Name: neutron crystallography data collection and processing for modelling hydrogen atoms in protein structures
Uploaded: 2020-12-01T15:00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures at JoVE.com

Proteinekspression, rensning og krystallisering eksperimenter blev udført på Center for Structural Molecular Biology (CSMB), en amerikansk Department of Energy Biological and Environmental Research User Facility på Oak Ridge National Laboratory. Neutron diffraktion data blev indsamlet på BL-11B MaNDi på Spallation Neutron Source (SNS) på ORNL, som er sponsoreret af Scientific User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, US Department of Energy. Forfatterne takker Brendan Sullivan for hjælp til datareduktion. X-ray diffraktion data blev indsamlet på Molecular Education, Technology, and Research Innovation Center (METRIC) faciliteter på North Carolina State University, som er støttet af staten North Carolina. GCS anerkender støtte til dels fra National Research Foundation (NRF), Sydafrika og Graduate Opportunities (GO!) program på ORNL. FM anerkender støtte fra USDA NIFA Hatch 211001.

Forfatterne har intet at afsløre.

Neutronproteinkrystallografi er en meget følsom teknik til sonde protonationstilstande og vandmolekyleoriorientering i proteiner. Disse oplysninger kaster lys over proteinkatalytiske mekanismer, da ændringer i protonerings- og hydrogenbindingsinteraktioner ofte er centrale for enzymkemi10. Neutronproteinkrystallografi, omend en informativ teknik, har en række faktorer, der bør tages i betragtning, før man planlægger at gennemføre et neutron diffraktionseksperiment, nemlig:
<ol><li>Kravet om store proteinkrystaller til dataindsamling.</li>
	<li>Spredningsegenskaberne for brint og andre elementer, såsom metalioner.</li>
	<li>Begrænsninger i strukturen raffinement og model bygning software, når du arbejder med deuterated prøver.</li>
</ol>Neutronproteinkrystallografi er en flux begrænset teknik. I modsætning til røntgen diffraktion datasæt, højere R-faktorer og lavere fuldstændighed, redundans og signal-til-støj nøgletal forventes for neutron datasæt på grund af teknikken iboende begrænsninger (flux begrænset, kvasi-Laue, længere bølgelængder). Dataindsamling af en enkelt ramme er typisk 12 - 18 timer. Succes af et eksperiment er meget afhængig af prøvestørrelse og kvalitet med krystaller på 0,1 mm3 ofte er minimumskravet3. Neutron diffraktion kræver produktion af store mængder protein til at oprette krystallisering dråber spænder fra 10 til 800 μL. Minimumsvolumen for dyrkning af tilstrækkeligt store krystaller kan estimeres ved hjælp af en volumenberegner i betragtning af krystal- og prøveparametrene (https://neutrons.ornl.gov/imagine). Vækst af store krystaller er mest udbredt blevet udført af damp diffusion3. Hængende dråbe krystallisering tillader vækst af krystaller i store dråber fra 10-25 μL, mens større dråber spænder op til ~ 50 μL kan sættes op ved hjælp af kommercielt tilgængelige siddende drop udstyr14,54. Silikone ni-brønd glasplader kan bruges til at oprette meget store dråber, med mængder op til 800 μL. Disse glasplader er placeret i "sandwich kasser" kommercielt tilgængelige fra Hampton Research. Yderligere krystalliseringsteknikker omfatter batchkrystallisering, hvor grænsen for dråbestørrelsen dikteres af fartøjet. Batch crystallisering eksperiment oprettet kan variere fra mikroliter til milliliter55. Krystallisering kan også udføres ved hjælp af dialyse teknik, hvor proteinet er ekvilibreret med bundfald via en dialysemembran eller ved counter-diffusion langs en bundfald koncentration gradient eller gennem en porøs stik såsom agarose56,57. Såning tilbyder et andet alternativ til at opnå krystaller af det ønskede volumen. Mikro- og makroseeding er med succes blevet anvendt til stor krystalvækst, herunder stor krystal af NcLPMO9D45. En vis viden om protein fase diagram, herunder indflydelse af temperaturen på opløselighed, støtte i stor krystal vækst.
