Name: neutron crystallography data collection and processing for modelling hydrogen atoms in protein structures
Uploaded: 2020-12-01T15:00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures at JoVE.com

أجريت تجارب التعبير عن البروتين وتنقية وبلورة في مركز البيولوجيا الجزيئية الهيكلية (CSMB)، وهو مرفق مستخدم للبحوث البيولوجية والبيئية تابع لوزارة الطاقة الأميركية في مختبر أوك ريدج الوطني. تم جمع بيانات حيود النيوترون في BL-11B MaNDi في مصدر نيوترون سباليشن (SNS) في ORNL الذي ترعاه شعبة مرافق المستخدمين العلميين، مكتب علوم الطاقة الأساسية، وزارة الطاقة الأمريكية. يشكر المؤلفون بريندان سوليفان على المساعدة في الحد من البيانات. تم جمع بيانات حيود الأشعة السينية في مرافق مركز التعليم الجزيئي والتكنولوجيا والابتكار البحثي (METRIC) في جامعة ولاية كارولينا الشمالية، والتي تدعمها ولاية كارولينا الشمالية. تعترف GCS بالدعم جزئيا من المؤسسة الوطنية للأبحاث (NRF) وجنوب أفريقيا وبرنامج فرص الدراسات العليا (GO!) في ORNL. FM يعترف بدعم من وزارة الزراعة الأميركية نيفا هاتش 211001.

