Name: time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

Vi vill tacka medlemmarna i Temple Bioengineering för värdefulla diskussioner. Vi tackar David Ambrose vid flödescytometrikärnan (Lewis Katz School of Medicine) för hans hjälp med cellsortering och Tony Boehm från IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) för hjälp med 3D-utskriften. Vi tackar också våra finansieringsresurser: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 och R01 CA230777, alla till BG.

1. Tillverkning av en Spheroid Imaging Device (SID) för att optimera sfäroid inbäddning (varaktighet 1 dag)
<ol><li>Skapa distansen med en 3D-skrivare (bild 1A, B och kompletterande fil 1).</li>
	<li>Väg in ett 10:1 (wt/wt) förhållande mellan baspolymer:tvärlänk i en plastkopp [t.ex. 20 g etylbensbaspolymer och 2 g silikonhartskorslänker för att skapa polydietylsiloxan (PDMS)].</li>
	<li>Blanda PDMS-lösningen noggrant i plastkoppen med en engångspipett.</li>
	<...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Noone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+cell+spheroid+assay+to+assess+invasion+in+a+3D+setting.">A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).</li><li>T&#246;nisen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP4+receptor+promotes+invadopodia+and+invasion+in+human+breast+cancer.">EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer.</a> European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).</li><li>Bayarmagnai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia-mediated+ECM+degradation+is+enhanced+in+the+G1+phase+of+the+cell+cycle.">Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle.</a> Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Boutin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+imaging+and+nuclear+segmentation+analysis+protocol+for+cleared+3D+culture+models.">A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models.</a> Science Reports. 8, 11135 (2018).</li><li>Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+spheroid+formation+recorded+with+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).</li><li>Marcello, M., Richards, R., Mason, D., S&#233;e, V., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cell+invasion+using+a+multicellular+spheroid+model+and+light-sheet+microscopy.">Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy.</a> Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li></ol>

Den 3D-utskrivna distansen utformades för att skapa 1 mm tjocka ark PDMS som sedan kan användas för att enkelt skapa olika former av PDMS, vilket krävs av de experimentella applikationerna. På grund av enkelheten i dess tillverkning och friheten att ändra designen valdes denna metod för PDMS-gjutning för SID: s ursprungliga design. Om det krävs en hög volym AV SIM-kort kan produktionen effektiviseras genom att skapa en 3D-utskriven form, som redan innehåller PDMS-diskar med tre lika fördelade hål, och minska...

