимальный объем коллагена I, снижая стоимость анализа. Далее мы разграничим шаги для надежной маркировки флуоресценции живых и фиксированных сфероидов. Наконец, мы предлагаем простой в использовании макрос Фиджи для обработки изображений и количественной оценки данных. В целом, эта простая методология обеспечивает надежную и доступную платформу для мониторинга вторжения раковых клеток в коллаген I. Кроме того, этот протокол можно легко модифицировать в соответствии с потребностями пользователей.

Благодаря своей биосовместимости, PDMS широко используется для микрофабрики ограниченных скважин, марок и форм, которые произвели революцию в микропаттернации и микрофлюидных устройств. В описанной здесь методике он используется для создания СИД, настраиваемых скважин, которые оптими?...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

Здесь представлен протокол по изготовлению сфероидного устройства визуализации. Это устройство позволяет динамические или продольные флуоресценции изображения сфероидов раковых клеток. Протокол также предлагает простую процедуру обработки изображений для анализа вторжения раковых клеток.

Time-Resolved Флуоресценция Изображения и анализ вторжения раковых клеток в 3D-модель сфероидов

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

Этот протокол может быть использован для изучения механизмов, регулирующих вторжение раковых клеток во внеклеточную матрицу в режиме реального времени. Основным преимуществом этой техники является то, что он использует простое устройство сфероидной визуализации, что делает анализ нашествия сфероидов легче настроить и повышает его эффективность и стоимость. В то время как мы демонстрируем использование сфероидной нашествия анализ для моделирования молочной карциномы, этот анализ является отличной моделью для вторжения любой твердой опухоли в окружающие здоровые ткани.После 3D-печати спейсера, вес из 10:1 соотношение базового полимера к кросс-linker в пластиковый стаканчик и использовать одноразовые пипетки тщательно перемешать в результате PDMS решение в чашке. Поместите чашку в вакуумную камеру и быстро отпустите вакуумное давление, чтобы удалить любой воздух, захваченный на поверхности смеси и рассеять оставшиеся пузырьки воздуха. Инкубировать 3D печатный спейсер при 100 градусах по Цельсию в течение пяти минут, чтобы увеличить свою гибкость и очистить две стеклянные пластины со 100%изопропанолом.Поместите пространство так, что это заподлицо между двумя очищенными пластинами и поместите два больших зажима связующего на нижнем краю и один на верхний угол, чтобы запечатать плесень на внешние края пластин. Осмотрите верхнюю часть формы, чтобы убедиться, что спейсер заподлицо со стеклянными пластинами и использовать одноразовые пипетки с примерно два сантиметра вырезать из кончика медленно, но постоянно добавлять смесь PDMS в левый верхний угол формы. Когда вся плесень была заполнена, поместите плесень в вакуумную камеру, чтобы удалить любые пузырьки воздуха, которые сформировались, прежде чем лечить PDMS в течение одного часа при 100 градусах по Цельсию.В конце инкубации поместите форму при комнатной температуре. Когда это прохладно на ощупь, удалить связующие клипы и стеклянные пластины из спейсера, содержащего вылечить PDMS и использовать лезвие бритвы, чтобы прорезать печать, которая была создана на всех четырех сторонах формы между спейсером и стеклянной пластины. Потяните друг от друга плесень, чтобы выявить лист PDMS в spacer и использовать пинцет, чтобы тщательно очистить лист PDMS от спейсера.Поместите лист на режущей коврик и используйте пунш биопсии, чтобы пробить диск PDMS диаметром 17,5 миллиметра, а затем пробить три равномерно распределенных отверстия 5,5 миллиметра в диск. Используйте ленту, чтобы удалить частицы пыли из каждой вставки и придерживаться очищенных вставок на кусок односторонней ленты. Оберните ленту вокруг крышки 10-сантиметровой чашки Петри и поместите крышку в плазменную машину вместе с открытыми 35-миллиметровыми стеклянными нижней посудой.Активируйте вставки и стекло с одной минутой плазменной обработки на 300 миллиторов и используйте пинцет, чтобы быстро прикрепить обработанную сторону каждой вставки к стеклянной части одной обработанной стеклянной нижней тарелки на вставку. Когда все вставки были применены, используйте указательный палец и большой палец, чтобы применить равномерное давление на каждую вставку во время вращения блюда, чтобы надежно прикрепить вставки к посуде. Когда все вставки были защищены, инкубировать в результате сфероидных изображений устройств в течение 20 минут при 60 градусов по Цельсию, прежде чем выполнять второй раунд плазмы лечения, как показано.