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

البلورات البروتين النيوتروني هو تقنية حساسة للغاية للتحقيق حالات البروتونات واتجاه جزيء الماء في البروتينات. تلقي هذه المعلومات الضوء على آليات تحفيز البروتين لأن التغيرات في تفاعلات البروتونات والترابط الهيدروجيني غالبا ما تكون مركزية لكيمياء الإنزيم10. إن البلورات البروتينية النيوترونية، وإن كانت تقنية مفيدة، لها عدد من العوامل التي ينبغي أخذها في الاعتبار قبل التخطيط لإجراء تجربة حيود نيوتروني، وهي:
<ol><li>الحاجة إلى بلورات بروتين كبيرة لجمع البيانات.</li>
	<li>خصائص متناثرة من الهيدروجين وعناصر أخرى، مثل الأيونات المعدنية.</li>
	<li>القيود المفروضة على هيكل الصقل ونموذج بناء البرمجيات عند العمل مع عينات deuterated.</li>
</ol>البلورات البروتين النيوتروني هو تقنية تدفق محدودة. وعلى النقيض من مجموعات بيانات حيود الأشعة السينية، يتوقع أن تكون عوامل R الأعلى والاكتمال المنخفض والتكرار ونسب الإشارة إلى الضوضاء لمجموعات البيانات النيوترونية بسبب القيود المتأصلة في التقنية (التدفق المحدود وشبه الو والأطوال الموجية الأطول). جمع البيانات من إطار واحد عادة 12 -18 ساعة. نجاح تجربة تعتمد اعتمادا كبيرا على حجم العينة والجودة مع بلورات من 0.1 mm3 غالبا ما يكون الحد الأدنى requirement3. يتطلب الحيود النيوتروني إنتاج كميات كبيرة من البروتين لإعداد قطرات تبلور تتراوح بين 10 إلى 800 ميكرولتر. يمكن تقدير الحجم الأدنى لنمو بلورات كبيرة بما فيه الكفاية باستخدام حاسبة الحجم نظرا لمعلمات الكريستال والعينة (https://neutrons.ornl.gov/imagine). وقد تم تحقيق نمو بلورات كبيرة الأكثر انتشارا من خلال نشر بخار3. شنقا قطرة بلورة يسمح نمو بلورات في قطرات كبيرة تتراوح بين 10-25 ميكرولتر، في حين يمكن إعداد قطرات أكبر تتراوح بين ~ 50 ميكرولتر باستخدام المتاحة تجاريا يجلس إسقاط equipment14،54. يمكن استخدام ألواح زجاجية من تسع آبار السيليكون لإعداد قطرات كبيرة جدا ، مع أحجام تصل إلى 800 ميكرولتر. يتم وضع هذه الألواح الزجاجية في "صناديق ساندويتش" متاحة تجاريا من أبحاث هامبتون. وتشمل تقنيات التبلور الأخرى تبلور الدفعة ، حيث يتم إملاء حد حجم القطرة من قبل السفينة. يمكن أن تتراوح تجربة تبلور الدفعات التي تم إعدادها من الميكرويلترات إلى ملليلتر55. يمكن أيضا إجراء التبلور باستخدام تقنية غسيل الكلى التي يتم فيها توازن البروتين مع المتعجل عن طريق غشاء غسيل الكلى أو عن طريق الانتشار المضاد على طول تدرج تركيز متسرعة أو من خلال قابس مسامي مثل agarose56,57. البذر يقدم بديلا آخر للحصول على بلورات من الحجم المطلوب. وقد تم استخدام الميكرو والتكروسيد الكلي بنجاح لنمو الكريستال الكبير، بما في ذلك الكريستال الكبير من NcLPMO9D45. بعض المعرفة من الرسم البياني مرحلة البروتين، بما في ذلك تأثير درجة الحرارة على الذوبان، والمساعدة في نمو الكريستال كبيرة.
عند التخطيط لتجربة حيود نيوتروني، يعد تحسين إعداد البروتين لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء أثناء جمع بيانات الحيود أمرا ضروريا7. وللتحايل على إلغاء الكثافة والتشتت غير المتماسك العالي الناجم عن ذرات H، يمكن تحسين خرائط SLD النيوترونية عن طريق تبادل ذرات H نظيرتها D، التي تمتلك طولا إيجابيا متماسكا للتشتت وطولا منخفضا غير متماسك للتشتت. لتحقيق ذلك ، يتم تنفيذ تبادل بخار بلورة البروتين المهدرجة ضد حاجز التبلور deuterated. وهذا يضمن تبادل H / D من جزيئات المذيبات والبروتين labile، titratable H atoms23. يتم تنفيذ تبادل بخار عن طريق تركيب الكريستال المهدرجة في الشعيرات الدموية الكوارتز مع D2O المستندة إلى, deuterated تبلور العازلة "المقابس" ويمثل فعالة, تقنية لطيف الذي يتم تطبيقه في معظم الأحيان14,23,35. يمكن أن يستغرق التبادل عدة أسابيع ويفضل أن يتطلب المخزن المؤقت deuterated لتغييرها بشكل متكرر لضمان تبادل H/D الأقصى. ويمكن أيضا أن يتم تبادل H / D عن طريق نقع مباشرة الكريستال في العازلة deuterated. لتجنب وضع الكريستال تحت الضغط بسبب التعرض D2O، ينبغي أن يتم تنفيذ عملية نقع تدريجيا عن طريق زيادة تدريجية في نسبة D2O:H2O58. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تبلور البروتين المهدرجة يمكن القيام به في العازلة deuterated لتبادل H / D في مواقع labile H22,59. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن العازلة القائمة على D2O لها تأثير على قابلية الذوبان البروتين تتطلب المزيد من التكيف من الظروف المعروفة القائمة على H2O3،59. كما لوحظ أن المخازن المؤقتة القائمة على D2O تؤدي إلى بلورات أصغر في بعض الحالات59. ويمكن تحقيق التبادل الكامل لذرات H القابلة للتكرار والمرتبطة بالكربون إلى D من خلال التعبير عن البروتينات في الوسائط المشوهة لتوليد عينة من المواد ثنائية التحلل20. وسيتم تحسين خرائط SLD النيوترونية الناتجة عن العينة المتحللة بشكل كبير، ولن تعرض بعد الآن إلغاء كثافة نظير العينة المهدرجة. وهذا مفيد عند توصيف H / D ملزمة في مواقع غير قابلة للتبادل في البروتين أو عامل مساعد. ومع ذلك، فإن التعبير عن البروتين ثنائي البروتينات مرتفع التكلفة ومنخفض في الغلة60. يقدم مركز مختبر أوك ريدج الوطني (ORNL) للبيولوجيا الجزيئية الهيكلية (CSMB) منشأة للديوتر للمستخدمين الذين يسعون إلى توليد عينة متحللة (https://www.ornl.gov/facility/csmb). عادة ما يتم تنفيذ التعبير perdeuterated في مفاعل حيوي على مقياس 1 لتر تسفر عن ~ 50 ملغ من البروتين النقي61.
بعد جمع بيانات الحيود النيوتروني، يتم إجراء الصقل وبناء نموذج تفاعلي. يمكن تشغيل التحسين باستخدام مجموعات برامج متعددة بما في ذلك phenix.refine أو nCNS أو SHELXL28،31،32،33. جناح فينيكس هو البرنامج الأكثر استخداما لصقل بيانات الحيود النيوتروني بالتزامن مع كوت الذي يستخدم لبناء النموذج يدويا من خرائط SLD النيوترونية34. على الرغم من أن كلا من فينيكس وكوت تسمح لمعالجة بيانات حيود النيوترون، فإنها قد تفتقر إلى بعض الميزات اللازمة لمعالجة الخصوصيات المرتبطة ببيانات النيوترونات والعينات deuterated. فعلى سبيل المثال، لا يحتوي Coot على تحسين هندسي للمخلفات التي تم إزالة الكوليسترول منها، مما قد يؤدي إلى مضاعفات أثناء بناء النموذج نظرا لأن ميزة "تحسين المساحة الحقيقية" تؤدي إلى بقايا "متفجرة" (الشكل التكميلي 26)62. ويمكن حل هذا عن طريق إنشاء ملفات ضبط النفس لجميع المخلفات deuterated. ومع ذلك، هذه عملية مكثفة وهذه المكتبات غير متاحة للجمهور حاليا. عند إجراء التحسينات في فينيكس، سيتم تعيين مواقع H/D القابلة للتبادل في البداية إلى 0.50 إشغال H و D. ومع إجراء التحسينات، سيتم تنقيح إشغال H و D وفقا لخرائط SLD النيوترونية. خلال بناء نموذج تفاعلي، وخرائط Fo-FC كثافة الفرق هي مفيدة جدا في تقييم الإشغالات H / D. يمكن استخدام الخرائط لتحديد المواقع التي تمتلك إشغال D عالية ، وهو مفيد بشكل خاص في الموقع النشط حيث تكون حالات البروتونات ذات صلة تحفيزيا63. حالات غامضة لا تنشأ ، ومع ذلك ، عندما H: D الإشغال قريب من 0.70:0.30 مما يؤدي إلى إلغاء إشارة كاملة في خرائط SLD النيوترونية64. وينبغي أيضا أن يؤخذ في الاعتبار أن مجموعات البيانات النيوترونية شبه لاو غالبا ما يكون اكتمال حوالي 80٪، وهو أقل من ≥ 98٪ لوحظ بشكل روتيني لبيانات الحيود الأشعة السينية. عند تكرير بيانات الحيود النيوتروني في فينيكس، يتم حساب السعة الملاحظة المفقودة (Fo) من النموذج لإكمال قائمة الانعكاس، وبالتالي إدخال تحيز النموذج. ولحصر هذا التحيز المحتمل، ينبغي فحص خرائط "no_fill" أثناء بناء نموذج تفاعلي بدلا من الخرائط "المعبأة".