Under cancerprogression kan cancerceller förvärva en motil och invasiv fenotyp, vilket gör det möjligt för dem att undkomma tumörmassan och invadera in i de omgivandevävnaderna 1. Så småningom kan dessa invasiva cancerceller nå och växa inuti sekundära organ, en process som kallas cancermetastas1. Metastasering orsakar mer än 90% av cancerrelaterade dödsfall2. En anledning till detta är att även om lokaliserade tumörer är kliniskt hanterbara, finns det inga effektiva metoder för eliminering av invasiva cancerceller när metastaserad spridning har inträffat. Därför utgör uppkomsten av invasiva cancerceller och övergången från en lokaliserad till en invasiv sjukdom en stor klinisk utmaning. Att bestämma hur cancerceller initierar och upprätthåller ett invasivt beteende kan leda till utveckling av nya potenta terapier.
3D-sfäroidmodellen är en idealisk plattform för att undersöka cancercellernas motila beteende under kontrollerade, men fysiologiskt relevanta förhållanden3. I denna analys är sfäroider av cancerceller inbäddade i extracellulär matris (ECM), till exempel kollagen I, som efterliknar en förenklad tumör. Sedan används avbildning för att visualisera invasionen av cancerceller från sfäroiden till kollagenmatrisen. Flera utmaningar begränsar dock denna procedur.
Den första utmaningen uppstår vid inbäddningssteget, där den flytande kollagenmatrisen kan sprida sig över skålytan, vilket gör att sfäroiden vidrör botten av skålen. Följaktligen spreds celler från sfäroiden på den tvådimensionella (2D) ytan och bröt den tredimensionella (3D) sfäroidmorfologin. Att öka volymen av kollagen är en effektiv men kostsam lösning. För att förhindra att celler sprids på 2D-ytan, samtidigt som vi upprätthåller en minimal volym kollagen, utvecklade vi en sfäroid avbildningsenhet (SID) genom att begränsa en 1 mm tjock, 3-håls polydimethylsiloxane (PDMS) insats på en glasbottenform.
Den andra utmaningen med den sfäroida analysen är märkningen av cancerceller i sfäroider, vilket begränsas av dålig penetration av antikroppar och fluorescerande färgämnen, en effekt som ökar med sfäroidstorleken. Medan den idealiska lösningen för märkning av celler är upprättandet av cellinjer som stabilt uttrycker fluorescerande protein(er), är detta alternativ mestadels begränsat till odödliga cellinjer och begränsas av tillgången på fluorescerande protein chimeras. Här beskriver vi ett optimerat protokoll för immunofluorescensfärgning av fasta sfäroider, samt effektiv användning av ett cytoplasmiskt färgämne för att märka celler omedelbart innan sfäroiden bäddas in.
Den tredje utmaningen med sfäroidanalysen är bristen på enkla Fiji-makron för halvautomatisk kvantifiering av cellinvasion över tid. För att möta denna utmaning beskriver vi en enkel metodik för att analysera sfäroidområdet över tid. Vi illustrerar fördelarna med detta protokoll med hjälp av 4T1 och 67NR cellinjer som exempel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 N NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>60-014-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>SH30028.LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>T1048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti cortactin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33333</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti E-cadherin antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>1 to 100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine atelocollagen I solution (Nutragen)</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>501050ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red CMTPX Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable container</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td>Plastic cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht nuclear stain</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>S25371A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish (glass bottom dish)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6385-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>655204-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model

Invasionen av cancerceller från den primära tumören i de intilliggande friska vävnaderna är ett tidigt steg i metastasering. Invasiva cancerceller utgör en stor klinisk utmaning eftersom det inte finns någon effektiv metod för att eliminera dem när deras spridning är igång. En bättre förståelse för mekanismerna som reglerar cancercellsinvasion kan leda till utveckling av nya potenta terapier. På grund av deras fysiologiska likhet med tumörer har sfäroider inbäddade i kollagen jag i stor utsträckning använts av forskare för att studera mekanismerna för cancercellsinvasion i den extracellulära matrisen (ECM). Denna analys begränsas dock av (1) bristande kontroll över inbäddningen av sfäroider i ECM. (2) Höga kostnader för kollagen I- och glasbottenfat, 3) otillförlitlig immunofluorescerande märkning på grund av ineffektiv penetration av antikroppar och fluorescerande färgämnen och (4) tidskrävande bildbehandling och kvantifiering av uppgifterna. För att hantera dessa utmaningar optimerade vi det tredimensionella (3D) sfäroidprotokollet för att avbilda fluorescerande märkta cancerceller inbäddade i kollagen I, antingen med hjälp av timelapse-videor eller longitudinell avbildning och analysera cancercellsinvasion. Först beskriver vi tillverkningen av en sfäroid imaging enhet (SID) för att bädda in sfäroider tillförlitligt och i en minimal kollagen I volym, minska analys kostnaden. Därefter avgränsar vi stegen för robust fluorescensmärkning av levande och fasta sfäroider. Slutligen erbjuder vi ett lättanmätt Fiji-makro för bildbehandling och datak kvantifiering. Sammantaget ger denna enkla metodik en pålitlig och prisvärd plattform för att övervaka cancercellsinvasion i kollagen I. Dessutom kan detta protokoll enkelt ändras för att passa användarnas behov.