Når du planlægger en neutron diffraktion eksperiment, optimering af proteinpræparatet for at maksimere signal-til-støj-forholdet under diffraktion dataindsamling er afgørende7. For at omgå densitetsreduktion og høj usammenhængende spredning forårsaget af H-atomer kan neutron SLD-kort forbedres ved at udveksle H-atomer til dets isotop D, som har en positiv sammenhængende spredningslængde og lav usammenhængende spredningslængde. For at opnå dette udføres dampudveksling af den hydrogenerede proteinkrystal mod deuterated krystalliseringsbuffer. Dette sikrer H/D udveksling af opløsningsmiddelmolekyler og labile, titratable protein H atomer23. Damp udveksling udføres ved montering af hydrogenerede krystal i en kvarts kapillær med D2O-baserede, deuterated krystallisering buffer "stik", og det repræsenterer en effektiv, blid teknik, der oftest anvendes14,23,35. Udvekslingen kan tage flere uger og kræver helst, at den deutererede buffer ofte ændres for at sikre maksimal H / D-udveksling. H/D-udveksling kan også udføres ved direkte at ibløde krystallen i deuterated buffer. For at undgå at sætte krystallen under pres på grund af D2O-eksponering bør blødningsprocessen udføres gradvist ved gradvist at øge D2O:H2O-forholdet58. Ud over dette, krystallisering af hydrogeneret protein kan også udføres i deuterated buffer for H / D udveksling på labile H sites22,59. Det skal dog bemærkes, at D2O-baseret buffer har en effekt på proteinopløseligheden, hvilket kræver yderligere justering af de kendte H2O-baserede betingelser3,59. D2O-baserede buffere er også blevet observeret for at føre til mindre krystaller i nogle tilfælde59. Fuld udveksling af titratable og kulstofbundne H-atomer til D kan opnås ved at udtrykke proteiner i deuterated medier for at generere en perdeutereret prøve20. De resulterende neutron SLD-kort over den perdeutererede prøve vil blive væsentligt forbedret, hvilket ikke længere viser densitetsannullering af det hydrogenerede prøvemodstykke. Dette er gavnligt, når man karakteriserer H/D bundet på ikke-udskiftelige steder i et protein eller en cofaktor. Men, udtryk for perdeuterated protein er både høj i omkostninger og lav i udbytte60. Oak Ridge National Laboratory (ORNL) Center for Structural Molecular Biology (CSMB) tilbyder en deuteration facilitet for brugere, der søger at generere en perdeuterated prøve (https://www.ornl.gov/facility/csmb). Perdeuterated udtryk er typisk udføres i en bioreaktor på 1 L skala giver ~ 50 mg renset protein61.
Efter indsamling af neutron diffraktion data, raffinement og interaktiv model bygning udføres. Raffinement kan køres ved hjælp af flere softwarepakker, herunder phenix.forfine, nCNS eller SHELXL28,31,32,33. Den Phenix suite er den mest almindeligt anvendte software til raffinement af neutron diffraktion data i forbindelse med Coot, som bruges til manuelt at bygge modellen fra neutron SLD kort34. Selv om både Phenix og Coot giver mulighed for behandling af neutron diffraktion data, de kan mangle visse funktioner, der er nødvendige for at behandle idiosynkrasier forbundet med neutrondata og deuterated prøver. For eksempel indeholder Coot ikke geometrioptimering for deutererede rester, hvilket kan føre til komplikationer under modelopbygning, da funktionen "Real Space Refine" resulterer i "eksploderende" rester (supplerende figur 26)62. Dette kan løses ved at generere tilbageholdenhed filer for alle deuterated rester. Dette er imidlertid en intensiv proces, og sådanne biblioteker er i øjeblikket ikke offentligt tilgængelige. Når du udfører forbedringer i Phenix, vil udskiftelige H / D sites i første omgang blive indstillet til 0,50 belægning for H og D. Som forbedringer udføres, vil belægningen af H og D blive raffineret i henhold til neutron SLD kort. Under interaktiv modelbygning er forskelstæthed Fo-Fc-kort meget informative til vurdering af H / D-belægninger. Kort kan bruges til at bestemme, hvilke steder der besidder høj D belægning, hvilket er særligt informativt på det aktive sted, hvor protonationstilstande er katalytisk relevante63. Der opstår imidlertid tvetydige situationer, når H:D belægningen er tæt på 0.70:0.30, hvilket resulterer i fuldstændig signal annullering i neutron SLD kort64. Det bør også tages i betragtning, at kvasi-Laue neutron datasæt ofte har fuldstændighed omkring 80%, hvilket er lavere end den rutinemæssigt observerede ≥ 98% for X-ray diffraktion data. Ved raffinering neutron diffraktion data i Phenix, de manglende observerede amplituder (Fo) er derfor beregnet ud fra modellen til at fuldføre refleksion listen, og dermed indføre model bias. For at tage højde for denne potentielle bias "no_fill" kort bør undersøges under interaktiv model bygning i modsætning til "fyldte" kort.