После второй обработки добавьте 35 микролитров свежеприготовленного раствора покрытия к каждому отверстию вставки. После одного часа при комнатной температуре снимите раствор покрытия и трижды промойте устройство дистиллированной водой. После последней стирки добавьте 35 микролитров кросс-связывающего раствора в каждое отверстие для 30-минутной инкубации при комнатной температуре.В конце инкубации, промыть устройство три раза дистиллированной водой, как попродемонстрировано, прежде чем заполнить каждое устройство с 70% этанола для 30-минутной инкубации под ультрафиолетовым светом. В конце стерилизации, промыть устройства три раза дистиллированной водой и добавить 2,5 миллилитров раствора для хранения для каждого устройства. Чтобы встроить сфероиды в коллаген, мыть устройства три раза с тремя миллилитров PBS за стирку.После последней стирки, дайте устройствам полностью высохнуть, прежде чем добавить один сфероид в 30 микролитров свежеприготовленного колледжа один раствор в одно отверстие вставки и запуск таймера. Подтвердив наличие сфероида в отверстии, добавьте сфероиды к двум другим отверстиям, как это было продемонстрировано. Используйте 10 микролитр пипетки отзыв для последние любые сфероиды, которые расположены близко к границе PDMS, или отделить сфероиды, если несколько сфероидов распределяются и остановить таймер.Чтобы вертикально центрировать сфероид в коллагеновом слое, после посева переверните устройство вверх дном и инкубируйте устройство при 37 градусах до тех пор, пока коллаген не полимеризируется, обратив ориентацию устройства каждые две минуты в общей сложности на 30 минут, затем добавьте 2,5 миллилитров среднего на устройство и приобретете изображение сфероидов в точке нулевого часового времени. Использование сфероидного изображения устройства облегчает эффективное встраивание и промежуток времени записи вторжения раковых клеток в коллагене или с помощью продольной визуализации. Хотя этот сфероид был изображен продольно в течение шести дней, требующих стабильного выражения цитоплазмических и / или ядерных флуоресцентных белков, аналогичные продольные изображения могут быть выполнены в течение более короткого периода времени с использованием красителя маркировки.Сфероиды также могут быть исправлены и immunolabeled. Например, эти сфероиды были иммунолабелированы для эпителиально-кадерин, кортактин, и F-актин. На этих снимках можно наблюдать пошаговую иллюстрацию процедуры обработки изображений с использованием макроса Фиджи для измерения области сфероида с течением времени.Обязательно раздай один сфероид в каждое отверстие сфероидного устройства визуализации и распоистит сфероид в центре отверстия в обоих направлениях XY и q. Конструкция устройства может быть легко изменена путем изменения размера и расположения отверстий, вставок и стеклянной нижней посуды для размещения более высокой пропускной способности сфероида.

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Покадровый Визуализация Митоз После трансфекции миРНК

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Флуоресценции на основе измерения магазин управлением поступления кальция в живых клетках: от искусственного раковых клеток в скелетных мышечных волокон

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Количественный анализ Аутофагия использованием Advanced 3D флуоресцентной микроскопии

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Живая съемка апоптоза клеток во время акции<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбриогенеза

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Экспресс-анализ и разведка флуоресцентной микроскопии Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Эффективный и гибкий метод Cell агрегация для 3D сфероида производства

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Анализ функции бета клеток с использованием одной ячейки резолюции кальция визуализации в Zebrafish островков

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Динамика олигомеризации рецепторов поверхности клеток в живых клетках с помощью общей внутренней флуоресценции в сочетании с анализом числа и яркости

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Окрашивание и визуализация высокого разрешения трехмерных органоидных и сфероидных моделей

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...