Name: time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00
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Nos gustaría dar las gracias a los miembros de La Bioingeniería del Templo por sus valiosos debates. Agradecemos a David Ambrose en el núcleo de citometría de flujo (Lewis Katz School of Medicine) por su asistencia con la clasificación celular y a Tony Boehm del CENTRO IDEAS (College of Engineering, Temple University) por su ayuda con la impresión 3D. También agradecemos nuestros recursos de financiación: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 y R01 CA230777, todo a BG.

1. Fabricación de un dispositivo de imágenes esferoides (SID) para optimizar la incrustación esferoide (duración 1 día)
<ol><li>Cree el espaciador utilizando una impresora 3D(Figura 1A, B y Archivo Complementario 1).</li>
	<li>Pesar una relación de 10:1 (wt/wt) de polímero base: reticulador cruzado en una taza de plástico [por ejemplo, 20 g de polímero base etilbenzene y 2 g de reticulador de resina de silicona para crear polidimetillsiloxano (PDMS)].</li>
	<li>Me...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Noone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+cell+spheroid+assay+to+assess+invasion+in+a+3D+setting.">A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).</li><li>T&#246;nisen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP4+receptor+promotes+invadopodia+and+invasion+in+human+breast+cancer.">EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer.</a> European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).</li><li>Bayarmagnai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia-mediated+ECM+degradation+is+enhanced+in+the+G1+phase+of+the+cell+cycle.">Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle.</a> Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Boutin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+imaging+and+nuclear+segmentation+analysis+protocol+for+cleared+3D+culture+models.">A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models.</a> Science Reports. 8, 11135 (2018).</li><li>Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+spheroid+formation+recorded+with+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).</li><li>Marcello, M., Richards, R., Mason, D., S&#233;e, V., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cell+invasion+using+a+multicellular+spheroid+model+and+light-sheet+microscopy.">Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy.</a> Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li></ol>

El espaciador impreso en 3D fue diseñado para crear láminas de 1 mm de grosor de PDMS que luego se pueden utilizar para crear fácilmente varias formas de PDMS, según lo requieran las aplicaciones experimentales. Debido a la simplicidad de su fabricación y la libertad de alterar el diseño, este método de fundición PDMS fue elegido para el diseño inicial del SID. Si se requiere un alto volumen de SIDs, la producción se puede hacer más eficiente mediante la creación de un molde impreso en 3D, que ya contiene dis...