Brugere kan vælge at udføre en fælles X-ray / neutron data raffinement af deres struktur, eller en neutron-data kun raffinement. Visualisering neutron SLD kort, især ved lavere opløsning, kan i første omgang være foruroligende især for et hydrogeneret protein, hvor H stadig er til stede på ikke-udskiftelige steder på trods af H / D damp udveksling. Dette resulterer i neutrontæthed kort aflysninger, hvilket giver indtryk af diskontinuerlige kort65,66. Indsamling af et tilsvarende røntgendatasæt supplerer med fordel disse aflysninger i en fælles raffinement (figur 13A og figur 13B). En fælles raffinement strategi indebærer typisk raffinering af protein rygrad koordinater mod X-ray data, mens neutron diffraktion data bruges til at forfine position og belægning af H / D atomer på udskiftelige steder28. Da indførelsen af fælles H/D-belægning på udskiftelige steder øger antallet af parametre, der raffineres, øger en fælles raffinement med røntgendata også data-til-parameter-forholdet. En fælles raffinement kræver, at et tilsvarende røntgendatasæt indsamles ved samme temperatur på samme krystal eller en krystal, der dyrkes under de samme forhold. For neutron diffraktionsdata indsamlet ved stuetemperatur (300K) bør det tilsvarende røntgendatasæt indsamles ved stuetemperatur ved hjælp af en strategi for indsamling af lavdosisdata for at begrænse strålingsskader. Perdeutererede prøver giver derimod forbedrede og kontinuerlige neutron-SLD-kort, da de ikke har samme størrelse af H/D-signalaflysning. Neutronspredningslængden af visse elementer, herunder metaller og svovl, gør dem imidlertid dårligt synlige i neutron-SLD-kort, selv om proteinet er blevet perdeutereret (figur 13C-F)18. Hvis et metal skal karakteriseres, er det bedst at udnytte røntgen diffraktion i en fælles raffinement eller anvende spektroskopiske teknikker til at supplere diffraktion eksperimenter. Datajusteringer, der kun er for neutron, udføres ofte, når neutrondatasættet har høj opløsning, eller hvis der blev anvendt et perdeutereret protein. Desuden er dataraffinering kun for neutroner særlig nyttig, hvis et protein, der er meget følsomt over for strålingsskader, undersøges, da en røntgenafledt struktur kan besidde strålingsinducerede genstande. Hvis der skal udføres en raffinement, der kun er for neutrondata, skal det undersøges, om det tilsvarende neutrondatasæt har tilstrækkelig fuldstændighed og opløsning.
ORNL tilbyder to faciliteter til indsamling af neutron diffraktionsdata: IMAGINE-strålelinjen på HFIR samt MaNDi-strålelinjen ved SNS36,67. Mens begge instrumenter giver effektive midler til indsamling af en neutron diffraktion datasæt anvender lignende principper, hvert instrument har unikke specifikationer, der bør tages i betragtning, når der ansøges om stråletid. IMAGINE indsamler kvasi-Laue data og er optimeret til rumtemperatur dataindsamling på krystaller med enhedsceller op til ~ 100 Å. MaNDi kan bruges til indsamling af stuetemperatur og kryo-temperatur data anvender TOF-Laue indsamling på krystaller med enhed celler op til ~ 300 Å. Før der indsamles et komplet datasæt, udføres der en test på krystallen for at evaluere kvaliteten af det opnåede diffraktionsmønster, hvor krystallen udsættes for neutronstrålen for en enkelt ramme. Hvis krystallen er af tilstrækkelig kvalitet, vil et fuldstændigt neutron diffraktionsdatasæt blive indsamlet, indekseret, integreret, skaleret og flettet i en proces svarende til røntgendatabehandling. IMAGINE gør brug af Lauegen og Lscale og MaNDi udnytter Mantid-pakken og anvender tredimensionel profiltilpasning48,50,51,68,69,70. Forskere, der bliver brugere på et af disse faciliteter, vil blive forsynet med et datasæt i MTZ- eller HKL-format til yderligere analyse.
Neutron diffraktion er en ikke-destruktiv, meget følsom teknik til sondering protonation tilstand og hydrogenbinding interaktioner af biologiske makromolekyler. Det er især nyttigt til fotofølsomme proteiner og metalloproteiner. Der skal tages hensyn til flere overvejelser vedrørende teknikken samt behandlingen af dataene, før der gennemføres et eksperiment, men resultatet giver resultater, som kan give værdifuld indsigt i den katalytiske mekanisme af proteinet af interesse. Neutronproteinkrystallografi supplerer beregningsmæssige, strukturelle, biokemiske og spektroskopiske undersøgelser, hvilket gør det til et værdifuldt værktøj i biologens værktøjskasse af teknikker, der bruges til at karakterisere biologiske makromolekyler.