يمكن للمستخدمين اختيار إجراء تحسين بيانات الأشعة السينية / النيوترون المشترك لهيكلها ، أو تحسين بيانات النيوترون فقط. قد يكون تصور خرائط SLD النيوترونية ، خاصة بدقة أقل ، مقلقا في البداية خاصة بالنسبة للبروتين المهدرجة التي لا يزال H موجودا فيها في مواقع غير قابلة للتبادل على الرغم من تبادل بخار H / D. ويؤدي ذلك إلى إلغاء خريطة كثافة النيوترونات، مما يعطي انطباعا بوجود خرائط متقطعة65,66. ويكمل جمع مجموعة بيانات الأشعة السينية المقابلة هذه الإلغاءات بشكل مفيد في عملية تنقيح مشتركة (الشكل 13A والشكل 13B). وعادة ما تنطوي استراتيجية التحسين المشترك على تكرير إحداثيات العمود الفقري للبروتين مقابل بيانات الأشعة السينية، في حين تستخدم بيانات الحيود النيوتروني لصقل موضع وإشغال ذرات H/D في المواقع القابلة للتبادل28. وبما أن إدخال الإشغال المشترك ل H/D في المواقع القابلة للتبادل يزيد من عدد البارامترات التي يجري تنقيحها، فإن التحسين المشترك مع بيانات الأشعة السينية يزيد أيضا من نسبة البيانات إلى المعلمات. يتطلب تحسين المفصل مجموعة بيانات الأشعة السينية المقابلة التي سيتم جمعها بنفس درجة الحرارة على نفس الكريستال أو الكريستال الذي يزرع في نفس الظروف. بالنسبة لبيانات حيود النيوترون التي يتم جمعها في درجة حرارة الغرفة (300 كيلوبايت)، ينبغي جمع مجموعة بيانات الأشعة السينية المقابلة في درجة حرارة الغرفة باستخدام استراتيجية لجمع البيانات بجرعة منخفضة للحد من تلف الإشعاع. وعلى النقيض من ذلك، توفر العينات المتحللة خرائط محسنة ومستمرة للنيوترونات SLD لأنها لا تملك نفس حجم إلغاء إشارة H/D. ومع ذلك، فإن طول النيوترون المتناثر لبعض العناصر بما في ذلك المعادن والكبريت يجعلها غير مرئية بشكل جيد في خرائط SLD النيوترونية، حتى لو كان البروتين قد تم تخديره (الشكل 13C-F)18. إذا كان المعدن يحتاج إلى أن يتميز، فمن الأفضل للاستفادة من الحيود الأشعة السينية في صقل مشترك أو تطبيق تقنيات التحليل الطيفي لاستكمال تجارب الحيود. غالبا ما يتم إجراء تحسينات البيانات النيوترونية فقط عندما يكون لمجموعة البيانات النيوترونية دقة عالية أو إذا تم استخدام بروتين ثنائي البروتينات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تحسين البيانات بالنيوترونات فقط مفيد بشكل خاص إذا كان يجري دراسة بروتين شديد الحساسية للضرر الإشعاعي، لأن الهيكل المشتق من الأشعة السينية قد يمتلك قطعا أثرية مستحثة بالإشعاع. وإذا كان لا بد من إجراء عملية صقل للبيانات النيوترونية فقط، يجب التأكد مما إذا كانت مجموعة البيانات النيوترونية المقابلة لها اكتمال ودقة كافيان.
تقدم ORNL مرفقين لجمع بيانات حيود النيوترون: خط شعاع IMAGINE في HFIR وكذلك خط الحزم MaNDi في SNS36,67. وفي حين أن كلا الجهازين يوفران وسائل فعالة لجمع مجموعة بيانات حيود نيوترونية تستخدم مبادئ مماثلة، فإن لكل أداة مواصفات فريدة ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند التقدم بطلب للحصول على وقت الحزمة. تجمع IMAGINE بيانات شبه Laue وتم تحسينها لجمع بيانات درجة حرارة الغرفة على البلورات مع خلايا وحدة تصل إلى ~ 100 Å. يمكن استخدام MaNDi لجمع بيانات درجة حرارة الغرفة ودرجة حرارة التبريد التي تستخدم مجموعة TOF-Laue على بلورات مع خلايا وحدة تصل إلى ~ 300 Å. قبل جمع مجموعة بيانات كاملة، يتم إجراء اختبار على البلورة لتقييم جودة نمط الحيود الذي تم الحصول عليه والذي تتعرض فيه البلورة للشعاع النيوتروني لإطار واحد. وإذا كانت البلورة ذات جودة كافية، سيتم جمع مجموعة بيانات كاملة عن حيود النيوترونات وفهرستها ودمجها وتحجيمها ودمجها في عملية مماثلة لمعالجة بيانات الأشعة السينية. تخيل يجعل من استخدام Lauegen وLscale وMaNDi يستخدم حزمة Mantid ويستخدم ملف تعريف ثلاثي الأبعاد fitting48,50,51,68,69,70. وسيتم تزويد العلماء الذين يصبحون مستخدمين في أي من هذه المرافق بمجموعة بيانات في شكل MTZ أو HKL لمزيد من التحليل.
الحيود النيوتروني هو تقنية غير مدمرة وحساسة للغاية للتحقيق في حالة البروتونات وتفاعلات رابطة الهيدروجين للجزيئات الكبيرة البيولوجية. وهو مفيد بشكل خاص للبروتينات الحساسة للصور والبروتينات المعدنية. يجب أخذ العديد من الاعتبارات المتعلقة بهذه التقنية وكذلك معالجة البيانات في الاعتبار قبل إجراء تجربة ، ولكن النتائج تسفر عن نتائج قد تعطي فكرة قيمة عن الآلية الحفازة للبروتين ذي الاهتمام. يكمل علم بلورات البروتين النيوتروني الدراسات الحسابية والهيكلية والبيوكيميائية والمطيافية، مما يجعله أداة قيمة في مجموعة أدوات البيولوجيا من التقنيات المستخدمة لتوصيف الجزيئات البيولوجية.