På grund av sin biokompatibilitet används PDMS ofta för mikrotillverkning av begränsande brunnar, frimärken och mögel, vilket revolutionerade mikropapper och mikrofluidiska enheter. I metoden som beskrivs här används den för att skapa SIM-kort, anpassningsbara brunnar som optimerar sfäroid inbäddning och avbildningsprocedur. Figur 1 illustrerar de viktigaste komponenterna som används vid tillverkning av SIM-kort. För att gjuta PDMS-formen är en 1 mm tjock distans 3D-utskriven (...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

Presenteras här är ett protokoll för tillverkning av en sfäroid imaging enhet. Denna enhet möjliggör dynamisk eller longitudinell fluorescensavbildning av cancercellssfäroider. Protokollet erbjuder också en enkel bildbehandlingsprocedur för analys av cancercellsinvasion.

Tidsuppgjord fluorescensavbildning och analys av cancercellsinvasion i 3D-sfäroidmodellen

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

Detta protokoll kan användas för att studera mekanismerna som styr invasionen av cancerceller i den extracellulära matrisen i realtid. Den största fördelen med denna teknik är att den använder en enkel sfäroid avbildningsenhet, vilket gör sfäroidinvasionsanalysen lättare att ställa in och förbättrar dess effektivitet och kostnad. Medan vi visar att använda sfäroid invasion analys för att modellera bröst carcinom, denna analys är en utmärkt modell för invasionen av någon solid tumör i den omgivande friska vävnaden.Efter 3D-utskrift av distansen, vikta ut ett 10:1-förhållande mellan baspolymer och korslänkare i en plastkopp och använd en engångspipett för att noggrant blanda den resulterande PDMS-lösningen i koppen. Placera koppen i en vakuumkammare och släpp snabbt vakuumtrycket för att avlägsna eventuell luft som fastnat på blandningens yta och för att skingra de återstående luftbubblorna. Inkubera den 3D-utskrivna distansen vid 100 grader Celsius i fem minuter för att öka dess flexibilitet och rengöra två glasplattor med 100% isopropanol.Placera distansen så att den är jämn mellan de två rengjorda plattorna och placera två stora bindemedelsklämmor på underkanten och en på det övre hörnet för att försegla formen på plattornas ytterkanter. Inspektera den övre delen av formen för att säkerställa att distansen är i linje med glasplattorna och använd en engångspipett med cirka två centimeter skuren från spetsen för att långsamt men kontinuerligt lägga till PDMS-blandningen i det övre vänstra hörnet av formen. När hela formen har fyllts, placera formen i vakuumkammaren för att ta bort eventuella luftbubblor som har bildats, innan du härdar PDMS i en timme vid 100 grader Celsius.I slutet av inkubationen, placera formen vid rumstemperatur. När det är svalt vid beröring, ta bort bindemedelsklämmorna och glasplattorna från distansen som innehåller det härdade PDMS och använd ett rakblad för att skära igenom tätningen som skapades på alla fyra sidorna av formen mellan distansen och glasplattan. Dra isär formen för att avslöja PDMS-arket i distansen och använd pincett för att försiktigt skala PDMS-arket från distansen.Placera arket på en skärmatta och använd en biopsi stans för att stansa ut en PDMS-skiva med diametern 17,5 millimeter och slå sedan tre jämnt fördelade 5,5 millimeters hål i skivan. Använd tejp för att ta bort dammpartiklar från varje skär och fäst de rengjorda skären på en bit dubbelsidig tejp. Linda tejpen runt locket på en 10 centimeters Petri-skål och placera locket i en plasmamaskin tillsammans med öppna 35 millimeters glasbottenrätter.Aktivera skären och glaset med en minuts plasmabehandling vid 300 millitorer och använd pincett för att snabbt fästa den behandlade sidan av varje skär på glasdelen av en behandlad glasbottenform per insats. När alla skär har applicerats, använd pekarfingret och tummen för att applicera jämnt tryck på varje skär medan du roterar skålen för