Neutron makromolektær krystallografi er en teknik, der giver et unikt vindue ind i strukturen og underliggende kemi af proteiner. Begrebsmæssigt ligner X-ray diffraktion, neutron diffraktion giver atomistiske detaljer om makromolekylær struktur, men samspillet mellem neutroner med kerner muliggør lokalisering af lysatomer, ofte vanskeligt at opdage med X-ray diffraction1. Under X-ray diffraktion spredes røntgenstråler fra elektronskyen, hvilket gør lette atomer som brint (H) dårligt synlige i elektrontæthedskort, der ikke har nær sub-Ångström-opløsning2. I modsætning hertil afhænger spredningsintensiteten af neutroner af komplekse interaktioner med kernen, hvor isotoper af samme element viser forskellige spredningslængder. Derfor har lette atomer og deres isotoper, såsom hydrogen (1H) og deuterium (2H eller D), sammenlignelig synlighed til rygraden kulstof, kvælstof og ilt atomer i neutron spredning længdetæthed (SLD) kort. Da størrelsen af neutronspredningen er uafhængig af antallet af elektroner, skjules spredning fra lyselementer ikke af tunge grundstoffer, når de er i tæt nærhed med hinanden, som det ses i røntgenspredning. Den forbedrede synlighed af H og dets isotop D, når der anvendes neutron diffraktion giver værdifulde oplysninger om protonation tilstand af katalytisk vigtige rester, cofaktorer og ligands og hjælper orienteringen af vandmolekyler, afslører vigtige oplysninger om katalytiske mekanismer og protein kemi3. Neutron diffraktion giver også den fordel at være en ikke-destruktiv teknik, der er særligt velegnet til biologiske prøver, der er følsomme over for ionisering, såsom proteiner med metalcentre eller lysfølsomme redox cofactors2. Det primære fokus i denne artikel er at give et overblik over arbejdsgangen for at opnå en høj kvalitet neutronprotein krystal struktur. Vi henviser den interesserede læser til Podjarny et al.4, Blakeley5, Blakeley et al.6 og O'Dell et al.3 for et glimrende overblik over neutronprotein diffraktion og Ashkar et al.7 til yderligere anvendelser af neutronspredning.
Neutroner genereres primært under nukleare reaktioner, der anvender en af to processer: nuklear fission ved reaktorkilder eller spallation på acceleratorbaserede kilder8. Reaktorkilder giver en kontinuerlig neutronstråle ved at anvende nuklear fission af 235U-isotopen, mens spallation neutronkilder producerer en pulserende neutronstråle ved at bombardere et mål, for eksempel et flydende metal som kviksølv, med protoner9. Oak Ridge National Laboratory (ORNL) i Oak Ridge, Tennessee, er vært for både en steady-state neutron kilde på High Flux Isotope Reactor (HFIR) og en 60 Hz pulserende kilde på Spallation Neutron Source (SNS). IMAGINE beamline, der er placeret på HFIR, er et neutron diffraktometer optimeret til biologiske makromolekyler (supplerende figur 1)10. IMAGINE anvender en neutronbilledpladedetektor til at måle kvasi-Laue-data ved hjælp af en smal båndføring i intervallet 2,8 – 4,5 Å fra enkelte krystaller med blokcellekanter <150 Å. Det makromolekylære neutron diffraktometer (MaNDi), der er placeret på SNS, er et flyvetid (TOF) Laue neutron diffraktometer udstyret med en sfærisk detektor array ramme (DAF) (supplerende figur 2)11. MaNDi måler data fra enkelte krystaller med enhedscellekanter i intervallet 10 – 300 Å ved at anvende en tunable 2 Å-bølgelængde båndbredde mellem 2,0 – 6,0 Å12.
Processen med at generere neutroner er meget energiintensiv, hvilket resulterer i relativt svage neutronstråle fluxes, når de står i kontrast til røntgenstråle fluxes på synkrotronkilder13. For at sikre tilstrækkelige signal-til-støj-forhold under dataindsamlingen er det nødvendigt at dyrke krystaller af passende størrelse og kvalitet14. Typisk er krystaller med volumener > 0,1 mm3 nødvendige for at indsamle data med tilstrækkelig statistik15. Ud over lavere fluxer skal der tages hensyn til iboende egenskaber ved samspillet mellem neutroner og prøvekernerne16. Spredningslængden af neutroner adskiller sig for isotoper af samme grund, en egenskab, der med fordel kan udnyttes i lille vinkel neutronspredning (SANS) til at maskere eller fremhæve områder af en prøve - en proces kendt som kontrast matching17. I diffraktionsforsøg kan den negative sammenhængende neutronspredningslængde af H (-3.741 fm til 1H) føre til annullering af neutronspredningstæthedskortfunktioner siden de sammenhængende neutronspredningslængder af andre biologisk relevante atomer, herunder kulstof (6,6511 fm for 12C), nitrogen (9,37 fm for 14N), ilt (5.803 fm for 16O), fosfor (5,13 fm for 31P) og svovl (2,804 fm for 32S), er positive (tabel 1)12,14. Desuden øger den store usammenhængende