Durante la progresión del cáncer, las células cancerosas pueden adquirir un fenotipo motil e invasivo, lo que les permite escapar de la masa tumoral e invadir los tejidos circundantes1. Con el tiempo, estas células cancerosas invasivas pueden alcanzar y crecer dentro de órganos secundarios, un proceso llamado metástasis del cáncer1. La metástasis causa más del 90% de las muertes relacionadas con el cáncer2. Una de las razones de esto es que, si bien los tumores localizados son clínicamente manejables, no existen métodos eficientes para la eliminación de las células cancerosas invasivas una vez que se ha producido la propagación metastásica. Por lo tanto, la aparición de células cancerosas invasivas y la transición de una enfermedad localizada a una enfermedad invasiva está planteando un gran desafío clínico. Determinar cómo las células cancerosas inician y sostienen un comportamiento invasivo puede conducir al desarrollo de nuevas terapias potentes.
El modelo esferoide 3D es una plataforma ideal para investigar el comportamiento motil de las células cancerosas bajo control, pero condiciones fisiológicamente relevantes3. De hecho, en este ensayo, los esferoides de las células cancerosas están incrustados dentro de la matriz extracelular (ECM), por ejemplo el colágeno I, que imita un tumor simplificado. A continuación, las imágenes se utilizan para visualizar la invasión de las células cancerosas del esferoide a la matriz del colágeno. Sin embargo, varios desafíos limitan este procedimiento.
El primer desafío se produce en el paso de incrustación, donde la matriz de colágeno líquido puede extenderse a través de la superficie del plato, haciendo que el esferoide toque la parte inferior del plato. En consecuencia, las células del esferoide se propagan en la superficie bidimensional (2D), rompiendo la morfología esferoide tridimensional (3D). Aumentar el volumen de colágeno es una solución eficiente, pero costosa. Para evitar que las células se propaguen en la superficie 2D, manteniendo un volumen mínimo de colágeno, desarrollamos un dispositivo de imágenes esferoides (SID) delimitando un inserto de polidimetilesiloxano (PDMS) de 1 mm de espesor y 3 agujeros en un plato inferior de vidrio.
El segundo desafío del ensayo esferoide es el etiquetado de las células cancerosas en esferoides, que está limitado por la mala penetración de anticuerpos y colorantes fluorescentes, un efecto que aumenta con el tamaño del esferoide. Si bien la solución ideal para etiquetar células es el establecimiento de líneas celulares que expresan permanentemente proteínas fluorescentes, esta opción se limita principalmente a líneas celulares inmortalizadas y está limitada por la disponibilidad de quimeras de proteína fluorescente. Aquí, describimos un protocolo optimizado para la tinción de inmunofluorescencia de esferoides fijos, así como el uso eficiente de un tinte citoplasmático para etiquetar las células inmediatamente antes de incrustar el esferoide.
El tercer desafío del ensayo esferoide es la falta de macros simples de Fiji para la cuantificación semiautomática de la invasión celular con el tiempo. Para abordar este desafío, describimos una metodología sencilla para analizar el área esferoide a lo largo del tiempo. Ilustramos las ventajas de este protocolo utilizando las líneas celulares 4T1 y 67NR como ejemplos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 N NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>60-014-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>SH30028.LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>T1048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti cortactin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33333</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti E-cadherin antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>1 to 100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine atelocollagen I solution (Nutragen)</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>501050ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red CMTPX Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable container</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td>Plastic cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht nuclear stain</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>S25371A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish (glass bottom dish)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6385-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>655204-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model

La invasión de células cancerosas del tumor primario a los tejidos sanos adyacentes es un paso temprano en la metástasis. Las células cancerosas invasivas plantean un gran desafío clínico porque no existe ningún método eficiente para su eliminación una vez que su diseminación está en marcha. Una mejor comprensión de los mecanismos que regulan la invasión de células cancerosas puede conducir al desarrollo de nuevas terapias potentes. Debido a su parecido fisiológico con los tumores, esferoides incrustados en colágeno he sido ampliamente utilizado por los investigadores para estudiar los mecanismos que rigen la invasión de células cancerosas en la matriz extracelular (ECM). Sin embargo, este ensayo está limitado por 1) la falta de control sobre la incrustación de esferoides en el ECM; (2) alto costo de los platos inferiores de colágeno I y vidrio, (3) etiquetado inmunofluorescente poco fiable, debido a la penetración ineficiente de anticuerpos y colorantes fluorescentes y (4) procesamiento de imágenes que consume mucho tiempo y cuantificación de los datos. Para hacer frente a estos desafíos, optimizamos el protocolo esferoide tridimensional (3D) para crear imágenes de células cancerosas etiquetadas fluorescentemente incrustadas en el colágeno I, ya sea usando videos de lapso de tiempo o imágenes longitudinales, y analizamos la invasión de células cancerosas. En primer lugar, describimos la fabricación de un dispositivo de imágenes esferoides (SID) para incrustar esferoides de forma fiable y en un volumen mínimo de colágeno I, reduciendo el costo del ensayo. A continuación, delineamos los pasos para el etiquetado robusto de fluorescencia de esferoides vivos y fijos. Por último, ofrecemos una macro de Fiji fácil de usar para el procesamiento de imágenes y la cuantificación de datos. En conjunto, esta metodología simple proporciona una plataforma confiable y asequible para monitorear la invasión de células cancerosas en el colágeno I. Además, este protocolo se puede modificar fácilmente para adaptarse a las necesidades de los usuarios.