att säkert fästa skären på disken. När alla skär har säkrats, inkubera de resulterande sfäroida bildbehandlingsanordningarna i 20 minuter vid 60 grader Celsius, innan du utför en andra omgång plasmabehandling som visats.Efter den andra behandlingen tillsätt 35 mikroliter nyberedd beläggningslösning till varje skärhål. Efter en timme vid rumstemperatur, ta bort beläggningslösningen och skölj enheten tre gånger med destillerat vatten. Efter den sista tvätten, tillsätt 35 mikroliter korslänkningslösning till varje hål för en 30-minuters inkubation vid rumstemperatur.I slutet av inkubationen, skölj enheten tre gånger med destillerat vatten som visats, innan du fyller varje enhet med 70% etanol för en 30-minuters inkubation under UV-ljus. I slutet av steriliseringen, skölj enheterna tre gånger med destillerat vatten och tillsätt 2,5 milliliter lagringslösning till varje enhet. För att bädda in sfäroiderna i kollagen, tvätta enheterna tre gånger med tre milliliter PBS per tvätt.Efter den sista tvätten, låt enheterna torka helt, innan du lägger till en sfäroid i 30 mikroliter nyberedd college en lösning i ett hål i insatsen och startar en timer. Efter att ha bekräftat närvaron av sfäroiden i hålet, tillsätt sfäroider till de andra två hålen som visats. Använd en 10 mikroliter pipettspets för att nyare alla sfäroider som finns nära PDMS-gränsen, eller för att separera sfäroiderna om flera sfäroider dispenseras och stoppa timern.För att vertikalt centrera sfäroiden i kollagenskiktet, efter sådd, vänd enheten upp och ner och inkubera enheten vid 37 grader tills kollagenpolymeren polymeriseras, vända enhetens orientering varannan minut i totalt 30 minuter, tillsätt sedan 2,5 milliliter medium per enhet och få en bild av sfäroiderna vid nolltimmarspunkten. Att använda en sfäroid bildanordning underlättar effektiv inbäddning och timelapse inspelning av cancer cell invasion i kollagen eller via longitudinell avbildning. Medan denna sfäroid avbildades longitudinellt under loppet av sex dagar som kräver stabilt uttryck av cytoplasma och/eller nukleära fluorescerande proteiner, kan liknande longitudinell avbildning utföras under en kortare tidsperiod med hjälp av färgmärkning.Sfäroider kan också fixas och immunolabeleras. Till exempel var dessa sfäroider immunolabeled för epitelial-cadherin, cortactin och F-aktin. I dessa bilder kan en steg-för-steg-illustration av bildbehandlingsproceduren med fijimakroet för att mäta sfäroidområdet över tiden observeras.Var noga med att dela ut en enda sfäroid i varje hål i sfäroidavbildningsanordningen och placera sfäroiden i mitten av hålet i både XY- och Z-riktningar. Enhetens design kan enkelt ändras genom att ändra storleken och arrangemanget på hålen, skären och glasbottenfaten för att rymma en högre sfäroid genomströmning.

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-baserad Mätning av Store-drivs kalcium Entry i levande celler: från odlade Cancer Cell till skelettmuskulatur Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Kvantitativ analys av Autophagy med Advanced 3D Fluorescensmikroskopi

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Snabb analys och utforskningen av fluorescensmikroskopi bilder

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

En effektiv och flexibel cell Aggregation Metod för 3D Spheroid Production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Analys av Beta-cell-funktion som använder Single-cell Resolution kalcium Imaging i zebrafiskar holmar

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Oligomerisering dynamik cellytan receptorer i levande celler av total inre reflektion fluorescens mikroskopi kombinerat med antal och ljusstyrka analys

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Färgning och högupplöst avbildning av tredimensionella organoid- och sfäroidmodeller

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...