spredningslængde på H (25.274 fm) baggrunden under dataindsamlingen, hæmmer kvaliteten af datasættet og kompromitterer dataopløsning7. For at omgå disse begrænsninger, der er indført af H, er det for neutron diffraktion nødvendigt at udskifte H for dets isotopdeuterium, 2H(D), som har en positiv sammenhængende neutronspredningslængde (6.671 fm) og betydeligt lavere usammenhængende spredningslængde (4,04 fm)19. Dette kan opnås ved perdeuteration, en proces, hvor proteinet udtrykkes af organismer dyrket i fuldt deuterated medier, der sikrer fuldstændig inkorporering af D på H sites20. Det er også muligt delvist at deutere protein ved at erstatte H med D udelukkende på de udskiftelige steder (titratable grupper), mens de ikke-udskiftelige kulstofbundne steder forbliver hydrogenerede21. Dette kan opnås ved vækst af hydrogenerede proteinkrystaller i deuterated moderlud22. Oftest dog, H / D udveksling af hydrogenerede proteiner udføres af damp udveksling efter vækst af passende store krystaller i H2O-baserede buffer23. I sådanne tilfælde er krystaller monteret i en kvarts kapillær og damp-ekvilibreret med en D20-baseret moderlud.
De begrænsede neutronfluxer ved neutronkilder resulterer i længere dataindsamlingstider, der spænder fra dage til flere uger24. Hos ORNL anvender både IMAGINE og MaNDi en smal bølgelængdebåndpass i 2-6 Å-serien for at optimere dataindsamlingen25. Data kan indsamles ved stuetemperatur eller ved kryotemperatur. Indsamling af kryodata kan potentielt forbedre datakvaliteten og åbner mulighed for frysefangst af katalytiske mellemprodukter. Efter indsamling af neutron diffraktionsdata indsamles der typisk et røntgendatasæt på samme krystal ved samme temperatur eller på en krystal, der dyrkes under identiske forhold26. Dataindsamling ved samme temperatur gør det muligt at foretage strukturraffinering i forhold til både røntgen- og neutrondata, hvilket forhindrer eventuelle temperaturinducerede genstande såsom ændringer i vandets synlighed og position eller belægninger af restkoncentrationer med alternative konformationer27. Fælles X-ray neutron data raffinement øger data-til-parameter-forholdet og giver den fordel, at protein rygrad koordinater, der skal raffineres mod X-ray data, mens neutron diffraktion data bruges til at forfine placeringen af H / D atomer28. Dette er især nyttigt ved brug af delvist deutererede prøver, hvor densitetsannullering på grund af H-atomer på ikke-udskiftelige steder på proteinet er til stede. Selv om antallet af røntgenstrukturer langt overstiger antallet af neutronstrukturer deponeret i Protein Data Bank (FBF), softwarepakker oprindeligt designet til raffinement af røntgendata er blevet udvidet til at omfatte neutrondata samt3,29,30. Efter dataindsamling kan modeller raffineres ved hjælp af raffinementspakker som phenix.forfine, CNSsolve (nCNS) eller SHELXL28,31,32,33. Under raffinementsprocessen kan neutronspredningstæthedskort visualiseres til manuel montering ved hjælp af COOT34. Efter strukturløsning kan koordinaterne og neutron- og/eller røntgen diffraktionsdatafilerne indsendes til FBF, som validerer og deponerer modellen, hvilket gør den tilgængelig for offentlig adgang18,29,30.
Strukturel analyse af proteiner er en mangesidet tilgang, hvor mange teknikker bruges til at sondere deres funktion og mekanisme35. Neutronproteinkrystallografi giver værdifuld kemisk indsigt til at uddybe og supplere resultaterne fra yderligere undersøgelser såsom røntgen diffraktion, spektroskopi, nuklear magnetisk resonans (NMR) eller mikrokrystalelektron diffraktion (microED)36. Neutronprotein diffraktion er unikt positioneret til at give indsigt i enzymatiske mekanismer, da H-atomer er centrale for deres kemi. Fraværet af strålingsskader forårsaget af neutroner gør dem til en sonde, der er usædvanligt egnet til studiet af metalloproteiner37. Vi præsenterer her et repræsentativt eksempel på processen med neutronprotein diffraktion fra prøvepræparat til dataindsamling, raffinement og analyse (figur 1). Krystaller af tilstrækkelig størrelse til neutron diffraktionsforsøg er blevet dyrket af metalloproteinet Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D er et kobberholdigt metalloprotein, der er involveret i nedbrydningen af genstridig cellulose ved iltatomer ved indsættelse af glykogsidic bond38,39. NcLPMO9D's aktive sted indeholder et mononuklear kobbercenter inden for en karakteristisk "histidin-brace" bestående af N-terminal histidin og en anden bevaret histidin (supplerende figur 3)40. N-terminalen af svampe-LPMOs er methyleret, men den post-overgangsmodifikation forekommer ikke under rekombinant udtryk i gær. I NcLPMO9D hviletilstand