البلورات الجزيئية النيوترونية هي تقنية توفر نافذة فريدة من نوعها في هيكل والكيمياء الكامنة وراء البروتينات. من الناحية المفاهيمية مماثلة للانعراج الأشعة السينية، الحيود النيوتروني يوفر تفاصيل ذرية من الهيكل الجزيئي الكلي، ومع ذلك، فإن التفاعل بين النيوترونات مع النواة تمكن توطين ذرات الضوء، وغالبا ما يصعب الكشف عن مع الحيود الأشعة السينية1. أثناء حيود الأشعة السينية، تنتشر الأشعة السينية من سحابة الإلكترون، مما يجعل ذرات الضوء مثل الهيدروجين (H) غير مرئية بشكل جيد في خرائط كثافة الإلكترون التي ليس لديها دقة قريبة من Ångström الفرعية2. وعلى النقيض من ذلك، تعتمد كثافة تشتت النيوترونات على التفاعلات المعقدة مع النواة، حيث تظهر النظائر من نفس العنصر أطوالا متناثرة مختلفة. لذلك، فإن ذرات الضوء ونظائرها، مثل الهيدروجين (1H) والديوتريوم (2H أو D)، لديها رؤية مماثلة لذرات الكربون والنيتروجين والأوكسجين العمود الفقري في خرائط كثافة طول النيوترونات المتناثرة (SLD). وعلاوة على ذلك، وبما أن حجم تشتت النيوترونات مستقل عن عدد الإلكترونات، فإن التشتت من العناصر الخفيفة لا تحجبه العناصر الثقيلة عندما تكون قريبة من بعضها البعض، كما يلاحظ في تشتت الأشعة السينية. إن الرؤية المعززة ل H ونظائرها D عند استخدام الحيود النيوتروني توفر معلومات قيمة حول حالة بروتونات المخلفات والعوامل المساعدة والليجاندات المهمة الحفازة ويساعد على توجيه جزيئات الماء ، مما يكشف عن معلومات مهمة حول الآليات الحفازة وكيمياء البروتين3. كما يوفر الحيود النيوتروني ميزة كونه تقنية غير مدمرة ، تناسب بشكل خاص العينات البيولوجية الحساسة للتأين مثل البروتينات ذات المراكز المعدنية أو العوامل المساعدة للأكسدة الحساسة للضوء2. التركيز الأساسي لهذه المادة هو تقديم لمحة عامة عن سير العمل للحصول على بنية بلورية عالية الجودة البروتين النيوتروني. نحيل القارئ المهتم إلى بودجارني وآخرون.4، بليكلي5، بليكلي وآخرون.6 وO'Dell et al.3 للحصول على نظرة عامة ممتازة على حيود البروتين النيوتروني وأشر وآخرون.7 لمزيد من التطبيقات من تشتت النيوترونات.
يتم توليد النيوترونات في المقام الأول أثناء التفاعلات النووية باستخدام أي من عمليتين: الانشطار النووي في مصادر المفاعل أو التشنج في مصادر قائمة على المسرع8. وتوفر مصادر المفاعل شعاعا نيوترونيا مستمرا باستخدام الانشطار النووي للنظائر 235U بينما تنتج مصادر النيوترونات النابضة شعاعا نيوترونيا نابضا بقصف هدف، على سبيل المثال معدن سائل مثل الزئبق، بالبروتونات9. يستضيف مختبر أوك ريدج الوطني (ORNL) في أوك ريدج بولاية تينيسي مصدر نيوتروني ثابت الحالة في مفاعل نظائر التدفق العالي (HFIR) ومصدر نبضي 60 هرتز في مصدر نيوترون سباليشن (SNS). خط شعاع IMAGINE، الموجود في HFIR، هو مقياس نيوتروني للنافرات الأمثل للجزيئات الكلية البيولوجية (الشكل التكميلي 1)10. تستخدم IMAGINE كاشف لوحة صورة نيوترونية لقياس بيانات شبه Laue باستخدام ممر ضيق في نطاق 2.8 - 4.5 Å من بلورات مفردة مع حواف خلايا وحدة <150 Å. مقياس النيوترونات الجزيئي الكلي Diffractometer (MaNDi)، الموجود في SNS، هو مقياس نيوتروني لاوي (TOF) مزود بإطار صفيف كاشف كروي (DAF) (الشكل التكميلي 2)11. MaNDi يقيس البيانات من بلورات واحدة مع حواف الخلية وحدة في نطاق 10 - 300 Å عن طريق توظيف عرض النطاق الترددي 2 Å-الطول الموجي غير قادر بين 2.0 - 6.0 Å12.
عملية توليد النيوترونات كثيفة الطاقة للغاية، مما يؤدي إلى تدفقات شعاع نيوترونية ضعيفة نسبيا عندما تتناقض مع تدفقات شعاع الأشعة السينية في مصادر السنكروترون13. لضمان نسب كافية من الإشارة إلى الضوضاء أثناء جمع البيانات، من الضروري زراعة بلورات ذات حجم وجودة مناسبين14. عادة، هناك حاجة إلى بلورات ذات أحجام > 0.1 مم3 لجمع البيانات مع إحصاءات كافية15. بالإضافة إلى انخفاض التدفقات ، يجب أن تؤخذ الخصائص المتأصلة للتفاعل بين النيوترونات ونوى العينة في الاعتبار16. يختلف طول النيوترونات المتناثر بالنسبة للنظائر من نفس العنصر، وهي خاصية يمكن استغلالها بشكل مفيد في تشتت النيوترونات بزاوية صغيرة (SANS) لإخفاء أو تسليط الضوء على مناطق عينة - وهي عملية تعرف باسم مطابقة التباين17. في تجارب الحيود، يمكن أن يؤدي طول نثر النيوترونات المتماسك السلبي H (-3.741 fm ل 1H) إلى إلغاء معالم خريطة كثافة التشتت النيوتروني منذ أطوال التشتت النيوترونية المتماسكة للذرات الأخرى ذات الصلة بيولوجيا ، بما في ذلك الكربون (6.6511 fm ل 12C) ، النيتروجين (9.37 fm ل 14N) ، الأكسجين (5.803 fm ل 16O) ، الفوسفور (5.13 fm ل31P) والكبريت (2.804 fm ل 32S), إيجابية (الجدول 1)12,14. وعلاوة على ذلك، فإن طول التشتت الكبير غير المتماسك ل H (25.274 fm)، يزيد من الخلفية أثناء جمع البيانات، مما يعوق جودة مجموعة البيانات ويضر بدقة البيانات7. وللتحايل على هذه القيود التي أدخلها H، من الضروري، بالنسبة للانعراج النيوتروني، أن يقايض H بنظائره الديوتريوم، 2H (D)، التي لها طول نثر نيوتروني متماسك إيجابي (6.671 fm) وطول تشتت غير متماسك بشكل ملحوظ (4.04 fm)19. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق التحلل، وهي عملية يتم فيها التعبير عن البروتين من قبل الكائنات الحية التي تزرع في وسائل الإعلام deuterated تماما ضمان الإدماج الكامل للD في المواقع H20. ومن الممكن أيضا إزالة البروتين جزئيا عن طريق استبدال H ب D فقط في المواقع القابلة للتبادل (المجموعات القابلة للترقات) في حين تظل المواقع غير القابلة للتبادل المرتبطة بالكربون مهدرجة21. ويمكن تحقيق ذلك من خلال نمو بلورات البروتين المهدرجة في الخمور الأم deuterated22. ومع ذلك، الأكثر شيوعا، يتم إجراء تبادل H / D من البروتينات المهدرجة عن طريق تبادل البخار بعد نمو بلورات كبيرة بشكل مناسب في العازلة القائمة على H2O23. في مثل هذه الحالات، يتم تركيب البلورات في الشعيرات الدموية الكوارتز وبخار متساوية مع الخمور الأم D20 مقرها.
تؤدي التدفقات النيوترونية المحدودة في المصادر النيوترونية إلى أوقات أطول لجمع البيانات، تتراوح بين أيام وعدة أسابيع24. في ORNL، يستخدم كل من IMAGINE و MaNDi ممرا ضيقا للطول الموجي في نطاق 2-6 Å لتحسين جمع البيانات25. يمكن جمع البيانات في درجة حرارة الغرفة أو في درجة حرارة التبريد. يمكن لجمع بيانات Cryo تحسين جودة البيانات ويفتح إمكانية وسيطات تحفيزية محاصرة التجميد. بعد جمع بيانات حيود النيوترون، يتم جمع مجموعة بيانات الأشعة السينية عادة على نفس الكريستالة بنفس درجة الحرارة أو على بلورة تزرع في ظل ظروف مماثلة26. ويسمح جمع البيانات في نفس درجة الحرارة بإجراء تحسين الهيكل مقابل بيانات الأشعة السينية والنيوترونات على حد سواء، مما يمنع أي قطع أثرية محتملة ناجمة عن درجة الحرارة مثل التغيرات في الرؤية وموقع المياه أو إشغال المخلفات ذات التركيبات البديلة27. ويزيد تحسين بيانات النيوترونات بالأشعة السينية المشتركة من نسبة البيانات إلى المعلمة ويوفر ميزة السماح بتنقيح إحداثيات العمود الفقري للبروتين مقابل بيانات الأشعة السينية، في حين تستخدم بيانات الحيود النيوتروني لصقل موضع ذرات H/D28. وهذا مفيد بشكل خاص عند استخدام عينات مقلية جزئيا، حيث يكون إلغاء الكثافة بسبب ذرات H في مواقع غير قابلة للتبادل على البروتين موجودا. وعلى الرغم من أن عدد هياكل الأشعة السينية يتجاوز بكثير عدد الهياكل النيوترونية المودعة في مصرف بيانات البروتين، فقد تم توسيع مجموعات البرامج المصممة في البداية لتحسين بيانات الأشعة السينية لتشمل بيانات النيوترونات فضلا عن 30 29 3. بعد جمع البيانات، يمكن تحسين النماذج باستخدام حزم التحسين مثل phenix.refine، CNSsolve (nCNS) أو SHELXL28،31،32،33. خلال عملية الصقل، يمكن تصور خرائط كثافة النيوترونات للتركيب اليدوي باستخدام COOT34. ويمكن تقديم الإحداثيات وملفات بيانات الحيود النيوترونية و/أو الأشعة السينية إلى مصرف التنمية للبلدان الأمريكية، الذي سيتحقق من صحة النموذج ويودعه، مما يجعله متاحا للجمهور 18,29,30.