Debido a su biocompatibilidad, PDMS es ampliamente utilizado para la microfabricación de pozos de confinamiento, sellos y moldes, que revolucionaron los dispositivos micropatternantes y microfluídicos. En el método descrito aquí, se utiliza para crear SIDs, pozos personalizables que optimizan el procedimiento de incrustación e imágenes esferoides. La Figura 1 ilustra los componentes principales utilizados en la fabricación de los SID. Para fundar el molde PDMS, un espaciador de 1 mm d...

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Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

Aquí se presenta un protocolo para la fabricación de un dispositivo de imágenes esferoides. Este dispositivo permite imágenes dinámicas o longitudinales de fluorescencia de esferoides de células cancerosas. El protocolo también ofrece un procedimiento simple de procesamiento de imágenes para el análisis de la invasión de células cancerosas.

Imágenes y análisis de fluorescencia resueltos en el tiempo de la invasión de células cancerosas en el modelo esferoide 3D

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

Este protocolo se puede utilizar para estudiar los mecanismos que rigen la invasión de las células cancerosas en la matriz extracelular en tiempo real. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza un simple dispositivo de imágenes esferoides, lo que hace que el ensayo de invasión esferoide sea más fácil de configurar y mejora su eficiencia y costo. Si bien demostramos el uso del ensayo de invasión esferoide para modelar el carcinoma mamario, este ensayo es un excelente modelo para la invasión de cualquier tumor sólido en el tejido sano circundante.Después de la impresión 3D del espaciador, pondere una relación de 10:1 de polímero base a enlazador cruzado en una taza de plástico y utilice una pipeta desechable para mezclar a fondo la solución PDMS resultante en la taza. Coloque la taza en una cámara de vacío y suelte rápidamente la presión de vacío para eliminar cualquier aire atrapado en la superficie de la mezcla y disipar las burbujas de aire restantes. Incubar el espaciador impreso en 3D a 100 grados Celsius durante cinco minutos para aumentar su flexibilidad y limpiar dos placas de vidrio con 100% isopropanol.Coloque el espaciador de modo que esté al ras entre las dos placas limpiadas y coloque dos clips de aglutinante grandes en el borde inferior y uno en la esquina superior para sellar el molde en los bordes exteriores de las placas. Inspeccione la parte superior del molde para asegurarse de que el espaciador esté al ras con las placas de vidrio y utilice una pipeta desechable con aproximadamente dos centímetros cortados de la punta para añadir lenta pero continuamente la mezcla PDMS a la esquina superior izquierda del molde. Cuando se haya llenado todo el molde, coloque el molde en la cámara de vacío para eliminar las burbujas de aire que se hayan formado, antes de curar el PDMS durante una hora a 100 grados Centígrados.Al final de la incubación, coloque el molde a temperatura ambiente. Cuando esté fresco al tacto, retire los clips de aglutinante y las placas de vidrio del espaciador que contiene el PDMS curado y utilice una cuchilla de afeitar para cortar a través del sello que se creó en los cuatro lados del molde entre el espaciador y la placa de vidrio. Tire del molde para revelar la hoja PDMS en el espaciador y utilice pinzas para pelar cuidadosamente la hoja PDMS del espaciador.Coloque la hoja en una alfombra de corte y utilice un punzón de biopsia para perforar un disco PDMS de 17,5 milímetros de diámetro, luego perforar tres agujeros de 5,5 milímetros distribuidos uniformemente en el disco. Utilice cinta adhesiva para eliminar las partículas de polvo de cada plaquita y pegue las plaquitas limpias en un trozo de cinta a doble cara. Envuelva la cinta alrededor de la tapa de una placa Petri de 10 centímetros y coloque la tapa en una máquina de plasma junto con platos inferiores de vidrio abiertos de 35 milímetros.Active las plaquitas y el vidrio con un minuto de tratamiento plasmático a 300 mililitros y utilice