er kobbercentret til stede i En Cu2+ oxidationstilstand og aktiveres ved enkelt elektronreduktion til Cu1+, hvilket gør det muligt for molekylær ilt at binde og aktiveres ved hurtigt at blive reduceret til en superoxidart41,42. Den samlede NcLPMO9D-reaktion kræver yderligere tilsætning af en elektron og to protoner for at danne det hydroxylerede polysaccharidprodukt43. Identiteten af de aktiverede iltarter, der er ansvarlige for indvinding af brintatomer (HAA) fra polysaccharidsubstratet, er ikke blevet identificeret, og der er i øjeblikket intensive strukturelle og beregningsmæssige undersøgelser i gang44,45. I betragtning af redox-kemien på NcLPMO9D's aktive sted er afhjælpning af strålingsskader særlig relevant. Vi illustrerer her rumtemperatur og kryotemperatur dataindsamling på NcLPMO9D krystaller til at bestemme NcLPMO9D struktur i hviletilstand og i aktiveret reduceret form, henholdsvis46. Der vil blive lagt vægt på protein krystal montering, beamline instrument setup for dataindsamling, udarbejdelse af data og koordinere filer og raffinement skridt er nødvendige for at modellere en all-atom neutron struktur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length</td>
			<td>DiaDent/DiaVet</td>
			<td>218-292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary wax</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.0.077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes (50mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td></td>
			<td>Version 0.8.9.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalCap ALS</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-Tip Forceps</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>TW-CTF-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, &#8805;99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>543047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide 99.9 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Thickness MicroLoops 1000 &#181;m</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M5-L18SP-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FiveEasy pH meter F20-Std-Kit</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30266626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam Dewars Standard Vessel 800 ml</td>
			<td>Spearlab</td>
			<td>M-FD-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four Color Mounting Clay</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (T),</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector</td>
			<td>Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris</td>
			<td>XtaLAB Synergy-R</td>
			<td>Home source X-ray diffractometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Wand Straight</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M-R-1013198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 &#8211; 20 &#181;L, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks &#215; 96 pcs.)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes volume 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z606340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.14-3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin Tong 18 mm</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M-R-1013196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 0.1-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 100-1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 10-100 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 20-200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR6-146</td>
			<td>Thin-walled capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Stereomicroscope System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>GB-B3-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round - Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>CV1012</td>
			<td>Thick-walled capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandwich Box with cover</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized 9 Well Glass Plate</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well)</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>XQ-P-24S-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>176788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 0.1 - 10 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 1 - 100 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 20 - 200 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 1 - 20 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax pen</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutron crystallography data collection and processing for modelling hydrogen atoms in protein structures