التحليل الهيكلي للبروتينات هو نهج متعدد الأوجه حيث يتم استخدام العديد من التقنيات للتحقيق في وظيفتها وآلية35. يوفر علم بلورات البروتين النيوتروني رؤى كيميائية قيمة للتوسع في نتائج الدراسات الإضافية مثل حيود الأشعة السينية أو التحليل الطيفي أو الرنين المغناطيسي النووي (NMR) أو حيود الإلكترون الكريستالي الدقيق (microED)36 واستكمالها. يتم وضع حيود البروتين النيوتروني بشكل فريد لتوفير رؤى حول الآليات الأنزيمية ، لأن ذرات H أساسية لكيمياءها. عدم وجود ضرر الإشعاع الناجم عن النيوترونات جعلها التحقيق مناسبة بشكل استثنائي لدراسة metalloproteins37. ونعرض هنا مثالا تمثيليا لعملية حيود البروتين النيوتروني من إعداد العينات إلى جمع البيانات وتحسينها وتحليلها (الشكل 1). وقد نمت بلورات من حجم كاف لتجارب الحيود النيوتروني من metalloprotein Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D هو metalloprotein النحاس التي تحتوي على المشاركة في تدهور السليلوز المتمردة عن طريق إدراج ذرة الأكسجين في bond38,39 الجليكوسيدية. يحتوي الموقع النشط NcLPMO9D على مركز نحاسي أحادي نووي ضمن "دعامة هيستيدين" مميزة تتكون من الهستيدين N-terminal وهستيدين محافظ عليه ثاني (الشكل التكميلي 3)40. يتم ميثيل N-المحطة الطرفية من LPMOs الفطرية ولكن التعديل بعد الانتقالية لا يحدث أثناء التعبير المؤتلف في الخميرة. في حالة الراحة NcLPMO9D ، يكون مركز النحاس موجودا في حالة أكسدة Cu2 + ويتم تنشيطه عن طريق تقليل إلكترون واحد إلى Cu1 + ، مما يسمح للأوكسجين الجزيئي بربط وتنشيطه عن طريق تقليله بسرعة إلى نوع فائق 4142. يتطلب التفاعل العام NcLPMO9D إضافة أخرى من إلكترون واحد وبروتونين لتشكيل منتج السكريات البولية الهيدروكسيلات43. ولم يتم تحديد هوية أنواع الأكسجين المنشطة المسؤولة عن تجريد ذرة الهيدروجين (HAA) من ركيزة البوليساكريد، ولا تزال الدراسات الهيكلية والحسابية المكثفة جارية حاليا 44,45. وبالنظر إلى كيمياء الأكسدة في الموقع النشط NcLPMO9D، فإن التخفيف من الأضرار الإشعاعية وثيق الصلة بشكل خاص. نوضح هنا درجة حرارة الغرفة وجمع البيانات درجة حرارة التبريد على بلورات NcLPMO9D لتحديد هيكل NcLPMO9D في حالة الراحة وفي شكل مخفض تنشيط، على التوالي46. وسيتم التركيز على تركيب بلورة البروتين، وإعداد أداة الحزم لجمع البيانات، وإعداد البيانات وتنسيق الملفات وخطوات التحسين اللازمة لنمذجة بنية نيوترونية من جميع الذرات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length</td>
			<td>DiaDent/DiaVet</td>
			<td>218-292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary wax</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.0.077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes (50mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td></td>
			<td>Version 0.8.9.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalCap ALS</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-Tip Forceps</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>TW-CTF-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, &#8805;99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>543047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide 99.9 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Thickness MicroLoops 1000 &#181;m</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M5-L18SP-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FiveEasy pH meter F20-Std-Kit</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30266626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam Dewars Standard Vessel 800 ml</td>
			<td>Spearlab</td>
			<td>M-FD-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four Color Mounting Clay</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (T),</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector</td>
			<td>Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris</td>
			<td>XtaLAB Synergy-R</td>
			<td>Home source X-ray diffractometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Wand Straight</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M-R-1013198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 &#8211; 20 &#181;L, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks &#215; 96 pcs.)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes volume 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z606340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.14-3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin Tong 18 mm</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M-R-1013196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 0.1-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 100-1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 10-100 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 20-200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR6-146</td>
			<td>Thin-walled capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Stereomicroscope System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>GB-B3-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round - Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>CV1012</td>
			<td>Thick-walled capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandwich Box with cover</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized 9 Well Glass Plate</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well)</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>XQ-P-24S-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>176788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 0.1 - 10 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 1 - 100 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 20 - 200 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 1 - 20 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax pen</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutron crystallography data collection and processing for modelling hydrogen atoms in protein structures

