Name: time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

Temple Bioengineering üyelerine değerli tartışmalar için teşekkür ederiz. Akış sitometri çekirdeğinden (Lewis Katz Tıp Fakültesi) David Ambrose'a hücre ayıklama konusundaki yardımı için ve IDEAS Hub'dan (Mühendislik Koleji, Temple Üniversitesi) Tony Boehm'e 3D baskı konusunda yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca finansman kaynaklarımıza da teşekkür ediyoruz: Amerikan Kanser Derneği Araştırma Bursiyeri Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Genç Araştırmacı Ödülü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, R00 CA172360 ve R01 CA230777, hepsi BG'ye.

1. Küresel gömmeyi optimize etmek için bir Küresel Görüntüleme Cihazının (SID) imalatı (Süre 1 gün)
<ol><li>Aralayıcıyı bir 3D yazıcı kullanarak oluşturun (Şekil 1A, B ve Tamamlayıcı Dosya 1).</li>
	<li>Polidimetilsiloksan (PDMS) oluşturmak için plastik bir kapta 10:1 (wt/wt) taban polimer:çapraz bağlantı oranını [örneğin, 20 g etilbenzen baz polimer ve 2 g silikon reçine çaprazlayıcı] tartın.</li>
	<li>PDMS çözeltisini tek kullanımlı...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Noone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+cell+spheroid+assay+to+assess+invasion+in+a+3D+setting.">A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).</li><li>T&#246;nisen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP4+receptor+promotes+invadopodia+and+invasion+in+human+breast+cancer.">EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer.</a> European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).</li><li>Bayarmagnai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia-mediated+ECM+degradation+is+enhanced+in+the+G1+phase+of+the+cell+cycle.">Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle.</a> Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Boutin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+imaging+and+nuclear+segmentation+analysis+protocol+for+cleared+3D+culture+models.">A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models.</a> Science Reports. 8, 11135 (2018).</li><li>Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+spheroid+formation+recorded+with+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).</li><li>Marcello, M., Richards, R., Mason, D., S&#233;e, V., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cell+invasion+using+a+multicellular+spheroid+model+and+light-sheet+microscopy.">Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy.</a> Advances in Experimental Medicine and. , 155-161 (2017).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li></ol>

3D baskılı aralayıcı, deneysel uygulamaların gerektirdiği şekilde, pdms'nin çeşitli şekillerini kolayca oluşturmak için kullanılabilecek 1 mm kalınlığında PDMS sayfaları oluşturmak için tasarlanmıştır. İmalatının basitliği ve tasarımı değiştirme özgürlüğü nedeniyle, SID'nin ilk tasarımı için bu PDMS döküm yöntemi seçildi. Yüksek hacimli SID'ler gerekiyorsa, zaten üç eşit aralıklı deliği olan PDMS diskleri içeren 3D baskılı bir kalıp oluşturularak ve işlem tek adıma...