Neutronkrystallografi er en strukturel teknik, der gør det muligt at bestemmes hydrogenatotompositioner inden for biologiske makromolekyler, hvilket giver mekanistisk vigtige oplysninger om protonation og hydreringstilstande, mens de ikke fremkalder strålingsskader. X-ray diffraktion, derimod, giver kun begrænset information om placeringen af lysatomer og X-ray stråle hurtigt inducerer stråling skader af lysfølsomme cofaktorer og metalcentre. Præsenteret her er arbejdsgangen ansat til IMAGINE og MaNDi strålelinjer på Oak Ridge National Laboratory (ORNL) for at opnå en neutron diffraktion struktur, når en protein krystal af passende størrelse (> 0,1 mm3) er blevet dyrket. Vi demonstrerer montering af hydrogenerede proteinkrystaller i kvarts kapillærer til indsamling af neutron diffraktionsdata. Også præsenteret er damp udveksling proces af de monterede krystaller med D2O-holdige buffer for at sikre udskiftning af hydrogenatomer på udskiftelige steder med deuterium. Inkorporeringen af deuterium reducerer baggrunden som følge af den usammenhængende spredning af hydrogenatomer og forhindrer tæthedsreduktion forårsaget af deres negative sammenhængende spredningslængde. Prøvejustering og strategier for indsamling af rumtemperaturdata illustreres ved hjælp af kvasi-Laue dataindsamling hos IMAGINE at the High Flux Isotope Reactor (HFIR). Desuden demonstreres krystalmontering og hurtig frysning i flydende nitrogen til indsamling af kryodata for at fange labile reaktions mellemprodukter på MaNDi-flyvetidspunktets instrument ved Spallation Neutron Source (SNS). Forberedelse af modelkoordinat- og diffraktionsdatafiler og visualisering af SLD-kortene (neutronspredningslængdetætheden) vil også blive behandlet. Struktur raffinement mod neutrondata-only eller mod fælles X-ray / neutron data for at opnå en all-atom struktur af protein af interesse vil endelig blive drøftet. Processen med at bestemme en neutronstruktur vil blive demonstreret ved hjælp af krystaller af lytic polysaccharid monooxygenase Neurospora crassa LPMO9D, en kobberholdig metalloprotein involveret i nedbrydningen af genstridige polysaccharider via oxidativ kavalergang af den glykosidic obligation.