pinzas para fijar rápidamente el lado tratado de cada plaquita a la parte de vidrio de un plato inferior de vidrio tratado por plaquita. Cuando se hayan aplicado todas las plaquitas, utilice el dedo del puntero y el pulgar para aplicar presión uniforme a cada plaquita mientras gira el plato para fijar de forma segura los insertos a los platos. Cuando todas las plaquitas hayan sido aseguradas, incuba los dispositivos de imágenes esferoides resultantes durante 20 minutos a 60 grados Celsius, antes de realizar una segunda ronda de tratamiento plasmático como se demostró.Después del segundo tratamiento, agregue 35 microlitros de solución de recubrimiento recién preparada a cada orificio de plaquita. Después de una hora a temperatura ambiente, retire la solución de recubrimiento y enjuague el dispositivo tres veces con agua destilada. Después del último lavado, agregue 35 microlitros de solución de enlace cruzado a cada orificio para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente.Al final de la incubación, enjuague el dispositivo tres veces con agua destilada como se ha demostrado, antes de llenar cada dispositivo con 70% de etanol para una incubación de 30 minutos bajo luz UV. Al final de la esterilización, enjuague los dispositivos tres veces con agua destilada y agregue 2,5 mililitros de solución de almacenamiento a cada dispositivo. Para incrustar los esferoides en colágeno, lave los dispositivos tres veces con tres mililitros de PBS por lavado.Después del último lavado, deje que los dispositivos se sequen por completo, antes de agregar un esferoide en 30 microlitros de solución universitaria recién preparada en un agujero de la plaquita y comenzar un temporizador. Después de confirmar la presencia del esferoide en el agujero, agregue esferoides a los otros dos agujeros como se ha demostrado. Utilice una punta de pipeta de 10 microlitros para más reciente cualquier esferoide que se encuentre cerca del borde PDMS, o para separar los esferoides si se dispensan múltiples esferoides y detener el temporizador.Para centrar verticalmente el esferoide en la capa de colágeno, después de la siembra, voltear el dispositivo boca abajo e incubar el dispositivo a 37 grados hasta que el colágeno polimerice, invirtiendo la orientación del dispositivo cada dos minutos durante un total de 30 minutos, luego añadir 2,5 mililitros de medio por dispositivo y adquirir una imagen de los esferoides en el punto de tiempo de cero horas. El uso de un dispositivo de imagen esferoide facilita la incrustación eficiente y la grabación de lapso de tiempo de invasión celular del cáncer dentro del colágeno o a través de imágenes longitudinales. Mientras que este esferoide se imaginó longitudinalmente en el transcurso de seis días que requieren la expresión estable de proteínas fluorescentes citoplasmáticas y/o nucleares, imágenes longitudinales similares se pueden realizar durante un período de tiempo más corto utilizando etiquetado de tinte.Los esferoides también se pueden fijar e inmunoetiquetados. Por ejemplo, estos esferoides fueron inmunoetiquetados para epitelial-cadherina, cortactina y F-actin. En estas imágenes, se puede observar una ilustración paso a paso del procedimiento de procesamiento de imágenes utilizando la macro de Fiji para medir el área del esferoide a lo largo del tiempo.Asegúrese de dispensar un solo esferoide en cada orificio del dispositivo de imágenes esferoides y de colocar el esferoide en el centro del agujero en direcciones XY y Z. El diseño del dispositivo se puede modificar fácilmente cambiando el tamaño y la disposición de los agujeros, plaquitas y platos inferiores de vidrio para acomodar un mayor rendimiento esferoide.

Research

JoVE Journal

Biology

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Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Investigación

Biología

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

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Análisis cuantitativo de la autofagia mediante microscopía de fluorescencia avanzada 3D

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