علم البلورات النيوتروني هو تقنية هيكلية تسمح بتحديد مواقع ذرة الهيدروجين داخل الجزيئات البيولوجية ، مما ينتج معلومات مهمة ميكانيكيا حول حالات البروتونات والترطيب مع عدم إحداث ضرر إشعاعي. وعلى النقيض من ذلك، لا يوفر حيود الأشعة السينية سوى معلومات محدودة عن موقع ذرات الضوء، كما أن شعاع الأشعة السينية يؤدي بسرعة إلى تلف الإشعاع من العوامل المساعدة الحساسة للضوء والمراكز المعدنية. يعرض هنا سير العمل المستخدم لخطوط الشعاع IMAGINE و MaNDi في مختبر أوك ريدج الوطني (ORNL) للحصول على هيكل حيود نيوتروني بمجرد زراعة بلورة بروتينية ذات حجم مناسب (> 0.1 مم3). نحن نظهر تصاعد بلورات البروتين المهدرجة في الشعيرات الدموية الكوارتز لجمع بيانات الحيود النيوتروني. كما يتم عرض عملية تبادل البخار من بلورات محمولة مع العازلة التي تحتوي على D2O لضمان استبدال ذرات الهيدروجين في مواقع قابلة للتبادل مع الديوتريوم. ويقلل دمج الديوتريوم من الخلفية الناشئة عن التشتت غير المتماسك لذرات الهيدروجين ويمنع إلغاء الكثافة الناجم عن طول التشتت المتماسك السلبي. يتم توضيح استراتيجيات محاذاة العينات وجمع بيانات درجة حرارة الغرفة باستخدام جمع بيانات شبه لاو في IMAGINE في مفاعل نظائر التدفق العالي (HFIR). وعلاوة على ذلك، يظهر تصاعد الكريستال وتجميد سريع في النيتروجين السائل لجمع البيانات المبردة لاعتراض وسيطة رد فعل اللبن في أداة MaNDi وقت الطيران في مصدر النيوترون Spallation (SNS). كما سيتم تناول إعداد ملفات بيانات التنسيق والحيود النموذجية وتصور خرائط كثافة طول النيوترونات المتناثرة. وسوف تناقش أخيرا صقل الهيكل ضد البيانات النيوترونية فقط أو ضد بيانات الأشعة السينية/النيوترونات المشتركة للحصول على بنية من كل الذرات للبروتين المثير للاهتمام. سيتم إثبات عملية تحديد بنية نيوترونية باستخدام بلورات من البولي السكريد الليكاريدي أحادي الأكسجين العصبي crassa LPMO9D ، وهو ميتالوبروتين يحتوي على النحاس يشارك في تدهور السكريات البولية المتمردة عن طريق الانقسام التأكسدي للسند الجليكوسيديك.