Watch this Scientific Journal Video about Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures at JoVE.com

Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures

Neutronproteinkrystallografi er en strukturel teknik, der tillader lokalisering af hydrogenatomer og derved giver vigtige mekanistiske detaljer om proteinfunktionen. Vi præsenterer her arbejdsgangen for montering af en proteinkrystal, neutron diffraktion dataindsamling, struktur raffinement og analyse af neutron spredning længde tæthed kort.

Neutron krystallografi Dataindsamling og behandling til modellering hydrogenatomer i proteinstrukturer

Neutron crystallography is a structural technique that allows determination of hydrogen atom positions within biological macromolecules, yielding ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analyserer Protein Dynamics hjælp af brint Exchange massespektrometri

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Supercritical Nitrogen Processing for the Purification of Reactive Porous Materials

Superkritisk Nitrogen Behandling til rensning af reaktive porøse materialer

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. ...

Functionalization of Single-walled Carbon Nanotubes with Thermo-reversible Block Copolymers and Characterization by Small-angle Neutron Scattering

Funktionalisering af Single-walled kulstofnanorør med Thermo-vendbare blokcopolymerer og karakterisering af Small-angle Neutron Scattering

We demonstrate a protocol for single-walled carbon nanotube functionalization using thermo-sensitive PEO-PPO-PEO triblock copolymers in an aqueous ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

X-ray af pulver i Conservation Science: Mod Rutinemæssig Krystalstrukturbestemmelse af korrosionsprodukter på Heritage Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Highly Stable, Functional Hairy Nanoparticles and Biopolymers from Wood Fibers: Towards Sustainable Nanotechnology

Meget Stabilt, Functional Behårede Nanopartikler og Biopolymerer fra træfibre: Mod bæredygtig Nanoteknologi

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntese af Protein biokonjugater<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimid Kemi

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Mikrofluid Chips for In Situ Crystal røntgen diffraktion og In Situ dynamisk lysspredning for serielle krystallografi

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Experimental Methods for Efficient Solar Hydrogen Production in Microgravity Environment

Eksperimentelle metoder til effektiv produktion af solenergi i Mikrogravitations miljø

Long-term space flights and cis-lunar research platforms require a sustainable and light life-support hardware which can be reliably employed outside the ...

Synthesis of Metal Nanoparticles Supported on Carbon Nanotube with Doped Co and N Atoms and its Catalytic Applications in Hydrogen Production

Syntese af metalnanopartikler understøttet på kulstofnanorør med doterede Co- og N-atomer og dets katalytiske anvendelser i hydrogenproduktion

A method for facile synthesis of nanostructured catalysts supported on carbon nanotubes with atomically dispersed cobalt and nitrogen dopant is presented ...

Hydrogen Production and Utilization in a Membrane Reactor

Brintproduktion og -udnyttelse i en membranreaktor

Industrial hydrogenation consumes ~11 Mt of fossil-derived H2 gas yearly. Our group invented a membrane reactor to bypass the need to use H2 gas for ...