Kanserin ilerlemesi sırasında, kanser hücreleri hareketli ve invaziv bir fenotip elde edebilir, tümör kütlesinden kaçmalarını ve çevre dokulara istila etmelerini sağlar1. Sonunda, bu invaziv kanser hücreleri ikincil organların içine ulaşabilir ve büyüyebilir, kanser metastazı1. Metastaz kansere bağlı ölümlerin% 90'ından fazla neden olur2. Bunun bir nedeni, lokalize tümörler klinik olarak yönetilebilir olsa da, metastatik yayılma meydana geldikten sonra invaziv kanser hücrelerinin ortadan kaldırılması için etkili bir yöntem bulunmamasıdır. Bu nedenle, invaziv kanser hücrelerinin ortaya çıkması ve lokalize bir hastalıktan invaziv bir hastalığa geçiş büyük bir klinik zorluk oluşturmaktadır. Kanser hücrelerinin invaziv bir davranışı nasıl başlattığını ve sürdürdüğünü belirlemek, yeni güçlü tedavilerin gelişmesine neden olabilir.
3D küresel model, kontrollü, ancak fizyolojik olarak ilgili koşullar altında kanser hücrelerinin hareketli davranışlarını araştırmak için ideal bir platformdur3. Gerçekten de, bu testte, kanser hücrelerinin küreselleri hücre dışı matrisin (ECM), örneğin basitleştirilmiş bir tümörü taklit eden kollajen I'in içine gömülür. Daha sonra, görüntüleme, kanser hücrelerinin sferoidden kollajen matrisine invazyonunun görselleştirilmesi için kullanılır. Ancak, birden çok zorluk bu yordamı sınırlar.
İlk zorluk, sıvı kollajen matrisinin çanak yüzeyine yayılabileceği ve küreselin yemeğin dibine dokunmasına neden olan gömme adımında gerçekleşir. Sonuç olarak, küreselden gelen hücreler iki boyutlu (2D) yüzeye yayılır ve üç boyutlu (3D) küresel morfolojiyi kırır. Kollajen hacmini artırmak verimli, ancak maliyetli bir çözümdür. Hücrelerin 2D yüzeye yayılmasını önlemek için, minimum miktarda kollajen korurken, 1 mm kalınlığında, 3 delikli bir polidimetilsiloksan (PDMS) kesici ucu cam bir alt kabın üzerine bağlayarak bir küresel görüntüleme cihazı (SID) geliştirdik.
Küresel testin ikinci zorluğu, sferoid boyutu ile artan bir etki olan antikorların ve floresan boyaların zayıf penetrasyonu ile sınırlı olan sferoidlerdeki kanser hücrelerinin etiketlenilmesidir. Hücreleri etiketlemek için ideal çözüm, floresan proteinleri(leri) kasten ifade eden hücre hatlarının kurulması olsa da, bu seçenek çoğunlukla ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarıyla sınırlıdır ve floresan protein chimeras mevcudiyeti ile sınırlıdır. Burada, sabit sferoidlerin immünofluoresans boyanmasının yanı sıra, küreseli gömmeden hemen önce hücreleri etiketlemek için sitoplazmik bir boyanın verimli kullanımı için optimize edilmiş bir protokol açıklıyoruz.
Küresel testlerin üçüncü zorluğu, zaman içinde hücre istilasının yarı otomatik ölçülmesi için basit Fiji makrolarının olmamasıdır. Bu zorluğu ele almak için, zaman içinde küresel alanı analiz etmek için basit bir metodoloji açıklıyoruz. Örnek olarak 4T1 ve 67NR hücre çizgilerini kullanarak bu protokolün avantajlarını gösteriyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 N NaOH</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>60-014-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>SH30028.LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>T1048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti cortactin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33333</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti E-cadherin antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>1 to 100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine atelocollagen I solution (Nutragen)</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>501050ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red CMTPX Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable container</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td>Plastic cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht nuclear stain</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>S25371A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish (glass bottom dish)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6385-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies, user specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>655204-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved fluorescence imaging and analysis of cancer cell invasion in the 3d spheroid model

Birincil tümörden kanser hücrelerinin bitişik sağlıklı dokulara istilası metastazda erken bir adımdır. İnvaziv kanser hücreleri büyük bir klinik zorluk oluşturur, çünkü yayılmaları başladıktan sonra ortadan kaldırılması için etkili bir yöntem yoktur. Kanser hücre invazyonunu düzenleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılması, yeni güçlü tedavilerin gelişmesine yol açabilir. Tümörlere fizyolojik benzerlikleri nedeniyle, kollajene gömülü sferoidler, kanser hücresi istilasını hücre dışı matrise (ECM) yöneten mekanizmaları incelemek için araştırmacılar tarafından yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu test (1) küresellerin ECM'ye gömülmesi üzerinde kontrol eksikliği ile sınırlıdır; (2) kollajen I ve cam alt yemeklerin yüksek maliyeti, (3) antikorların ve floresan boyaların verimsiz penetrasyonu ve (4) verilerin zaman alıcı görüntü işlemesi ve nicelemesi nedeniyle güvenilmez immünofluoresan etiketleme. Bu zorlukları ele almak için, üç boyutlu (3D) küresel protokolü, kollajen I'e gömülü floresan etiketli kanser hücrelerini zaman atlamalı videolar veya boyuna görüntüleme kullanarak görüntülemek ve kanser hücresi istilasını analiz etmek için optimize ettik. İlk olarak, sferoidleri güvenilir bir şekilde ve minimal bir kollajen I hacmine gömmek için bir küresel görüntüleme cihazının (SID) imalatını tarif ediyoruz ve test maliyetini azaltıyoruz. Daha sonra, canlı ve sabit küresellerin sağlam floresan etiketlemesi için adımları tanımlamaktadır. Son olarak, görüntü işleme ve veri nicelemesi için kullanımı kolay bir Fiji makrosu sunuyoruz. Tamamen, bu basit metodoloji kollajen I'de kanser hücresi invazyonunu izlemek için güvenilir ve uygun fiyatlı bir platform sağlar. Ayrıca, bu protokol kullanıcıların ihtiyaçlarına uyacak şekilde kolayca değiştirilebilir.