Watch this Scientific Journal Video about Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures at JoVE.com

Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures

البلورات البروتين النيوتروني هو تقنية الهيكلية التي تسمح توطين ذرات الهيدروجين، وبالتالي توفير تفاصيل ميكانيكية هامة من وظيفة البروتين. نقدم هنا سير العمل لتركيب بلورة البروتين، وجمع بيانات الحيود النيوتروني، وصقل الهيكل وتحليل خرائط كثافة طول النيوترون المتناثرة.

جمع بيانات البلورات النيوترونية ومعالجتها لنمذجة ذرات الهيدروجين في هياكل البروتين

Neutron crystallography is a structural technique that allows determination of hydrogen atom positions within biological macromolecules, yielding ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

تحليل ديناميات البروتين عن طريق صرف الهيدروجين الطيف الكتلي

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Supercritical Nitrogen Processing for the Purification of Reactive Porous Materials

تجهيز النيتروجين فوق الحرج لتنقية رد الفعل المواد المسامية

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. ...

Functionalization of Single-walled Carbon Nanotubes with Thermo-reversible Block Copolymers and Characterization by Small-angle Neutron Scattering

Functionalization من احد الجدران الكربون الأنابيب النانومترية مع الحرارية عكسها البوليمر كتلة وتوصيف كل زاوية صغيرة تشتت النيوترونات

We demonstrate a protocol for single-walled carbon nanotube functionalization using thermo-sensitive PEO-PPO-PEO triblock copolymers in an aqueous ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

حيود الأشعة السينية مسحوق في علوم الحفظ: نحو روتيني البنية البلورية تحديد التآكل المنتجات على كائنات التراث الفن

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Highly Stable, Functional Hairy Nanoparticles and Biopolymers from Wood Fibers: Towards Sustainable Nanotechnology

مستقرة للغاية، وظيفية مشعر النانوية والبوليمرات الحيوية من ألياف الخشب: نحو تقنية النانو المستدام

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

تخليق البروتين Bioconjugates<em&gt; عبر</em&gt; سيستين-maleimide الكيمياء

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

رقائق موائع جزيئية لنثر الخفيفة الديناميكية في الموقع حيود الأشعة السينية كريستال و في الموقع لعلم البلورات المسلسل

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Experimental Methods for Efficient Solar Hydrogen Production in Microgravity Environment

الأساليب التجريبية لإنتاج الهيدروجين الفعال بالطاقة الشمسية في بيئة الجاذبية الصغريه

Long-term space flights and cis-lunar research platforms require a sustainable and light life-support hardware which can be reliably employed outside the ...

Synthesis of Metal Nanoparticles Supported on Carbon Nanotube with Doped Co and N Atoms and its Catalytic Applications in Hydrogen Production

تخليق الجسيمات النانوية المعدنية المدعومة على أنبوب الكربون النانوي مع ذرات Co و N المنشطة وتطبيقاتها الحفازة في إنتاج الهيدروجين

A method for facile synthesis of nanostructured catalysts supported on carbon nanotubes with atomically dispersed cobalt and nitrogen dopant is presented ...

Hydrogen Production and Utilization in a Membrane Reactor

إنتاج الهيدروجين واستخدامه في مفاعل غشائي

Industrial hydrogenation consumes ~11 Mt of fossil-derived H2 gas yearly. Our group invented a membrane reactor to bypass the need to use H2 gas for ...