Biyouyumluluğu nedeniyle PDMS, mikropatterning ve mikroakışkan cihazlarda devrim yapan hapsedici kuyuların, pulların ve kalıpların mikrofabrikasyonu için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada açıklanan yöntemde, Sferoid gömme ve görüntüleme prosedürünü optimize eden SID'ler, özelleştirilebilir kuyular oluşturmak için kullanılır. Şekil 1, SID'lerin imalatında kullanılan ana bileşenleri göstermektedir. PDMS kalıbını dökmek için, 1 mm kalınlığında bir a...

Watch this Scientific Journal Video about Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model at JoVE.com

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

Burada bir küresel görüntüleme cihazının üretimi için bir protokol sunulmaktadır. Bu cihaz kanser hücre sferoidlerinin dinamik veya boyuna floresan görüntülemesini sağlar. Protokol ayrıca kanser hücre invazyonunun analizi için basit bir görüntü işleme prosedürü sunmaktadır.

3D Sferoid Modelinde Zaman Çözülen Floresan Görüntüleme ve Kanser Hücre İstilasının Analizi

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

Bu protokol, kanser hücrelerinin hücre dışı matrise istilasını düzenleyen mekanizmaları gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılabilir. Bu tekniğin ana avantajı, küresel istila tahlilinin kurulumunu kolaylaştıran ve verimliliğini ve maliyetini artıran basit bir küresel görüntüleme cihazı kullanmasıdır. Meme karsinomunun modelini yapmak için küresel invazyon testini kullanarak gösterirken, bu test herhangi bir katı tümörün çevredeki sağlıklı dokuya istilası için mükemmel bir modeldir.Ara çubuğun 3D baskısından sonra, plastik bir kapta çapraz bağlayıcıya 10:1 baz polimer oranını ağırlıklayın ve elde edilen PDMS çözeltisini fincanda iyice karıştırmak için tek kullanımlık bir pipet kullanın. Kabı bir vakum odasına yerleştirin ve karışımın yüzeyine sıkışmış herhangi bir havayı çıkarmak ve kalan hava kabarcıklarını dağıtmak için vakum basıncını hızla serbest bırakın. Esnekliğini artırmak ve iki cam plakayı % 100 izopropanol ile temizlemek için 3D baskılı ara çubuğu beş dakika boyunca 100 santigrat derecede kuluçkaya bırakın.Aralayıcıyı iki temizlenmiş plaka arasında yıkanacak şekilde yerleştirin ve kalıbı plakaların dış kenarlarına kapatmak için alt kenara ve üst köşeye iki büyük bağlayıcı klipsi yerleştirin. Ara parçanın cam plakalarla yıkandığından emin olmak için kalıbın üst kısmını inceleyin ve PDMS karışımını kalıbın sol üst köşesine yavaşça ancak sürekli olarak eklemek için ucundan yaklaşık iki santimetre kesilmiş tek kullanımlık bir pipet kullanın. Tüm kalıp dolduğunda, PDMS'yi 100 santigrat derecede bir saat boyunca iyileştirmeden önce, oluşan hava kabarcıklarını çıkarmak için kalıbı vakum odasına yerleştirin.Kuluçkanın sonunda, kalıbı oda sıcaklığına yerleştirin. Dokunmaya soğuk olduğunda, bağlayıcı klipslerini ve cam plakaları kürlenmiş PDMS'yi içeren ara tabaktan çıkarın ve aralayıcı ile cam plaka arasındaki kalıbın dört tarafında oluşturulan contayı kesmek için bir jilet kullanın. Ara parçadaki PDMS sayfasını ortaya çıkarmak için kalıbı ayırın ve PDMS sayfasını ara parçadan dikkatlice soymak için cımbız kullanın.Levhayı bir kesme paspasına yerleştirin ve 17,5 milimetre çapında bir PDMS diski delmek için biyopsi zımbası kullanın, ardından diske eşit olarak dağılmış üç adet 5,5 milimetre delik açın. Her kesici uçtan toz parçacıklarını çıkarmak için bandı kullanın ve temizlenen kesici uçları çift taraflı bir bant parçasına yapıştırın. Bandı 10 santimetrelik petri kabının kapağına sarın ve kapağı açık 35 milimetre cam alt tabaklarla birlikte bir plazma makinesine yerleştirin.Kesici uçları ve camı 300 militorrda bir dakikalık plazma tedavisi ile etkinleştirin ve her kesici ucun işlenmiş tarafını kesici uç başına bir işlenmiş cam alt kabın cam kısmına hızlı bir şekilde takmak için cımbız kullanın. Tüm kesici uçlar uygulandığında, kesici uçları bulaşıklara güvenli bir şekilde takmak için kabı döndürürken her kesici uçta eşit basınç uygulamak için işaretçi parmağını ve başparmağı kullanın. Tüm kesici uçlar sabitlendiğinde, ortaya çıkan küresel görüntüleme cihazlarını, gösterildiği gibi ikinci bir plazma tedavisi gerçekleştirmeden önce 60 santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın.İkinci işlemden sonra, her kesici uç deliğine 35 mikrolitre taze hazırlanmış kaplama çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat sonra kaplama solüsyonunun çıkarın ve cihazı damıtılmış suyla üç kez durulayın. Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon için her deliğe 35 mikrolitre çapraz bağlama çözeltisi ekleyin.Kuluçkanın sonunda, her cihazı UV ışığı altında 30 dakikalık bir inkübasyon için% 70 etanol ile doldurmadan önce, gösterildiği gibi cihazı damıtılmış suyla üç kez durulayın. Sterilizasyonun sonunda, cihazları damıtılmış suyla üç kez durulayın ve her cihaza 2,5 mililitre depolama çözeltisi ekleyin. Küreselleri kollajene gömmek için, cihazları yıkama başına üç mililitre PBS ile üç kez yıkayın.Son yıkamadan sonra, 30 mikrolitre taze hazırlanmış koleje bir sferoid eklemeden ve bir zamanlayıcıya başlamadan önce cihazların tamamen kurumasını bekleyin. Delikte sferoidin varlığını doğruladıktan sonra, gösterildiği gibi diğer iki deliğe küreseller ekleyin. PDMS sınırına yakın olan küreselleri daha yeni görmek veya birden fazla sferoid dağıtılırsa küreselleri ayırmak ve zamanlayıcıyı durdurmak için 10 mikroliter pipet ucu kullanın.Sferoidi kollajen tabakasında dikey olarak ortalamak için, tohumlamadan sonra, cihazı ters çevirin ve kollajen polimerize olana kadar cihazı 37 derecede kuluçkaya yatırın, cihaz yönünü her iki dakikada bir toplam 30 dakika boyunca tersine çevirin, ardından cihaz başına 2,5 mililitre orta ekleyin ve sıfır saat zaman noktasında küresellerin bir görüntüsünü elde edin. Küresel bir görüntü cihazı kullanmak, kollajen içinde veya boyuna görüntüleme yoluyla kanser hücresi istilasının verimli bir şekilde gömülmesini ve zaman atlamalı kaydedilmesini kolaylaştırır. Bu sferoid altı gün boyunca sitoplazmik ve/veya nükleer floresan proteinlerin stabil ekspresyonunun gerekliliğini gerektiren uzunlamasına olarak görüntülenirken, boya etiketlemesi kullanılarak daha kısa bir süre boyunca benzer uzunlamasına görüntüleme yapılabilir.Sferoidler de sabitlenebilir ve immünoblabeled olabilir. Örneğin, bu sferoidler epitel-cadherin, korteksin ve F-actin için immünolabeled edildi. Bu görüntülerde, zaman içinde küresel alanı ölçmek için Fiji makrosunu kullanarak görüntü işleme prosedürünün adım adım bir örneği gözlemlenebilir.Küresel görüntüleme cihazının her deliğine tek bir küresel dağıttığından ve küreseli deliğin ortasına hem XY hem de Z yönlerinde konumlandıracağından emin olun. Cihaz tasarımı, deliklerin, kesici uçların ve cam alt tabakların boyutunu ve düzenini değiştirerek daha yüksek bir küresel verime uyum sağlayacak şekilde kolayca değiştirilebilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

3D Sfero Üretim için bir Verimli ve esnek Hücre Toplama Yöntemi

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Zebra balığı adacıkları tek hücreli çözünürlük kalsiyum Imaging'i kullanma Beta hücre fonksiyonu Analizi

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Ile Canlı Hücrelerdeki Hücre Yüzey Reseptörlerinin Oligomerizasyon Dinamiği Sayı ve Parlaklık Analizi ile Birlikte

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Üç Boyutlu Organoid ve Küresel Modellerin Boyama ve Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...